Name: מודל עכבר של MCAO intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים Cresyl (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למדו את מודל החסימה התוך-לומינלית של העורק המוחי האמצעי בעכברים לחקר שבץ איסכמי. השיטה כוללת הערכת נזקים נוירולוגיים וצביעת מוח בחומר Cresyl Violet לכימות נפח האוטם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי צוות CIHR מענק # 82946 CTP, CIHR מענק # 102741 MOP, כמו גם # 216684 ושטראוס קרן כיסא קנדה. חדר המיון היה נתמך על ידי מלגה מהלב ושבץ הקרן הקנדי.

חסימת עורק מוחית חולפת תיכונה (MCAO) 1. הליך ניתוח (איור 1) חסימת עורק מוח אמצעית חלוף (tMCAO) מתבצעת ב 2 - לC57Bl גבר בן 3-חודש / 6 עכברים (22-28g). פרוטוקול זה אושר על ידי הטיפול בבעלי חי IRCM אתיקת הוועדה. כלים כירורגיים עוקרו על ידי מעוקר (121 מעלות צלזיוס ב 15 psi במשך 60 דקות). בין כל בעלי חיים, הם מעוקרים באמצעות חרוז המעקר החם (15 שניות). שולחן ניתוחים וציוד אחר המחוטאים באמצעות אתנול 70%. שעות לפני הניתוח, עכברי analgesized עם עצירות (0.03 וויפ מ&quot;ג / ק&quot;ג). איור 1 א &#39;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק לטשטש את העכברים עם 5% isoflurane ולאחר מכן לשמור בהרדמת 2.5% isoflurane. טמפרטורת גוף של העכברים נשמרה קבועה במהלך ניתוח עם כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הפרווה וskעם אתנול 70% או פולידין. מאז שחרורו מייצר גילוח שיער בר, microabrasions ודלקת שעשוי להשפיע על הפתופיזיולוגיה שבץ, אנחנו לא לגלח פרוות עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו אמצע צוואר ובעדינות לפרק את הרקמות הרכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ סטריאו (STEMI 2000, Zeiss), לנתיחה בוטה מבוצעת כדי לחשוף את קנה הנשימה וחוזר בי את השרירים כדי לאתר את העורק הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עורק התרדמה המשותף השמאל (CCA) הוא גזור בקפידה מרקמות והמרכז לאמנות העכשווית היא באופן זמני על ידי occluded תפר זמני (1) באמצעות קיצוץ תפר משי 5-0 ל20 מגזרי מ&quot;מ. זהירות רבה צריכה להיות למימוש שלא לפגוע בעצב vagal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד הסתעפות של עורק התרדמה המשותף השמאל הפנימי (רשפ&quot;ת) ועורק תרדמה משותף חיצוני (ECA). תפר קבוע (2) ממוקם סביב ECA, כdistally ככל האפשר, ועוד פס דק מעט זמני (3) דגש על ECA דיסטלי כדיהסתעפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ ICA השמאלי (4) שימוש בפינצטה הפוכה פעולה, כדי למנוע דימום. זהירות רבה צריכה להיות למימוש שלא לפגוע בעצב vagal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חור קטן לתוך ECA (5) בין (3) תפרים קבועים (2) וזמניים. </li></ol> איור 1 ב. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג מ&quot;מ באורך 6-0 12 סיליקון מצופה (כ 9-10mm הוא סיליקון המצופה) תפר monofilament (Doccol תאגיד) לECA (6), לחתוך ECA דיסטלי לתפר התמידי לגמרי ולהפוך occluder לרשפ&quot;ת . התפר נקשר בחוזקה סביב monofilament כדי למנוע דימום ופינצטה הפוכת הפעולה יוסרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Occluder הוא הציג לסגור מוצא של MCA במעגל של ויליס. עצור החדרתה סביב 9-10 מ&quot;מ מעבר להסתעפות של ECA ומרכז לאמנות עכשווית. Occluder חסום ולא יכול לזוז יותר. טיפול חייב להיות מופעל לא לחדור עורק pterygopalatine. התפר (3) על ECA הוא tigקשר htly לתקן monofilament בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור עם