שתי שיטות של גיבוש Heterokaryon לגלות גורמים הגבלת HCV

מטרת הליך זה היא לבחון את השפעתם של גורמי הגבלה על השלמת מחזור השכפול של נגיף ההפטיטיס C בקו תאים נתון, באמצעות שתי שיטות המסתמכות על היווצרות של heca. עבור השיטה הראשונה, התחילו בגידול תאי כבד אנושיים וכן תאי אריזה מסוג heal A ו-Hep 56 1D. לאחר מכן, בצעו טרנספקציה של נגיף ההפטיטיס C או HCV RNA לתאי הכבד באמצעות אלקטרופורציה. בהמשך, בצעו מיזוג של קו התאים המשכפלים HCV עם קו תאי האריזה המתאים באמצעות polyethylene glycol. בשיטת המיזוג השנייה, השלב הראשון הוא ייצור של מאגר HCV בריכוז גבוה.

לאחר מכן מבצעים תרבית משותפת (co-culture) של קווי תאים שונים, ומשרים היתוך תאים על ידי טרנספקציה של גליקופרוטאין של נגיף קצפי (foamy virus) פרוטוטיפי. לאחר מכן, מדביקים את ההטרוקריונים ב-HCV. בעקבות כל אחת מהשיטות ליצירת הטרוקריונים, מבוצעת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאשר את ההיתוך, וכמות החלקיקים הזיהומיים הנ produced נקבעת.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא שימושית לסריקה של פאנל רחב של שורות תאים ותאים ראשוניים לצורך זיהוי ביטוי של גורמי הגבלה דומיננטיים ספציפיים ל-HV. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח לגבי ספציפיות המינים והנורמות של HCV. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי להקל על הבנת המושגים הבסיסיים של שתי מערכות ההיתוך לפני השראת היתוך תאים באמצעות polyethylene glycol.

תאי HUH 7.5 עוברים טרנספקציה עם H-C-V-R-N-A לפי פרוטוקולים סטנדרטיים ומטופחים למשך 24 שעות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. ביום למחרת, קצרו את תאי HUH 7.5 שעברו טרנספקציה ונושאים את הרפליקון הסוב-גנומי, וכן את תאי האריזה heal R ו-he 56 1D. תאי אריזה אלה הונדסו כדי לבטא באופן אקטופי את חלבוני HCV: core, E1, E2, P7 ו-NS2. לאחר טריפסיזציה, השביחו מחדש את התאים במדיום DMEM מלא. דללו את תרחיפי התאים לריכוזים הבאים: תאי HUH 7.5 ל-5×10⁵ תאים למילליטר, ותאי heal ו-hep 56 1D ל-2×10⁵ תאים למילליטר.

בשלב הבא, הכינו פלטת תרבית בעלת שישה בארות עם שתיים עד שלוש כיסויות זכוכית סטריליות בכל בארה. לצורך ניתוח נוסף של יעילות ההיתוך, ערבבו 1 mL של תאי HUH 7.5 שעברו טרנספקציה עם 1 mL של תאי אריזה והעבירו לבארה אחת בפלטת שש הבארות; דגרו למשך 24 שעות ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר 24 שעות, בדקו את צפיפות התאים.

צפיפות התאים צריכה להיות בטווח של 60% עד 80% של שטח הפנים לפני השראת היתוך תאים, כדי שהתאים יהיו בקרבה הדוקה המאפשרת היתוך של ממברנות התאים. שאבו את המצע מהתאים בתרבית המשותפת ושטפו פעם אחת עם 1 mL של PBS. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות 500 µL של 40% polyethylene glycol או PEG 1,500 שחומם מראש. הוסיפו 500 µL של PBS לבאר נוספת של תאים בתרבית משותפת כביקורת. דגרו למשך חמש דקות ב-37 °C כדי להשרות היווצרות של hetero carion. שאבו את ה-PEG והוסיפו בזהירות 2 mL של PBS. לאחר דקה, שאבו את ה-PBS והוסיפו 2 mL של PBS טרי. שטפו עם PBS 3 עד 5 פעמים, למשך דקה לכל שטיפה, כדי להסיר PEG עודף.

