Name: הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: למד הפקה וטיהור של וקטורים lentiviral לשימוש בתאי מערכת העצבים המרכזית. הפרוטוקול מדגים שיטות יעילות להעברת גנים לנוירונים ולאסטרוציטים תרבותיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המוח NIH תכנית אב Core מענק (p30 NS057105, BJS) כדי אוניברסיטת וושינגטון, תוכנית פרויקט גרנט NS032636 (BJS) ועל ידי מרכז התקווה הפרעות נוירולוגיות.

1. אריזות של וקטורים lentiviral וקטורים lentiviral המיוצרים על ידי cotransfection של וקטור העברת lentiviral ו פלסמידים אחרים הנדרשים האריזה לתוך התאים 293T בשיטה סידן פוספט transfection. אנו משתמשים 10 100 מ&quot;מ בתרבית רקמה מנות בפרוטוקול זה. זה יכול להיות scaled למעלה או למטה בהתאם יישומים. קו תא 293T נשמרים שונה Dulbecco של הנשרים בינוני (DMEM) עם גלוקוז גבוה (4,500 מ&quot;ג / ל &#39;), השלימו עם סרום 10% שור עוברית (FBS), 100 יחידות / מ&quot;ל ​​פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין ב 37 ° C חממה עם 5% CO 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293T זרעים תאים בכל מפגש 30-40% עד 10 100 מ&quot;מ תרבות מנות רקמות (3 x 10 6 תאים / צלחת) ב בינוני התרבות. להחזיר את התאים חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20-24 שעות תרבות, לבדוק את צפיפות התאים. התאים צריך להיות בערך 80% המפגש בזמן transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורית 50 מ&quot;ל. הוסף 4.4 מ&quot;ל TE79/10 (1 mM TrisHCl, 0.1 מ&quot;מEDTA, pH 7.9) פחות נפח כולל של DNA פלסמיד הבאה. להוסיף 100 מיקרוגרם העברת lentiviral פלסמיד (איור 1), 58 מיקרוגרם pMDLg / pRRE, 31 מיקרוגרם pCMV-G, 25 מיקרוגרם pRSV-Rev, 600 μl 2M CaCl 2. מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עוד צינור 50 מ&quot;ל. הוסף 5 מ&quot;ל 2x בהרוורד (0.05 HEPES M, 0.28 M NaCl, 1.5 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, pH 7.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את ה-DNA-CaCl 2 תערובת של 10 מ&quot;ל פיפטה ולהוסיף צינור המכיל 2 x בהרוורד, dropwise תוך vortexing צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תגובה משקעים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הכלים מן התרבות בחממה. מערבבים את התגובה משקעים היטב על ידי vortexing. הוסף 1 מ&quot;ל של השעיה על כל 100 מ&quot;מ המכילים תאים צלחת. ההשעיה יש להוסיף לאט, תוך dropwise בעדינות מתערבל בינוני בצלחת. להחזיר את הכלים ולעזוב את החממה H 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מתרבות. הוסף 6 מ&quot;ל תרבות טרי בינוני המכיל 6 נתרן mM butyrate על כל מאכל. להחזיר את התרבויות כדי חממה. לאחר לילה תרבות, אם יש כתב ניאון לבנות, לבדוק ביטוי גנים כתב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל, מעל 80% של התאים לבטא את הגן הכתב אם הוא מונע על ידי האמרגן נמצא בכל מקום (למשל האמרגן CMV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים (40-44 שעות) לאחר transfection, לאסוף supernatant מ -10 מנות לתוך צינורות 2 50 מ&quot;ל (כ - 30 מ&quot;ל כל הצינור). להקפיא את supernatant ב -80 ° C או במקפיא עבור לשלב הבא. </li></ol> 2. ריכוז וטיהור של הווקטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה אסף טרי או מופשר supernatant ב 900 גרם (כ סל&quot;ד 2000) במשך 10 דקות כדי להסיר כל פסולת תא supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק של 60 מ&quot;ל ל-מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק SFCA. העברת supernatant מהצינור 50 מ&quot;ל ל המזרק. סנן supernatant לתוך צינור צנטריפוגות polyallomer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו 5 מ&quot;ל סוכרוז 20% (שהוכנה PBS) בתוך פיפטה של ​​5 מ&quot;ל. להכניספיפטה אל החלק התחתון של הצינור צנטריפוגה המכילה supernatant. לאט לאט להוסיף את הפתרון סוכרוז תחת supernatant וקטור. חזור על שלבים אלה עבור supernatant מהצינור אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה supernatant ב 11000 סל&quot;ד ו - 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם הרוטור SW28 הנדנדה Beckman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. הוסף 150 μl לקטוז 4% (להכין PBS) על צינור כל צנטריפוגות. Resuspend את כדורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את וקטור מרוכז מכל צינורות צנטריפוגות כדי צינור 1.5 מ&quot;ל. השאירו את הצינור על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה על ידי וקטור pipetting. להסתובב עם microcentrifuge במלוא המהירות (כ 16000 ז) דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור 1.5 מ&quot;ל חדשה. מחלקים את המדגם הסופי ל -20 aliquots μl ומאחסנים אותם במקפיא -80 ° C. </li></ol> 3. טיטרציה של הווקטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 5 X 10 4 / היטב HT1080 תאים בצלחת 12-היטב בינוני 1 DMEM מ&quot;ל השלימו עם FBS 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר overnigתרבות HT, לספור תאים מאחד וציון מספר התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 5 פי דילול סדרתי (01:05, 1: 25, 1:125, 1:625 ו) של וקטור מרוכז עם המדיום לתרבות. הוסף אני μl של וקטור כל בדילול מלא לבארות נפרדים. דוגמאות ניתן לשכפל להגדיל את הדיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Polybrene (Hexadimethrine ברומיד) ב וקטור המכיל כל טוב, אל גם בלי וקטור. מערבבים בעדינות את ידי רועדת בצלחת. חזור אל חממה H 48. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מבארות תרבית תאים. לשטוף היטב עם כל PBS. הוסף 250 μl 1x trypsine-EDTA הפתרון התאים. כאשר תאים מנותקים (3-5 דקות), להוסיף 1 מ&quot;ל התרבות בינוני. Resuspend את התאים על ידי pipetting. להעביר את ההשעיה התא 1.5 צינורות צנטריפוגות מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת ב 900 גרם של 6 דקות. עבור וקטורים עם הגן כתב ניאון (למשל GFP), עבור לשלב 3.7 לניתוח FACS. עבור וקטורים ללא כתב, עבור לשלב 3.8 עבור QPCR בזמן אמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור וקטורים המכילים fluoהגן כתב rescent, הסר supernatant ו resuspend גלולה עם 300 μl של פורמלדהיד 3.7% ב PBS. לקבוע את אחוז התאים הכתב חיוביות בניתוח FACS. Titer יהיה מיוצג כיחידות התמרה למיליליטר מרוכזת וקטור (TU / ml). </li></ol><img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> לדוגמה, אם 1 x 10 5 תאים היה transduced עם μl 1/25 (0.04 μl) וקטור תאים 30% הם עיתונאי חיובי, titer יהיה: <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> השתמש רק דילולים נופלים במערכת יחסים לינארית בין אחוז התאים החיוביים כמות וקטור הוסיף לחשב titer. Titer הסופי צריך להיות הממוצע של המתקבלים titers transductions של לפחות 2 כמויות שונות של וקטור. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור וקטורים ללאהגן הכתב ניאון, לחלץ הדנ&quot;א הגנומי של HT1080 תאים באמצעות QIAamp DNA מיני קיט (Qiagen) לפי הפרוטוקול של היצרן. להגביר את רצף וקטור ב-DNA גנומי באמצעות ABI Prism 7000 זיהוי רצף System (Applied Biosystems) עם פריימרים (באזור ה-HIV-1 PBS / psi 17) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;ו 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;, ו TaqMan בדיקה 5 &quot;-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-טמרה-3&quot;. הגן אלבומין כי הוא גן עותק יחיד בגנום (2 עותקים / תא) היה מוגבר גם primers 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &quot;ו 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&quot;, ו החללית 5&#39;-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-טמרה-3 &quot;כמו שליטה פנימי. לקבוע את המספרים עותק של וקטור ואלבומין ידי PCR בצלחת 96-גם על פי הוראה של ייצור עם התוכנית הבאה: 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ו 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. פי עשרה דילולים סדרתי של פלסמידים של ריכוז ידוע (המיוצג כעותקמספר) המכיל את רצפי תבנית צריך גם להיות מוגבר כדי ליצור עקומת תקן כימות של דגימות לא ידועות. Titer יהיה מיוצג כיחידות אינטגרציה למיליליטר מרוכזת וקטור (IU / ml). </li></ol><img alt="המשוואה 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. התמרה של תרבויות הניאוקורטקס תרבויות הניאוקורטקס המכילים שני נוירונים גליה מוכנים מן הקורטקס העכבר באמצעות הליך דו שלבי ציפוי כפי שתואר קודם 18. Neocortices שהתקבלו בעכברים העובר על ההריון 14-16 ימים הם מצופה על monolayer גליה הקימה בעבר MEM השלימו עם 10% FBS, גלוקוז 20 מ&quot;מ ו 2 מ&quot;מ גלוטמין צלחת 24 גם בתרבית רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ימים במבחנה, מוסיפים 10 מיקרומטר ציטוסין arabinoside (ערה, ג) ב neocתרבות ortical לעכב שאינם העצבית חלוקת התא. המשך התרבות תאים של 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני התרבות חם 37 ° C אמבט מים למשך 5-10 דקות. החלף ערה-C המכיל בינוני עם בינוני תרבות טרי (500 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף וקטור עם הרצוי משרד הפנים (ריבוי של זיהום, היחס בין מספר החלקיקים וקטור למספר תאים היעד) לתרבות. המשך התרבות עבור H 24. אנו משתמשים משרד הפנים של 1-10 (בדרך כלל 5) בתרבויות קורטיקליים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עם התרבות בינוני טרי. המשך התרבות. אם יש גן הכתב מבנה וקטור, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 2 ימים לאחר התמרה. ביטוי גנים הכתב יהיה גלוי בנוירונים 2-7 לאחר התמרה, בהתאם לעיצוב וקטור והמנה בשימוש. </li></ol> 5. נציג תוצאות את titers של וקטורים lentiviral מיוצר עם מגוון זה פרוטוקול 8 10 -10 10 IU / mL, whicH מתאימים התמרה של מגוון רחב של סוגי תאים מתוך מערכת העצבים המרכזית הן במבחנה in vivo. טבלה 1, איור 2 מראה תוצאה נציג באמצעות וקטורים המיוצרים על ידי פרוטוקול זה. אנחנו transduced תרבויות שבמוח Murine עם וקטורים lentiviral המבטאים ירוק ניאון חלבון (GFP) הנשלטת על ידי היזם (SYN) synapsin או גליה fibrillary חומצי (GFAP) האמרגן חלבון. שבעה ימים לאחר התמרה, ביצענו immunostaining לנוירונים התווית לבין האסטרוציטים עם נוגדנים נגד NeuN ואנטי GFAP, בהתאמה. כפי שמוצג בטבלה 1, איור. 2 א, אחרי התמרה עם וקטור נושא את האמרגן synapsin, מעל 90% של נוירונים (תאים NeuN +) אקספרס GFP ולא האסטרוציטים (GFAP + תאים) להביע את הגן הזה כתב. כאשר היזם GFAP משמש מבנה וקטור (איור 2 ב), כ -80% האסטרוציטים (GFAP + תאים) הבעהשל ה-GFP, כל + תאים GFP הם האסטרוציטים כפי שאישרה colocalization עם GFAP והיעדר ביטוי GFP בתאים NeuN, שכותרתו. תוצאות אלו מראות כי וקטורים lentiviral יעילים מאוד כדי לספק transgenes לתאים של מערכת העצבים המרכזית של התא ספציפי ביטוי גנים יכולה להיות מושגת כאשר היזמים המתאימים משמשים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> באיור 1. ייצוג סכמטי של HIV מבוססות וקטורים lentiviral ואת פלסמידים אריזה. Provirus-1-HIV מוצג בחלק העליון. גורמים לייצור וקטור מופרדים לארבע פלסמידים שונים. העברת lentiviral הפלסמיד מכיל LTR היברידית &#39;5 שבו האזור U3 מוחלף ציטומגלווירוס (CMV) האמרגן, האות אריזה (ψ), רצף RRE, מערכת polypurine המרכזית (cPPT), הגן של עניין (לדוגמה: כתב ניאון) יחד עם האמרגן של בחירה, LTR &#39;3 שבורצפים רגולטוריים חבר העמים יוסרו לחלוטין מאזור U3. pMDLg / pRRE מכיל איסור פרסום וגנים pol ורצף RRE מ-HIV-1 בשליטת היזם CMV. pRSV-Rev מכיל את רצף הקידוד של Rev מונע על ידי האמרגן RSV. pCMV-G מכיל את הגן VSV-G חלבון בשליטת היזם CMV. הרשות מציינת את האות polyadenylation מן הגן β-גלובין האדם. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> איור 2. הביטוי של גנים הכתב בתרבות העכבר הניאוקורטקס מעורבת transduced עם וקטורים lentiviral שנשאו סוג ספציפי מקדמי סלולריים. התרבויות היו transduced עם LV-SYN-GFP () או LV-GFAP-GFP וקטורים (ב) משרד הפנים של 5. שבעה ימים לאחר התמרה, התאים היו immunostained עם נוגדנים נגד NeuN או נגד GFAP. לוחות העליונות להראות GFP הקרינה, לוחות הביניים מראים immunostaining לוחות נמוכות מתמזגים תמונות (GFP: ירוק NeuN או GFAP: אדום). </p&gt; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> וקטור </td><td> GFP + תאים נוירונים </td><td> GFP + ב האסטרוציטים </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92.2 ± 7.3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78.3 ± 11.5 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. השוואה בין ביטוי של GFP בתרבויות שבמוח Murine transduced עם וקטורים lentiviral נושאים שונים כמה יזמים. תרבויות כמה שבמוח Murine (5 X 10 5/24 טוב גם צלחת) היו transduced עם LV-SYN-GFP או LV-GFAP-GFP על משרד הפנים 5. שבעה ימים לאחר התמרה, תרבויות קובעו immunostained עבור NeuN או GFAP. מספר התאים ה-GFP ו NeuN / GFAP המבטאים נמנו תמונות 10 שדות בכל תנאי הניסוי. הערכים מייצגים את האחוז של נוירונים (תאים NeuN +) אוהאסטרוציטים (GFAP + תאים), אשר הביע את הגן כתב ה-GFP. הערכים המוצגים הם ממוצעים ± סטיית תקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים.