מערכת סגירת פצע autoclip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזריק 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח תת העור ולמקם את העכברים תחת מנורת חימום אינפרא אדום במשך כל התקופה שאחרי החסימה (60 דקות). </li></ol> 2. שחזור זרימת דם עורקי מוח האמצעית לפני reanesthesia, neuroscore ניתן לבדוק כדי להעריך את ההצלחה של הניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את העכברים שתוארו כעבר ולהסיר את autoclips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצת לפתוח את התפר (3) על ECA כדי לאפשר נסיגת monofilament וreperfusion דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצמיתות לקשור את התפר הזמני על ECA כדי למנוע איבוד דם. Monofilament נשמר לשימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התפר הזמני (1) על המרכז לאמנות העכשווית כדי לאפשר סחרור דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגור את הפצע. העכברים צריכים לקבל פתרון אחר 1 מ&quot;ל מי מלח תת עורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכברים מתחת למנורת חימום אינפרא האדום לשעה 1. אחרי שווידאתי שהחיה חוזרת לניידות, העכבר חזר לכלוב שלו והשאיר תחת כרית החימום ומגבות ל72 שעות. שים לב שרק מחצית מהכלוב מונחת על כרית החימום כדי לאפשר לעכברים כדי לבחור את סביבתם. בגלל ירידה במשקל לאחר הניתוח נצפית בדרך כלל, אוכל פירה מונח בצלחת פטרי כדי לעודד אכילה. שתים עשר שעות לאחר הניתוח, עכברים קבלו מנה נוספת של עצירות (0.03 וויפ מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li></ol> 3. מבצע שאם לפעולות דמה, כל הנהלים זהים, הפרט שoccluder לא הוכנס. 4. Neuroscore גירעונות נוירולוגיות לאפשר הערכה של ההצלחה של tMCAO רק לאחר reperfusion ומאוחר יותר להערכת מידת החומרה של פציעה. גירעונות נוירולוגיות מקבלים נקודות כפי שתואר קודם לכן 5 &lt;/ Sup&gt; והופיע ב1, 24, 48 ושעות לאחר reperfusion 72. היקף מורחב שש נקודות משמש: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0: נורמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1: קל מקיף התנהגות עם או בלי סיבוב עקבי כאשר לקח בזנב, ניסיונות &lt;50% כדי לסובב לצד הנגדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2: קל עקבי חג, 50%&gt; ניסיונות כדי לסובב לצד הנגדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3: בקנה אחד חזק ומקיף מיידיים, העכבר מחזיק בעמדת רוטציה במשך יותר מ 1-2 שניות, עם האף כמעט להגיע בזנבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4: סיבוב חמור המתקדם למתגלגל, אובדן הליכה או ליישר רפלקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5: תרדמת או גוסס. </li></ul> 5. הכתמים סגולים Cresyl (איור 2) בעקבות זלוף הפתרון PBS, המוח מוקפא במהירות בisopentane ואוחסן ב -80 °מוחה ג עכבר ניתן גם perfused עם paraformaldehyde 4% (PFA) בהתאם למחקרי אימונוהיסטוכימיה המתוכננים. Cryostat חיתוך של חלקי מוח עטרה (17 מיקרומטר) מבוצע. סעיף אחד מתוך כל 30 נאסף על אותה השקופית שיש פגיעה מוחית נציג. לכימות נפח, 2 שקופיות מוכתמות מהכתמה סגולה cresyl ומערכת ניתוח תמונה (Scion תאגיד, פרדריק, מרילנד) שמש כדי להעריך את הנגע. היקף הפגיעה היה מחושב ביחידות שרירותיות (פיקסלים), ומבוטא באחוזים מהשטח הלא lesioned הנגדי עבור כל מקטע. שקופיות אחרות נשמרות ב-80 ° C ללימודי אימונוהיסטוכימיה. לחלופין, מוח PFA קבוע ניתן לחתוך ב30-50 מיקרומטר באמצעות vibratome ונפח האוטם נמדד כמומלץ על ידי האן et al. (2009) 6.

