מודל עכבר של MCAO intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים Cresyl

המטרה הכללית של הליך זה היא לדמות שבץ איסכמי בעכברים. ראשית, העורק הקרוטיד המשותף נקשר באופן זמני, בעוד שהעורק הקרוטיד החיצוני נקשר באופן קבוע רחוק ככל האפשר מהמקור. תפר זמני נוסף, המהודק מעט, ממוקם על ה-ECA מעל הפיצול.

השלב השני הוא קליב של העורק הקרוטידי הפנימי באמצעות פינצטה בעלת פעולה הפוכה כדי למנוע דימום. לאחר מכן, יש לחתוך את ה-ECA בין הליגטורה הקבועה לזמנית. בשלב הבא, מוחדר למסלול ה-ECA סיב מונופילמנטי מצופה סיליקון.

לאחר מכן הופכים את ה-ECA כדי להחדיר את המונילמנט אל ה-ICA עד שזה יכלול את בסיס העורק המוחי האמצעי. שעה לאחר מכן, מחזירים את זרימת הדם על ידי הסרת המונילמנט כדי לדמות את השחזור של זרימת הדם לאחר ליסיס של קריש תרומבואמבולי בבני אדם. לבסוף, ניתן להעריך את הגירעון הנוירולוגי, המשקף את הצלחת ה-T-M-C-A-O ואת חומרת האינפקט, מיד לאחר הפרפוזיה ובזמנים שונים לאחר הפרפוזיה.

תוכנת Cyan image מ-NIH משמשת לחישוב נפח השבץ (infarct volume) בחתכי מוח מייצגים שנצבעו ב-cresyl Violet. אחד היתרונות המרכזיים של חסימה זמנית של העורק המוחי האמצעי באמצעות טכניקת הפילמנט התוך-לומינלי הוא שהיא מדמה שבץ איסכמי במטופלים, עם השבת זרימת הדם, ופיתוח פרוצדורה זו בעכברים מאפשר שימוש בכלי גנטיים מסומנים כדי לזהות את התפקיד של חלבון מטרה. בחסימה זמנית של העורק המוחי האמצעי לשבץ, הפעולה מבוצעת בעכברים זכרים מסוג C57BL/6 בני חודשיים עד שלושה, השוקלים בין 22 ל-28 גרמים.

פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת הביו-אתיקה של IRCM כדי להגביר את השחזוריות של נפח השבץ (infarct volume). אנו משתמשים במונופילמנט בעל ציפוי סיליקון 6H, באורך 12 מילימטרים, הניתן לשימוש חוזר, מחברת Doco Corporation. שעתיים לפני הניתוח.

הזריק לעכבר באופן תו-פריטוניאלי (intraperitoneal) בופרנורפין במינון של 0.03 milligrams per kilogram. כדי להתחיל את הפרוצדורה, הרדם את העכברים ב-5% isof fluorine ושמור על ההרדמה בריכוז של 2.5% ISO fluorine. השתמש במשטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה של העכבר במהלך הניתוח, וחטא את עור העכבר ב-70% ethanol או ב-Betadine. לאחר מכן, בצע חתך בקו האמצע בצוואר והרחק את הרקמות הרכות תחת מיקרוסקופ סטריאו.

בצעו דיסקציה לא עדינה (blunt dissection) של צוואר העכבר כדי לחשוף את הקנה. לאחר מכן, הזיזו את השרירים כדי לאתר את העורקי העשלה (carotid artery). הפרדו בזהירות את העורקי העשלה המשותף השמאלי מהרקמות שסביבו.

מקמו תפר משי זמני בדרגת 5-0, חתוך למקטעים של 20 millimeter, מסביב לעורק. היזהרו לא לפגוע בעצב הוואגוס. לאחר מכן, הפרידו בין הפיצול של העורק הקרוטיד הפנימי השמאלי (ICA) לבין העורק הקרוטיד החיצוני (ECA), ומקמו תפר קבוע מסביב ל-ECA רחוק ככל האפשר מהמרכז (דיסטלית).

ותפר זמני נוסף על ה-ECA מעל הפיצול. לאחר מכן, סגרו את ה-ICA השמאלי באמצעות פינצטה עם פעולה הפוכה כדי למנוע דימום. שוב, היזהרו מאוד לא לפגוע בעצב הוואגוס.

בצעו חור קטן ב-ECA לפני ההסתעפות ל-ECA ול-ICA ובין התפרים הקבועים והזמניים שהוצבו קודם לכן. לאחר מכן, הכניסו תפר מונופילמנט מצופה סיליקון במידה של 12 מילימטר ובעובי 6-0 לתוך ה-ECA, חתכו את ה-ECA באופן מלא והעבירו את המונופילמנט לתוך ה-ICA. קשרו את התפר בחוזקה כדי למנוע דימום והוציאו את הפינצטה בעלת פעולת ההיפוך.

לאחר מכן, הכניסו את המונילמנט למעגל ויליס עד שהמונילמנט חוסם את בסיס ה-MCA. יש להחדירו כ-9 עד 10 מילימטרים מעבר להסתעפות של ה-ECA וה-CCA. בדרך כלל, המונילמנט ייבלם ולא יוכל לנוע יותר.

היזהרו שלא לחתוך את עורק ה-tego palatine. קשרו את התפר על ה-ECA בחוזקה כדי לקבע את הפילמנט במקומו. כעת סגרו את העור באמצעות מערכת סגירת פצעים מסוג auto clip.