<ol><li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).</li>
<li>Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-promoter+lentiviral+vectors+for+constitutive+and+regulated+gene+expression+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).</li>
<li>Hioki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transduction+of+neurons+by+lentivirus+with+enhanced+neuron-specific+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters.</a> Gene Ther. 14, 872-882 (2007).</li>
<li>Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+promoter+usage+for+lentiviral+vector-mediated+transduction+of+cultured+central+nervous+system+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells.</a> J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).</li>
<li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfer%2C+integration%2C+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li>
<li>Blomer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).</li>
<li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).</li>
<li>Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transgene+expression+in+rat+brain+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors.</a> J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).</li>
<li>Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-activator+gene+of+human+T-lymphotropic+virus+type+III+%28HTLV-III%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III).</a> Science. 229, 69-73 (1985).</li>
<li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+immunodeficiency+virus+type-1+central+DNA+flap+is+a+crucial+determinant+for+lentiviral+vector+nuclear+import+and+gene+transduction+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 96, 4103-4110 (2000).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).</li>
<li>Farson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new-generation+stable+inducible+packaging+cell+line+for+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).</li>
<li>Broussau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499(2009).</li>
<li>Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titering+lentiviral+vectors%3A+comparison+of+DNA%2C+RNA+and+marker+expression+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods.</a> Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).</li>
<li>Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+heat+stress+reduces+excitotoxic+and+apoptotic+components+of+oxygen-glucose+deprivation-induced+neuronal+death+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro.</a> J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).</li>
<li>Mazarakis, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+glycoprotein+pseudotyping+of+lentiviral+vectors+enables+retrograde+axonal+transport+and+access+to+the+nervous+system+after+peripheral+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery.</a> Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).</li>
<li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+gene+transfer+through+retrograde+transport+of+lentiviral+vector+pseudotyped+with+a+novel+type+of+fusion+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).</li>
<li>Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li>
<li>Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+production+and+concentration+of+HIV-1-based+lentiviral+vectors+using+HYPERFlask+vessels+and+anion+exchange+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography.</a> BMC Biotechnol. 9, 10(2009).</li>
<li>Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+butyrate+stimulation+of+HIV-1+gene+expression%3A+a+novel+mechanism+of+induction+independent+of+NF-kappa+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr+Hum+Retrovirol%22%5BJournal%5D)">Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B.</a> J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).</li>
<li>Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+efficient+production+and+transduction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors.</a> J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).</li>
<li>Palsson, B., Andreadis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physico-chemical+factors+that+govern+retrovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer.</a> Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).</li>
<li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-Protein+Signaling-10+Negatively+Regulates+NF-%7Bkappa%7DB+in+Microglia+and+Neuroprotects+Dopaminergic+Neurons+in+Hemiparkinsonian+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats.</a> J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).</li>
<li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoters+and+serotypes%3A+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