לבסוף, הוסיפו שני מיליליטר של DMEM, מצע מלא, לכל באר והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 48 שעות. 48 שעות לאחר ההיתוך, אספו כל SNAT וסננו דרך מסנן של 0.45 micron. לאחר איסוף תרבית התאים, ניתן לקבוע את יעילות ההיתוך של ה-snat באמצעות אימונופלורסצנציה; שטפו את הבארה המכילה את כיסויי הזכוכית פעם אחת עם מיליליטר אחד של PBS למשך דקה אחת.

קבע את התאים עם 600 µL של 3% paraldehyde ב-PBS למשך 15 דקות. שטוף שלוש פעמים עם PBS למשך דקה אחת לכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, השתמש בפינצטה כדי להעביר בזהירות את כיסויי הזכוכית (cover slips) לצלחת עם 24 בארות. הפוך את התאים למאווררים בעזרת 500 µL של 0.5% Triton X 100 ב-PBS למשך חמש דקות.

לאחר מכן שטפו שלוש פעמים עם PBS והחילו 250 µL של תמיסת הנוגדן הראשוני לכל באער. השתמשו בנוגדן anti-NS5 בריכוז של 0.5 µg/mL ובנוגדן מונוקלונלי אנושי anti-E2 בריכוז של 6.4 ng/mL. דגרו למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר 45 דקות, שטפו שלוש פעמים עם PBS.

בשלב הבא, הוסף 250 µL של נוגדנים משניים לכל באר; השתמש בנוגדנים משניים מסוג goat anti-mouse או goat anti-human IgG ספציפיים המצומדים ל-Alexa Fluor 546 או Alexa Fluor 488 בריכוז של 2 µg/mL. הדגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר 30 דקות, שטוף פעם אחת עם PBS.

לאחר מכן, צבע את גרעיני התאים באמצעות 250 µL של DPI המדולל ביחס של 1:3000 ב-PBS. הדגר למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר בחושך, שטוף ארבע פעמים עם PBS ופעם אחת עם מים. לבסוף, הצמד את כיסויים הזכוכית (cover slips) בצורה הפוכה על טיפה של flora mount על שקופית מיקרוסקופ והשאר אותם להתייבש בחושך.

כדי להתחיל בהליך זה, קצרו והכינו תרחיפי תאים בודדים מהתאים הבאים: שורת תאי כבד אנושיים Luna NA החסרה ביטוי אנדוגני של CD 81, תאי אריזה He r ותאי Hep 56 1D המבטאים באופן יציב CD 81 אנושי. דגרו יחד תאי Luna n עם תאי he r ביחס של 1:1 ועם תאי Hep 56 1D HCD 81 ביחס של 1:2, כך שתתקבל צפיפות תאים כוללת של 1.5 × 10⁵ תאים ל-12.

יש להדגיר למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. למחרת, בצע טרנספקציה זמנית לתאים עם חלבון מעטפת PFE גנואי גבוה באמצעות Lipofectamine 2000 לפי הוראות היצרן. 30 שעות לאחר הטרנספקציה עם הגליקופרוטאין PFE, זרע את ההטרוקורנים עם 350 µL של מלאי נגיפי שהוכן מראש ב-MOI של כ-2.3.