<ol><li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%2C+I%3A+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. rain <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((infarction+is+not+reduced+in+SOD-1+transgenic+mice+after+a+permanent+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia.</a> Neuroreport. 5, 293-296 (1993).</li>
<li>Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenic+mice+are+highly+resistant+to+reperfusion+injury+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 25, 165-170 (1994).</li>
<li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+stroke+model+guidelines+for+preclinical+stroke+trials+%281st+edition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Stroke+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition.</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li>
<li>Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlortetracycline+and+demeclocycline+inhibit+calpains+and+protect+mouse+neurons+against+glutamate+toxicity+and+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia.</a> J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).</li>
<li>Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+brain+injury+is+attenuated+in+mice+lacking+the+beta2-adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor.</a> Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).</li>
<li>Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCSK9+reduces+the+protein+levels+of+the+LDL+receptor+in+mouse+brain+during+development+and+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke.</a> J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).</li>
<li>Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+pterygopalatine+arterial+blood+flow+decreases+infarct+volume+variability+in+a+mouse+model+of+intraluminal+suture+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).</li>
<li>Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+suture+size+and+carotid+clip+application+upon+blood+flow+and+infarct+volume+after+permanent+and+temporary+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Res. 970, 131-192 (2003).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li>
</ol>

המחברים אין אינטרסים מנוגדים לגילוי. הייצור והגישה חופשיה למאמר זה הוא בחסות Zeiss, Inc

מודלי שבץ שונים פותחו כדי לחקות השלכות שבץ בחולים. הבחירה במודל השבץ תלוי בשאלות הביולוגיות. מודל MCAO intraluminal מחק אחד מהסוגים הנפוצים ביותר של שבץ איסכמי בחולים והוא פחות פולשני ויותר עקבי מאשר מודל טאמורה 4,7. זהו מודל מעניין באמת עבור ניתוחי מות neuroprotection, neurorepair ותא. הצלחתו של מודל intraluminal תלוי בגורמים רבים כמו מין חיה, גיל ומשקל, טמפרטורה, הרדמה וזמן הניתוח, אשר צריכים להיות בשליטה. לחזות הפיסית של occluder (טיפ קוטר, אורך, צורה וfexibility) היא קריטית לעקביות של MCAO 4. בזאת, אנו משתמשים 6-0 12 monofilament מ&quot;מ הארוך מצופה בסיליקון על 9-10 מ&quot;מ מחברת Doccol. היתרון הגדול של monofilament זה הוא להפחית דימום subarachnoid ובגלל אורכו כיסה את כל ICAאורך זרימה, שיורי דם, אשר מגיעה מעורקי התקשורת של הקדמיים ואחוריים של המעגל של ויליס וPPA, נמנעת וההשתנות בירידות נפח האוטם (15% מהשתנות בידות שלנו) 8. התפר של מרכז לאמנות עכשווית גם מקטין את השונות של נפח האוטם 9. היקף פגיעה המוחית tMCAO הבא יכול להיות מוערך על ידי דרכים שונות. גירעונות נוירולוגיות ניתן למדוד כאמור לעיל. עם זאת, קשה לי אמצעי יעיל בדרך זו. ההיקף האוטם מבוצע בדרך כלל על ידי מכתים TTC. לאחרונה, טכניקות תהודה מגנטיות משמשות גם, טכנולוגיה מעניינת במיוחד עבור טיפולי neuroprotective. כדי להבין את המנגנונים התאיים הבסיסיים המעורבים בשבץ כגון neurorepair, מוות של תאים או התפשטות תאים, המחקר של סמנים שונים על ידי אימונוהיסטוכימיה הוא קריטי ומאוד אינפורמטיבי. לפיכך, protocol הכנות סעיף במוח יש את היתרון הגדול של ניתוחים אלו מאפשרים, ומצמצם את מספר העכברים בשימוש. יתר על כן, Tureyen et al. 10 דיווח כי קיימת קורלציה טובה בין הכתמים סגולים cresyl וTTC.

