באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד קומפלקסים של שרשרת מתפתחים או RNCs הקשורים לריבוזום SEC TED 70 s המיוצרים במהלך התרגום במערכת נטולת תאים במבחנה. זה מושג על ידי הכנסת רצף עצירה של SEC M באורך 17 חומצות אמינו לקצה הטרמינל C של הגן המעניין ושיבוטו במורד הזרם של מקדם השעתוק T 7. לאחר מכן, ה-mRNA מתומלל באמצעות תגובת שעתוק במבחנה ולאחר מכן מטוהר

לאחר מכן ה-mRNA המטוהר מתורגם במערכת תמצית S 30 E coli עם חומצות אמינו רדיואקטיביות כדי לסמן את החלבון המסונתז או הפוליפפטיד המתהווה. לבסוף, קומפלקסי השרשרת המתהווים הקשורים לריבוזום השני של Mr.Ed מבודדים על ידי סוכרוז, שיפוע, צנטריפוגה ופיצול. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כי שרשראות מתפתחות קשורות ביציבות לריבוזום של שנות ה-70 על ידי ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל של הפוליפפטידים המסומנים המבודדים משברי השיפוע.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שימוש ב-mRNA חסר קודון מלאי הוא בכך שהיא מבטיחה ביעילות גבוהה את ההצמדה של שרשרת פוליפפטיד מתהווה לריבוזום של 70 שניות במהלך התרגום ושלב הצנטריפוגה שלאחר מכן. בנוסף, בניגוד לטכנולוגיית קורדון ללא עצירה, ניתן להשתמש בשיטה זו ביעילות כמעט זהה הן במערכת in vitro והן במערכת in vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום קיפול חלבון טרנלציוני, כגון כמה מוקדם במהלך התרגום עשויים להיווצר מתווכי קיפול טרנלציוניים שונים ולעזור עוד יותר לנתח את המבנה שלהם באמצעות מבנה ישיר או עקיף.

גישות חקירה וקביעה טכניקה זו יכולה לעזור לנו לפענח את מסלול קיפול החלבון על הריבוזום. בפרוטוקול זה, תיארנו את הבידוד של שרשראות גבישי גבישיות באורך מלא של 70 שניות הקשורות לריבוזום. אך ניתן להשתמש בטכניקה זו לבידוד מחלת השונות של כמעט כל חלבון מעניין.

ניתן לאמץ אסטרטגיה זו גם כדי לבודד שרשראות פוליפפטיד נאטין קטומות של העור Es.בדרך כלל אדם חדש בשיטה זו עשוי להיאבק במהלך שלב הצנטריפוגה של שיפוע סוכרוז. עם זאת, עבור הניסיון הראשון, זו לא אמורה להיות בעיה. החלטנו להשתמש ברצף העצירה השני כדי לבודד פוליפפטידים גבישיים גבישיים הקשורים ל-70 כריבוזום לאחר ניסיונות ראשוניים ופחות מוצלחים שכללו שימוש ב-mRNA חסר קורדון עצירה.

הטכניקה המאוחרת יותר לא יכלה להבטיח את יציבותם של RNCs במהלך שלבי הצנטריפוגה הבאים באותה יעילות כמו הטכניקה הכרוכה בשימוש ברצף מעצר SECM. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהשלבים הכרוכים בהכנת שיפוע והפרדה של RNC עשויים להיות קשים ללמידה והיא דורשת רמה מסוימת של מומחיות כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור הדגמת היציבה תהיה סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי לבצע תמלול ותרגום במבחנה. התחל עם גן מעניין המשובט לכל פלסמיד מבוסס T 7 ו/או SP 6 כדי ליצור קומפלקסים של שרשרת מתפתחת ריבוזום או RNCs.

הרחב את מסוף C של הפוליפפטיד המטרה על ידי הוספת רצף השראת המעצר מ-M על מנת להבטיח ששבר הפוליפפטיד ייצא מהמנהרה הריבוזומלית. הוסף מקשר גמיש עשיר בגליצין בין החלבון לרצף מעצר SEC M כדי להתכונן לשעתוק במבחנה, אנזים הגבלת משתמש שיחתוך במורד הזרם של מסגרת הקריאה הפתוחה כדי ליניאריזציה של אלקטרופורזה של ג'ל AROS להפעלת התבנית DNA כדי לאמת עיכול מלא של הדגימה. לאחר אימות ריכוז ה-DNA האופטימלי, השתמש בערכת שעתוק בעלת תפוקה גבוהה בהתאם להוראות היצרן לסינתזה של RNA שליח.