דגרו למשך 12 שעות ב-37 °C וב-5% carbon dioxide למחרת בבוקר. שטפו פעם אחת עם PBS והוסיפו מילליטר אחד של מצע DMEM מלא לכל באר; דגרו למשך 48 שעות ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר 48 שעות, אספו את הסופּינאַנט (supinate) מתרבויות ההטרו-קריון וסננו אותו דרך מסנן של 0.45 micron. לאחר מכן, השתמשו בסופּינאַנט כדי להחדיר את התאים מסוג HUH 7.5 שנזרעו בלוחות 96 בארות ביום הקודם במסגרת בדיקת דילול מגבילה (limiting dilution assay). דגרו למשך 72 שעות לפני כימות ייצורם של חלקיקי צאצאים מדבקים.

יש להשלים את הפרוצדורה לוויזואליזציה של אירועי היתוך שש שעות לפני כן. שטפו פעם אחת תאי הידבקות בתרבית משותפת עם 5 mL של PBS ולאחר מכן הוסיפו 4 mL של תמיסת DI המתאימה לכל צלחת בקוטר 10 cm. דגרו את התאים למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. שטפו את התאים פעם אחת עם 5 mL של PBS למשך דקה אחת ולאחר מכן הוסיפו מצע DMEM מלא. דגרו למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide לפני הזריעה. הוסיפו מכסיות זכוכית (cover slip) לכל באער בלוח 12 הבאערים, לאחר מכן זרעו ובצעו טרנספקציה וצביעה של התאים כפי שהודגם קודם לכן. 30 שעות לאחר הטרנספקציה, שטפו את התאים בזהירות עם 1 mL של PBS למשך דקה אחת ולאחר מכן קבעו את התאים עם 250 µL של 3% paraldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

שטוף את התאים פעם אחת עם 1 mL של PBS למשך דקה אחת ולאחר מכן צבע עם dappy למשך דקה אחת; לאחר שטיפת התאים פעם אחת עם PBS ופעם אחת עם מים, הצמד זכוכיות כיסוי, משקפיים ושקופיות בגישה הראשונה לבדיקת השפעת גורמי הגבלה על השלמת מחזור השכפול של HCV. בתרביות הטרוגניות, תאי HUH 7.5 עברו תחילה טרנספקציה זמנית עם רפליקון סוב-גנומי המבטא טרנסגן של לוסיפרז וחלבונים לא-מבניים של HCV, ולאחר מכן תורגדו לתרבית משותפת והוחדרו לקווי תאים המבטאים חלבוני מבנה של HCV, את הליבה (core) וחלבונים עזר. תוצאה מייצגת מוצגת באיור זה; התאים עברו צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדנים מונוקלונליים נגד חלבון המבנה E2 ונגד החלבון הלא-מבני NS5A.

התמונות בלוחות העליונים מראות כי לאחר טיפול ב-PEG, אותות הן עבור MS five A והן עבור D two זוהו בו-זמנית באותו ציטופלזמה, מה שמעיד על התמזגות עצמית. בניגוד לכך, הלוחות התחתונים מראים כי כאשר תאים בתרבית משולבת טופלו ב-PBS, לא נגזרה התמזגות. לפיכך, לא נצפתה קולוקליזציה של אותות. כדי לכמת את הזיהומיות הוויראלית שנוצרה מ-hetero carons, נדגמו תאים מהתרביות המשולבות 48 שעות לאחר השראת ההתמזגות, והם שימשו להדבקת תאי HUH 7.5 נאיביים לצורך בדיקות לוסיפראז (luciferase) עוקבות.

בגרף זה מוצגים ערכי הממוצע של שלושה ניסויים עצמאיים. הפס האופקי האפור מייצג את הרקע של יחידות אור יחסיות או RLU שנקבעו בתאי HUH 7.5 שאינם נגועים. ראוי לציין כי כאשר תאי רפליקנט HUH 7.5 הותכו עם שורות תאים נאיביות או טופלו ב-PBS כביקורת, לא נגבת זיהומיות בנוזלי התרבית.