<table border="1"&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; תיאור</strong</td&gt;<td<strong&gt; חברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוג</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מיקרוסקופ סטריאו</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt; STEMI 2000</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פנס עצמה גבוה סיבי אור</td&gt;<td&gt; דולן-ג&#39;נר תעשיות בע&quot;מ</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מערכת הרדמה לisoflurane</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurane</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 108737</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; שמיכת חימום</td&gt;<td&gt; Gaymar Medsearch</td&gt;<td&gt; TP22G</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מנורת חימום אינפרא אדומה</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ultra פינצטה בסדר, סגנון 5</td&gt;<td&gt; מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td&gt;<td&gt; 78320-5TI</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מספרי Vannas 3 קרח דק מ&quot;מ, סטרייט</td&gt;<td&gt; מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td&gt;<td&gt; 72932-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אורח LA-1 וMPF-1 כל הלהבים החלקים</td&gt;<td&gt; מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td&gt;<td&gt; 77926-5S</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פינצטה פעולה שלילית, בסגנון 5 KOPINC</td&gt;<td&gt; מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td&gt;<td&gt; 72850-F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ביתור מספריים 5 1/2 &quot;סטרייט</td&gt;<td&gt; Cedarlane</td&gt;<td&gt; 72960</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Autoclip המתנע סט</td&gt;<td&gt; הרווארד מנגנון</td&gt;<td&gt; 34-0557</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BD Autoclip פצע Syst סגירה., 9 מ&quot;מ ארוך, 100/pk</td&gt;<td&gt; פישר</td&gt;<td&gt; 01-804-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5-0 תפר</td&gt;<td&gt; הרווארד מנגנון</td&gt;<td&gt; 517763</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תפר חומרי PDS השני monofilament סגול, 5-0, RB-1; Z303H</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 6167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12 6-0 תפר monofilament סיליקון מצופה מ&quot;מ ארוך</td&gt;<td&gt; Doccol תאגיד</td&gt;<td&gt; 60SPRePK5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Seringes 1ml</td&gt;<td&gt; פישר</td&gt;<td&gt; 14-823-2F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מחטי 26G1 / 2</td&gt;<td&gt; פישר</td&gt;<td&gt; BD-305111</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; C57BL / 6</em&gt; עכברים</td&gt;<td&gt; IRCM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</table

מודל עכבר של mcao intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים cresyl

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

שבץ הוא הגורם השלישי לתמותה והסיבה המובילה למוגבלות בעולם. חשבונות שבץ איסכמי מהווה כ 80% מכל מקרי השבץ. עם זאת, thrombolytic רקמת plasminogen activator (tPA) הוא הטיפול היחיד של שבץ איסכמי חריף שקיים. חוקרים בהראשות זו כדי לפתח מספר דגמי שבץ איסכמי במגוון מינים. שני סוגים עיקריים של מכרסמים פותחו: מודלים של איסכמיה המוחית הגלובלית או איסכמיה מוחית מוקדים. לחקות שבץ איסכמי בחולים, בכ 80% משיחות טרומבוטיים או תסחיפים מתרחשים בטריטוריה של עורק המוח האמצעי (MCA), חסימת עורק המוח האמצעית intraluminal (MCAO) מודל הוא די רלוונטי ללימודי שבץ. מודל זה פותח לראשונה בחולדות על ידי קואיזומי et al. בשנת 1986 1. בגלל הקלות של מניפולציה גנטית בעכברים, דגמים אלה גם פותחו ב2-3 מין זה. תוכן &quot;&gt; בזאת, אנו מציגים את הליך חסימת MCA החולף בC57/Bl6 עכברים. מחקרים קודמים דיווחו כי תכונות פיסיקליות של occluder כגון קוטר קצה, אורך, צורה וגמישות הן קריטיות לשחזור של נפח אוטם 4. בזאת, בmonofilaments מצופי הסיליקון מסחרי (Doccol תאגיד) היה בשימוש. יתרון גדול נוסף הוא שmonofilament זה מקטין את הסיכון לדימומים לגרום subarachnoid. שימוש במיקרוסקופ סטריאו-STEMI צייס 2000, monofilament המצופה סיליקון הוכנס עורק התרדמה הפנימי (רשפ&quot;ת) דרך חתך בעורק הראשי החיצוני (ECA) עד monofilament חוסם את הבסיס של MCA. זרימת דם שוחזרה 1 שעה מאוחר יותר על ידי הסרת monofilament לחקות השבת זרימת דם לאחר תמוגה של קריש בתרומבואמבוליים בני אדם. המידה של אוטם מוחי יכולה להיות מוערכת על ידי 1 ציון נוירולוגים ועל ידי המדידה של נפח האוטם.עכברי איסכמי נותחו ובכך לציון הנוירולוגים שלהם בזמנים שונים לאחר reperfusion. על מנת להעריך את נפח האוטם, מכתים עם כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) היה מבוצע בדרך כלל. בזאת, אנו משמשים מכתימים סגולים cresyl כן הוא מציע את ההזדמנות כדי לבדוק סמנים קריטיים רבים על ידי אימונוהיסטוכימיה. בסרטון הזה, אנו מדווחים על הליך MCAO; עשרות נוירולוגיות וההערכה של נפח האוטם ידי צביעה סגולה cresyl.