השתמש במשקעי ליתיום כלוריד כדי לטהר את ה-mRNA. לאחר מכן הפעל דגימה על אקרילאמיד או ג'ל ארוס כדי לאמת את טוהרה. לתרגום במבחנה.

בעזרת מערכת אי קולי במים נטולי נוקלאז, הוסף תערובת חומצות אמינו מילי-מולרית אחת פחות מתיונין, 10 יחידות של מעכב ריבונוקלאז 20, מיקרו קורי של 35 s מתיונין, 20 מיקרוליטר של תערובת תגובה, 24 מיקרוליטר של מאגר בנייה מחדש ו-24 מיקרוליטר של אי קולי. ליזאט. מחממים את התגובה על ידי דגירה בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו 1-2 מיקרוגרם של mRNA ודגרו למשך 10 עד 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.

עצור את התגובה על ידי הנחתו על קרח כדי לבודד קומפלקסים של שרשרת מתפתחים הקשורים לריבוזום של 70 שניות או ncs. שכב את תגובת התרגום על גבי 4.5 מיליליטר של שיפוע סוכרוז של 5 עד 30% בערימות של 20 מילי-מולריות. אשלגן הידרוקסיד pH 7.5 מגנזיום 15 מילי-מולרי, 100 מילי-מולרי אשלגן אצטט וצנטריפוגת DTT מילי-מולרית אחת ב-41,000 סל"ד למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה, מפרקים את שיפוע הסוכרוז באמצעות מערכת שיפוע צפיפות ניתנת לתכנות וגלאי ספיגה מוגדר על 254 ננומטר.

אסוף את השברים המכילים ריבוזומים של 70 s לניתוח נוסף כדי לקבוע אם החלבון המורחב SEC M נשאר מחובר לריבוזום של 70 s. זרז את החלבון בכל שבר שיפוע על ידי הוספת חומצה טריכלורואצטית. דגרו את הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת, צנטריפוגות את הדגימות ב-14,000 פעמים G למשך 15 דקות כדי לגלול את החלבון, שטפו את הכדורים ביחס של ארבעה לאחד של אצטון לטריס מילי-מולרי אחד, HCL pH 7.6.

יבש את הכדורים באוויר ולאחר מכן השהה אותם מחדש במאגר טעינת דפי SDS. פתור את הדגימות לפי דף טריס טרייס SDS, ולאחר מכן תקן וייבש את הג'לים והכפיף אותם לרדיוגרפיה אוטומטית והדמיית פוספו כפי שמוצג כאן. בעקבות תרגום מבחנה, הריבוזומים 70 S בודדו על ידי סוכרוז, שיפוע, צנטריפוגה ופיצול כדי להבטיח שהחלבון הגבישי גמא B יישאר קשור ביציבות לריבוזום.

השברים המכילים 70 שניות אוגדו, הוחלפו במאגר מותפל ועברו סבב נוסף של צנטריפוגה בשיפוע סוכרוז. התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך ש-SEC M יכול לגרום ביעילות לעצירת תרגום של ה-RNCs הגבישיים של גמא B. לאחר המאסטר, טכניקה זו יכולה להיעשות ביום עבודה אחד למעט ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל של שרשרת מתהווה, הכוללת בדרך כלל שלב משקעים TCA בן לילה.

בעת ניסיון הליך זה, ברור שקריטי להימנע מזיהום RNA בכל שלב. זיהום RNS עלול להשפיע על יעילות התרגום של התמצית ולהוביל לשחרור פוליפפטיד מתהווה מהריבוזום ה-70. בעקבות הליך זה, ניתן להשיג NAST ופוליפפטידים של רפיון קבוע מראש הקשורים ביציבות לריבוזום ה-70 בהתאם למטרה הסופית.

ניתן להשתמש בקומפלקסים אלה למטרות שונות כמו קביעת אישור השרשראות המתפתחות הקשורות לריבוזום באמצעות גישות ישירות ועקיפות כמו NMR או fre, או גורם בדיקה וקשירת ליגנד לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המבנית וקיפול חלבונים לחקור את האישור של חלבונים באורך מלא הקשורים לריבוזום, כמו גם מתווכים לקיפול תרגומי cot. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ולבודד פוליפפטיד מתהווה, הקשור ביציבות לריבוזום של 70 שניות, אשר יכול לשמש עוד כדי לענות על שאלות שונות בתחום קיפול חלבון טרנלציוני.

אל תשכח שעבודה עם איזוטופים רדיואקטיביים וחומצות אמין מסומנות, כמו למשל מתיונין 35 דורש אמצעי זהירות מיוחדים ותמיד צריך לקחת בחשבון בעת ביצוע הליך זה.