עם זאת, כאשר הושרה היתוך תאים בין שורת תאי הרפליקון HUH 7.5 לבין שורות תאי אריזה באמצעות PEG, שוחררו חלקיקים ויראליים זיהומיים אל תוך נוזלי התרבית. הדבר מעיד על כך שייצור הנגיף דורש היתוך תאים וביטוי של חלבונים ויראליים בשורות תאי האריזה; באופן בולט, לא רק הטרוקרונים של תאי קרצינומה של הכבד האנושי HUH 7.5, אלא גם הטרוקרונים עם תאי כבד אנושיים שאינם חיים ותאי כבד של עכבר אפשרו שחרור של נגיפים, מה שמעיד על כך שההרכבה והשחרור אינם מעוכבים באופן דומיננטי על ידי גורמי הגבלה אפשריים בסוגי תאים אלו. בגישה חלופית, היתוך תאים סומטיים הושרה על ידי ביטוי של גליקופרוטאין גני לאחר גידול התאים.

הטרו-קריונים (Hetero carons) הודגמו על ידי צביעה של קווי תאים נפרדים בצבעי מעקב לתאים (cell tracker dyes) לפני תרבית משותפת (co cultivation) והחדרה (transfection) של חלבוני הגנים; התאים קובעו ונצבעו ב-DPI 30 שעות לאחר ההחדרה, ותוצאה מייצגת מוצגת בדמות זו. מיזוג של שני סוגי תאים מסומן על ידי הטרו-קריון עם צבעים המפוזרים באופן הומוגני בתוך הציטופלזמה, כפי שמתואר כאן. לעומת זאת, התמונות בלוח התחתון מראות היעדר תאים עם ציטופלזמה בעלת צביעה כפולה, דבר המצביע על היעדר מיזוג תאים.

גרף זה, האחרון בסדרה, מראה כי כל גורמי הכניסה של HCV באים לידי ביטוי רק בתאי Luna N הנושאים גנים זרים (hetero carriers) יחד עם תאי hela או תאי Hep 56 1D המבטאים CD 81 אנושי. במקרה זה, התרביות הוחדרו בחלקיקי HCV זיהומיים. נוזלי התרבית נאספו לאחר 48 שעות, ושחרור חלקיקים דה-נובו (de novo) מהנושאי הגנים הזרים נקבע באמצעות בדיקת דילול מגבילה (limiting dilution assay) תוך שימוש בתאי מטרה HUH 7.5 נאיביים. מוצגים ערכים ממוצעים של שלושה ניסויים בלתי תלויים, והפס ההוריזונטלי האפור מייצג את סף הגילוי של הבדיקה.

כבקרה, תאי lunar N הוחלטו עם תאי lunar N, דבר שהוביל לרמות נמוכות מאוד של HCV זיהומי, הקרובות לסף הגילוי. תוצאות דומות התקבלו כאשר תאי lunar N הוחלטו עם תאי naive HEP 56 1D. בשני המקרים, human CD 81 היה חסר, ולכן HCV לא יכול היה להדביק את ההטרוגניזאטים באופן פרודוקטיבי.

לעומת זאת, נצפתה ייצור de novo של צאצאים נגיפיים זיהומיים בריכוז הגבוה פי עשרה בקירוב מרקע הבדיקה בתאי lunar 10 הממזגים heer ובתאי lunar hand הממוזגים עם תאי HEP 56 1D המבטאים CD 81 אנושי. דבר זה מעיד על כך ש-HCV השלים בהצלחה את מחזור השכפול שלו ב-RetroCars, ובכך שוללת אפשרות של ביטוי גורמי הגבלה דומיננטיים בקווי תאים אלו. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע את הפרוצדורה הניסויית המלאה תוך שבוע אחד, במידה והיא מבוצעת כהלכה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן יצירת hetero carryon לצורך זיהוי גורמי הגבלה אפשריים של HV. זכרו כי עבודה עם נגיף דלקת כבד C עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להקפיד תמיד על נקיטת אמצעי זהירות, כגון רמת בטיחות ביולוגית גבוהה, בעת ביצוע הליך זה.