הזריקו מיליליטר אחד של תמיסת סאלין תת-עורית והניחו את העכברים תחת מנורת חימום אינפרא-אדומה במהלך תקופת הפוסט-אוקלוזיה, הנמשכת 60 דקות. הרדימו את העכברים כפי שנעשה קודם לכן והסירו את תסביכי ה-auto clips; פתחו מעט את התפר על ה-ECA כדי לאפשר את נסיגת המונילמנט ואת הפרפוזיה החוזרת של הדם. לאחר מכן, קשרו באופן קבוע את התפר הזמני על ה-ECA כדי למנוע איבוד דם.

שעה לאחר השבץ, הוצא את המונופילמנט ושמור אותו לשימוש חוזר. לאחר מכן, הסר את התפר הזמני מה-CCA כדי לאפשר לדם לזרם שוב. סגור את הפצע ואת השכבה התת-עורית.

הזריק מיליליטר אחד נוסף של תמיסת סלין לעכברים. לאחר שווידאת שהחיה קיבלה בחזרה את יכולת התנועה, החזר אותה לכלוב והנח מחצית מהכלוב על משטח החממה כדי לאפשר לעכברים לבחור את סביבתם. 12 שעות לאחר הניתוח, העכברים יקבלו מנה נוספת של buprenorphine עבור כל ניסויי השם (sham operations).

כל ההליכים זהים, למעט העובדה שהמונופילמנט אינו מוחדר לאחר הניתוח. הגירעון הנוירולוגי מוערך כדי לאשר את הצלחת ה-T-M-C-A-O ולקבוע את ציון היעילות שלו; הגירעונות הנוירולוגיים של העכברים נמדדים בנקודות זמן של 1, 24, 48 ו-72 שעות לאחר הפרפוזיה, על פי סולם של שש נקודות באופן הבא: אפס שווה לתקין; אחת שווה לקל, סיבוב עם או בלי התכרבלות לא עקבית בעת ההרמה מהזנב; יותר מ-50% מניסיונות ההתכרבלות הם לצד הקונטרלטרלי.

שתיים שווה להתכרבלות קלה ועקבית מעל ל-50% מהניסיונות להתכרבל לצד השני. שלוש שווה להתכרבלות עקבית, חזקה ומיידית. העכבר שומר על תנוחה מכורבלת למשך יותר משנייה אחת עד שתי שניות.

כאשר אפו כמעט מגיע לזנבו. ציון ארבע שווה לקירוב חמור. התקדמות למצב של "חבית" (barreling), אובדן רפלקס ההליכה או הכתיבה, ציון חמש שווה למצב קומטוזי או גוש.

לאחר פרפוזיה עם תמיסת PBS, קפיאו את המוחות במהירות באיזופנטן ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. שימו לב כי ניתן לבצע פרפוזיה למוחות של עכברים גם עם 4% פאראפורמאלדהיד, בהתאם למחקרי האימונוהיסטוכימיה המתוכננים. לאחר מכן, השתמשו בקריוסטט לחיתוך נתחים קורונליים של המוח בעובי 17 מיקרון תוך שימוש ב-30 שקופיות.

הניחו חתך אחד מכל 30 על אותה שקופית. לאחר מכן, צבעו את השקופית הראשונה ואת השקופית ה-15 ב-crystal violet. להערכה מדויקת יותר של נפח הפגיעה, השתמשו במערכת לניתוח תמונות כגון Scion image של ה-NIH כדי להעריך את עומק הנגע, את שטח האינפארקט המופיע בצבע לבן בחצאי המוח השמאלי והימני.

חזור על הגבלה זו של ה-D בכל פרוסות המוח. חשב את נפח האינפארקט ביחידות שרירותיות והבע אותן כאחוז משטח האזור הנגדי שאינו פגוע עבור כל חתך. שמור את השקופיות האחרות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס (°C) לצורך מחקרי אימונוהיסטוכימיה.

הערכת מדד הנוירו (neuro score) מאשרת את הצלחת ה-T-M-C-A-O בעכברים שהוכפפו לפרוצדורה האינטרא-לומינלית. כפי שניתן לראות כאן, נצפה קירוב (curling) עקבי, חזק ובינוני, והעכבר שומר על תנוחה מקוערת למשך יותר משנייה אחת עד שתי שניות, כאשר אפו כמעט מגיע לזנבו. בניסוי שלנו, כל העכברים הראו קירוב עקבי קל לפחות, המקביל למדד נוירו של 2 לאורך כל תקופת הבדיקה.

צביעה ב-Kressel violet בוצעה כדי להעריך את היקף האוטם במוח. בעקבות T-M-C-A-O, מוצגים כאן חתכי כתר (coronal sections) מייצגים של מוח עכבר שנצבעו ב-crest violet לאחר 72 שעות מרפרפוזיה. אזור האוטם, בעיקר הסטריאטום, הקורטקס ואזורי מוח סמוכים, המסומנים, מופיע בצבע לבן כיוון שאינו נצבע על ידי ה-crest.

הצבע הסגול המוצג כאן מייצג את נפח הפגיעה, שהוא החלק הלבן של ההמיספירה הימנית המבוטא כאחוז משטח ההמיספירה הנגדית ללא הפגיעה בצד שמאל. נפח האינפארקט בעכברים זכרים מסוג C 57 black six בעקבות שבץ איסכמי מייצג כ-70% מההמיספירה ללא הפגיעה. פרוצדורה זו מספקת הדירות גבוהה של הפגיעה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע שבץ איסכמי זמני בעכברים. בנוסף, גישת ה-quiz viol למדידת נפח המוח בפועל, מעניקה לכם את היתרון הגדול של זמינות חומרים רבים לבדיקת סממנים רלוונטיים באמצעות אימונוכימיה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.