בפרוטוקול זה, הראינו את הייצור של וקטורים lentiviral ויישום של וקטורים אלה בתרבויות המוח. הראינו יעיל תא סוג ספציפי התמרה עם וקטורים המיוצרים בשיטות אלה. כאשר היזם synapsin משמש, ביטוי של GFP הוא בהחלט נוירון מסוים. כאשר היזם GFAP משמש, ביטוי של GFP הוא אך ורק האסטרוציטים. אם לא ביטוי סוג ספציפי התא נדרש, האמרגן בכל מקום ניתן להשתמש. מצאנו גם ubiqutin ו קינאז phosphoglycerate (PGK) מקדמי יכול לנהוג ביטוי גבוהה רמת גן בתרבויות שבמוח 6. ביטוי גנים מונע על ידי וקטורים lent...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CM </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimethrine ברומיד (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> 293T תאים </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> HT1080 תאים </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> פלקון 100 x 20 מ&quot;מ רקמת תרבותה מנה </td><td> BD Biosciences </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 1 x 3 ½ בצינור צנטריפוגות polyallomoer </td><td> Beckman Coulter- </td><td> 326823 </td></tr><tr><td> 0.2 מיקרון המסנן המזרק </td><td> קורנינג </td><td> 431219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA מיני קיט </td><td> Qiagen </td><td> 51304 </td></tr></tbody></table>

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים transducing ממערכת העצבים המרכזית

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

העברה יעילה של גנים למערכת העצבים המרכזית (CNS) היא חשובה לחקר תפקודי גנים, למידול מחלות נוירולוגיות ולפיתוח גישות טיפוליות. וקטורים לנטיביריים הם כלים אטרקטיביים להחדרה (transduction) של נוירונים וסוגי תאים אחרים ב-CNS, מכיוון שהם מחדירים גנים הן לתאים המתחלקים והן לתאים שאינם מתחלקים, תומכים בביטוי מתמשך של טראנסגנים, ובעלי קיבולת אריזה גדולה יחסית ורעילות נמוכה 1-3. וקטורים לנטיביריים שימשו בהצלחה להחדרה של סוגי תאי עצב רבים in vitro 4-6 ובבעלי חיים 7-10.
נעשו מאמצים ניכרים לפיתוח וקטורים לנטיביריאליים עם בטיחות ביולוגית ויעילות משופרות להעברת גנים. וקטורים לנטיביריאליים מהדור השלישי הנוכחי, אשר הם חסרי יכולת שכפול ועצמיים-מבטלים (SIN), מוצגים ב-איור 1. האלמנטים הנדרשים לאריזת הווקטור מחולקים לארבעה פלסמידים. בפלסמיד ההעברה הלנטיביריאלי, אזור ה-U3 ב-5' long terminal repeat (LTR) מוחלף בפרומוטר חזק מנגיף אחר. שינוי זה מאפשר שעתוק של רצף הווקטור ללא תלות בחלבון HIV-1 Tat, הנדרש בדרך כלל לביטוי גנים של HIV 11. סימון האריזה (Ψ) חיוני לתהליך ה-encapsidation, והאלמנט התגובתי ל-Rev‏ (RRE) נדרש להפקת וקטורים בטיטר גבוה. ה-central polypurine tract (cPPT) חשוב ליבוא גרעיני של DNA הווקטור, תכונה הנדרשת להעברה (transducing) של תאים שאינם מתחלקים 12. ב-3' LTR, הרצפים בעלי הבקרה ה-cis הוסרו לחלוטין מאזור ה-U3. מחיקה זו מועתקת ל-5' LTR לאחר שעתוק הפוך, מה שמוביל להשבתה שעתוקית של שני ה-LTRs. פלסמיד pMDLg/pRRE מכיל את הגנים HIV-1 gag/pol, המספקים חלבונים מבניים וטרנסקריפטאז הפוך. pRSV-Rev מקודד ל-Rev, הנקשר ל-RRE לצורך ייצוא יעיל של RNA מהגרעין. pCMV-G מקודד לגלייקופרוטאין של נגיף הסטומטיס הוסיקולרי (VSV-G), המחליף את HIV-1 Env. VSV-G מרחיב את הטרופיזם של הווקטורים ומאפשר ריכוז באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה 13. כל הגנים המקודדים לחלבונים עזריים, כולל Vif, Vpr, Vpu ו-Nef, מושמטים ממערכת האריזה. ייצור ומניפולציה של וקטורים לנטיביריאליים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ה-NIH למחקר הכולל DNA רקומביננטי (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). ייתכן שיידרש אישור מוועדה מוסדית לבטיחות ביולוגית וכימית לפני שימוש בווקטורים לנטיביריאליים. וקטורים לנטיביריאליים מופקים בדרך כלל על ידי קוטרנספקציה של תאי 293T עם פלסמיד העברה לנטיביריאלי ופלסמידי עזר המקודדים לחלבונים הדרושים לאריזת הווקטור. ניתן להשיג פלסמידי העברה לנטיביריאליים ופלסמידי עזר רבים מ-Addgene, מאגר פלסמידים ללא מטרות רווח (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). פותחו מספר שורות תאי אריזה יציבות, אך מערכות אלו מספקות גמישות נמוכה יותר ויעילות האריזה שלהן יורדת בדרך כלל עם הזמן 14, 15. ערכות טרנספקציה זמינות מסחרית עשויות לתמוך ביעילות טרנספקציה גבוהה 16, אך הן עלולות להיות יקרות מאוד עבור הכנות של וקטורים בקנה מידה גדול. שיטות של שיקיעה בסידן פוספט מספקות טרנספקציה יעילה ביותר של תאי 293T, ולכן מהוות גישה אמינה וכלכלית לייצור וקטורים לנטיביריאליים.
בפרוטוקול זה, אנו מייצרים וקטורים לנטיביריים באמצעות טרנספקציה משותפת של תאי 293T עם ארבעה פלסמידים המבוססת על עיקרון שיקיעת סידן פוספט, ולאחר מכן ביצוע טיהור וריכוז באמצעות אולטרסנטריפוגציה דרך כרית סוכרוז 20%. טיטרי הוקטורים נקבעים באמצעות ניתוח מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) או באמצעות qPCR בזמן אמת. הייצור והטיטרציה של וקטורים לנטיביריים בפרוטוקול זה יכולים להסתיים תוך 9 ימים. אנו מספקים דוגמה להחדרה (טרנסדוקציה) של וקטורים אלה לתרביות של נאוקורטקס עכברי המכילות הן נוירונים והן אסטרוציטים. אנו מדגימים כי וקטורים לנטיביריים תומכים ביעילות גבוהה של טרנסדוקציה וביטוי גנים ספציפי לסוג התא בתרביות ראשוניות של תאים ממערכת העצבים המרכזית (CNS).

בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים אחרים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em&gt;.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

העברה יעילה של גנים למערכת העצבים המרכזית (CNS) היא חשובה בחקר תפקודי גנים, במידול של מחלות נוירולוגיות ובפיתוח...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר וקטורים לנטיוויריים להחדרת טרנסגנים לתאים ממערכת העצבים המרכזית. הדבר משיג על ידי טרנספקציה משותפת של פלסמידי העברה לנטיוויריים יחד עם פלסמידי עזר לתאי 293T, תוך שימוש בעקרון השקיעה של סידן פוספט. השלב השני של הפרוצדורה הוא ניקוי וריכוז של עליון הווקטור באמצעות אולטרסנטריפוגציה דרך כרית סוכרוז 20%.השלב השלישי הוא קביעת הטרה (titer) של הווקטור באמצעות אנליזת fax או PCR כמותי בזמן אמת. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא טרנסדוקציה של הווקטור לתאי מטרה. לבסוף, ניתן להדגים את יעילות הטרנסדוקציה ואת הספציפיות לסוג התא באמצעות צביעה אימונו-היסטוכימית של תאי המטרה המבטאים את הגן המעובר (transgene).היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון שימוש בערכות מסחריות, הוא שהיא מספקת גישה חסכונית, יעילה ואמינה להפקה של וקטורים לנטיוויריאליים. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי העברת טרנסגנים לתאי מערכת העצבים המרכזית (CNS). ניתן להחיל אותה גם על סוגי תאים אחרים in vivo ו-in vitro. וקטורים לנטיוויריאליים מופקים על ידי טרנספקציה משותפת של פלסמידים לתאי 293T.יש לתחזק את השורה של תאי 2 9 3 T ב-DMEM משופר עבור ניסוי זה. זרע עשרה מclazzות תרבית של מאה מילימטר עם תאי 2 9 3 T בצפיפות של 30% עד 40%. לאחר 20 עד 24 שעות של תרבית, התאים צריכים להגיע לכ-80% צפיפות ולכן להיות מוכנים לטרנספקציה.עבור טרנספקציה, הוסיפו את כל הפלסמידים הדרושים למבחנה של 50 מיליליטר ומלאו את המבחנה עד לנפח של 4.4 מיליליטר באמצעות TE 7 9 10. לאחר מכן, הוסיפו 0.6 מיליליטר של סידן כלוריד בריכוז שני מולרי וערבבו בעדינות. הכינו מבחנה נוספת של 50 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של 2 XHBS. הוסיפו את תערובת הפלסמיד והסידן כלוריד ל-HBS בטיפות תוך כדי ערבוב במכשיר וורטקס.כעת, במהלך 30 הדקות הבאות, המתינו להיווצרות משקוע בטמפרטורת החדר. הוציאו את צלחות התרבית מהאינקובטור ולאחר שהמשקוע נוצר, השביה אותו. באמצעות וורטקס (vortex), הוסיפו טיפה אחר טיפה מיליליטר אחד של התרחיף לכל צלחת.בעודכם מסובבים בעדינות את המצע בתוך הצלחת. נערו את המבחנה קצרה לפני העברת התליה לצלחת הבאה. החזירו את הצלחות הטעונות לאינקובטור.הניחו לפלסמידים לבצע טרנספקציה לתאים במשך חמש שעות. לאחר חמש שעות, החליפו את המצע ב-6 milliliters של מצע המכיל 6 millimolar Sodium butyrate.לאחר מכן, החזיר את התרביות לאנקובטור למחרת. אם נעשה שימוש במדווח פלואורסצנטי בעל ביטוי אוניברסלי, בדוק את ביטויו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל, למעל 80% מהתאים יש ביטוי של הגן המדווח.יומיים לאחר התעתוק (transfection), אספו את ה-SANE מהצלחות לשתי מבחנות בנפח 50 milliliter, דבר שצריך להביא לכ-30 milliliters למבחנה. בשלב זה, ניתן לאחסן את העילאי (supernatant) בטמפרטורה של מינוס 80 degrees Celsius לפני ההמשך. התחילו בצנטריפוגציה של העילאי שנאסף מצלחות התעתוק כדי להסיר שאריות תאים.בינתיים, חברו מזרק בנפח 60 milliliter למסנן מזרק SFCA של 0.2 micron. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למזרק. לאחר מכן, דחפו את הבוכנה כדי לסנן את הנוזל העליון לתוך מבחנה פולימרית לצנטריפוגה בנפח 38 milliliter המתאימה לרוטור נתיב (swing rotor).כעת טענו פיפט של 5 ml עם 5 ml של 20% sucrose ב-PBS. הכניסו את הפיפט לתחתית מבחנת הצנטריפוגה המכילה את העלייה (supernatant), והוסיפו לאט את תמיסת הסוכרוז מתחת לעלייה של הווקטור. כעת סובבו את ה-SNAT במשך ארבע שעות ב-Beckman SW 28. מיד לאחר הסבוב, שפכו והשליכו את העלייה, ותלו את המשקע המכיל את הווקטור ב-150 µl של 4% lactose ב-PBS. אספו את כל התליים לשפופרת אחת של 1.5 ml והניחו להם להתקרר במשך 15 דקות על קרח.בשלב הבא, ערבב את התמיה על ידי פיפטינג, ולאחר מכן סבב אותה במיקרו-צנטריפוגה במהירות מרבית למשך דקה אחת, העבר את העילוי למבחנה נקייה של 1.5 milliliter וחלק את הווקטור המרוכז לאליקוואוטים של 20 µL לאחסון בטמפרטורה של 80- °C. כדי לתתר the vector, זרע תחילה תאי HT 1080 לפלטה בעלת 12 בארות עם 1 milliliter של DMEM מועשר בכל בארה. לאחר תרבית לילה, ספור את התאים מבארה אחת וקבע את מספר התאים.כעת, הכינו סדרת דילול טורית פי חמישה של הווקטור המרוכז לתוך מצע גידול. לאחר מכן, הוסיפו מיקליטר אחד של כל ווקטור מדולל לבאר נפרדת; ניתן לשכפל את הדגימות, אך השאירו לפחות באר אחת ללא ווקטור כביקורת שלילית. השלב הבא הוא הוספת מיקליטר אחד של poly brain לכל באר וערבוב הפלטה באמצעות ניעור עדין.החזירו את הפלטה לאינקובטור למשך 48 שעות. לאחר יומיים, הסירו את המצע מכל באער ושטפו את התאים ב-PPS. לאחר מכן, בצעו טריפסינזציה לתאים והשביו אותם במיליליטר אחד של מצע תרבית באמצעות פיפטינג; העבירו את תרחיפי התאים למבחנות של 1.5 מיליליטר וסובבו אותם בצנטריפוגה כדי לאסוף את משקעי התאים.אם הווקטורים מכילים גן דווח פלואורסצנטי, השביה את המשקע ב-300 µL של 3.7% formaldehyde ב-PBS, ולאחר מכן קבע את אחוז התאים החיוביים באמצעות ניתוח fax וחשב את הטיטר. אם לא נעשה שימוש בגן דווח פלואורסצנטי, חלץ את ה-DNA הגנומי מהתאים באמצעות ערכה זמינה מסחרית. לאחר מכן, הגבר את רצף הווקטור באמצעות real-time PCR.צרו עקומת סטנדרט על ידי הגברה של רצף התבנית מפלסמיד בעל מספר עותקים ידוע בסדרת דילול של פי עשרה. לאחר מכן, חשבו את הטיטר כיחידות אינטגרציה למיליליטר. הכינו תרביות נויקורטיקליות המכילות נוירונים וגליה מקליפות מוח של עכבר, תוך שימוש בפרוצדורה בת שני שלבים שתוארה בעבר, בצלחת תרבית רקמות בעלת 24 בארות ב-MEM מועשר, לאחר חמישה ימים.בביצוע in vitro, הוסיפו 10 µM של RSC כדי לעכב חלוקה של תאים שאינם נוירונליים. לאחר מכן, המשיכו את התרבית למשך יומיים, תוך הקפדה למנוע התייבשות של התאים במהלך החלפת המצעים. לאחר יומיים, החליפו את המצע המכיל RC בחצי מיליליטר של מצע טרי וחם.לאחר מכן, הוסיפו לתרבית את הווקטור ב-MOI הרצוי והמשיכו בתרבית התאים למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, החליפו את המצע, ולאחר 48 שעות, במידה וישנו גן דגל (reporter), בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה; ביטוי הגן הדגל אמור להיות נראה בנוירונים שניים עד שבעה ימים לאחר הטרנספקציה. בהתאם לעיצוב הווקטור, טיטרי המינון של ווקטורים לנטיביריריים המיוצרים באמצעות פרוטוקול זה נעים בין 10⁸ ל-10¹⁰.יחידות אינטגרציה למיליליטר, המתאימות לטרנסדוקציה in vitro או in vivo של תאי CNS רבים. לפיכך, תרביות של נאוקורטקס של עכברים טרנסדוקציה באמצעות וקטורים לנטיוויראליים המבטאים GFP תחת בקרה של פרומוטר synapsin או פרומוטר A-G-F-A-P. שבעה ימים לאחר הטרנסדוקציה בוצעו בדיקות אימונוהיסטוכימיה בוקטור הנושא את פרומוטר ה-synapsin.מעל 90% מהנוירונים שזוהו כתאים חיוביים ל-NeuN ביטאו GFP, בעוד ששום אסטרוציט שזוהה כתא חיובי ל-GFAP לא ביטא זאת. הגן המדווח בתאים שהועברו וקטורים המכילים פרומוטור של GFAP. כ-80% מהאסטרוציטים ביטאו GFP, אך אף אחד מהנוירונים החדשים והמסומנים לא ביטא GFP.תוצאות אלו מדגימות כי וקטורים לנטיביריים יעילים מאוד בהחדרת טרנסגנים לתאי מערכת העצבים המרכזית (CNS). יתרה מכך, ניתן להשיג ביטוי גני ספציפי לתאים כאשר נעשה שימוש בפרומוטורים מתאימים. וקטורים לנטיביריים נמצאים בשימוש נרחב לביטוי יתר (overexpressing) ולהשתקה (knocking down) של גנים רלוונטיים במערכת העצבים המרכזית.הפרוטוקול שלנו עשוי להועיל לחוקרים אחרים המעוניינים להשתמש בשיטות אלו במעבדותיהם.

production-lentiviral-vectors-for-transducing-cells-from-central

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כדי להפוך את lentiviruses, וקטורים DNA הם transfected 293 לתוך תאים אנושיים. לאחר הקציר ריכוז supernatant, titer וירוס נקבעת על ידי ביטוי פלואורסצנציה עם cytometer זרימה.

Lentivirus הפקה

דרכי הביטוי lentiviral הם כלי הרכב היעיל ביותר עבור ביציבות להביע מפעיל מולקולות שונות או ובונה הכתב בחלוקת ולא חלוקת בתאי יונקים ואורגניזמים שלמים. כאן אנו מספקים פרוטוקול על איך לארוז בונה ביטוי lentivector בחלקיקי pseudoviral וכדי transduce תאים היעד באמצעות חלקיקים pseudoviral.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.

שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המציעים בסיס גמיש ואסטרטגי למניפולציה ויראלית של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים כדי לבטא יתר על המידה חלבונים מעניינים על מנת לחקור באופן ספציפי את תפקידם באוליגודנדרוציטים באמצעות מודל מבחנה של מיאלינציה של מערכת העצבים המרכזית.

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל במבחנה מבחני myelination

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשיג שילוב יציב הגן עניין הגנום האנושי על ידי המערכת היפהפייה הנרדמת transcriptionally מוסדרים. הכנת השילוב של וקטורים lentiviral פגומים, התמרה של במבחנה חושית של תאים אנושיים ואת וזמינותו המולקולרית בתאי transduced מדווחים.

שיטת טרנספוזיציה יעיל במבחנה על-ידי מערכת יופי ישן Transcriptionally מוסדרים הארוזים לתוך וקטור Lentiviral פגומים אינטגרציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.

Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)

אנו מדגימים פרוטוקול שלב אחר שלב לחקר תפקוד גנים במקרופאגים שוכנים ברקמת הצפק in vivo, באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים.

הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

למד הפקה וטיהור של וקטורים lentiviral לשימוש בתאי מערכת העצבים המרכזית. הפרוטוקול מדגים שיטות יעילות להעברת גנים לנוירונים ולאסטרוציטים תרבותיים.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

גלה סרטונים נוספים