הערכת neuroscore מאשרת את ההצלחה של tMCAO לאחר השבץ וקובעת את היעילות של הפוסט reperfusion tMCAO. בידות שלנו, כל העכברים נתונים להליך intraluminal הציג לפחות מסתלסל קל עקבי (neuroscore 2) ואת גירעונות הנוירולוגיות הם עד 72 שעות בדרך כלל יציבים. רוב עכברי תערוכה מסתלסלים עקבי קל (neuroscore 2). עכברים מראים היעדר מסתלסל הם הוצאו מהמחקר. עם זאת, הערכת neuroscore אינה מאפשרת לנו להבחין בין עכברים עם ההיפוקמפוס פצוע ואלה עם ההיפוקמפוס ללא פגע. אין תמותה נצפתה במהלך יום הניתוח, טוענת כי דימומי subarachnoid לא התרחשו. כאשר הדימום תת עכבישים מזוהה בעכבר, זה לא נכלל באופן שיטתי מהניתוח. השימוש בחוט הניילון סיליקון מצופה מDoccol תאגיד, שהוא חלק יותר monofilaments הביתי מוכן, מגביר את ההצלחהtMCAO ומפחית את דימום subarachnoid. תמותה בין 24 שעות ועד 72 שעות היא 14% במודל זה, כפי שדווח באופן כללי ל60 דקות של חסימה. התמותה נצפתה היא כנראה בשל נפח אוטם גדול בעכבר זן זה. שחזור נגע חזק גם נצפה (סטיית תקן היא 15%), וזה מאוד מעניין ללמוד מולקולות neuroprotection בי ההשפעה שלהם (הים) יכולה להיות מוסתרת על ידי ההשתנות של המודל. כדי להעריך את מידת פגיעה מוחית בעקבות tMCAO, אנחנו בחרנו להשתמש מכתימים סגולים cresyl (איור 2) ולא TTC על מנת שיהיה הרבה חומרים לבדיקת סמנים רלוונטיים 6. היקף הפגיעה הוא יחסית עקבי. עם זאת, הבחין כי בעכברים מסוימים, ההיפוקמפוס נפצע (סביב 30% מעכברים). זה מעניין לציין כי הכתמים הסגולים cresyl יכולים להיות מיושם עד 1 שבוע מאוחר יותר. בספרות, שיעור האוטם מוחי משתנה מאחדללמוד לצד השני. זה תלוי בבחירה של עכבר זן, הרדמה, בעובי של חלקי מוח, חוט הניילון בשימוש, או בשימוש מכתים 6, 7. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" /> איור 1. ערכה של החסימה של עורק המוח האמצעי באמצעות monofilament intraluminal סיליקון מצופה. ערכה. פשוט של מוח עכבר ועורקי המוח מראים תפרים וקליפ רצופים כדי להכין את ההקדמה של monofilament סיליקון המצופה. B. עמדת monofilament באמצעות המעגל של ויליס מיוצגת. Monofilament מוחדר דרך ICA ECA כדי לחסום את הבסיס של MCA ACA, עורק המוח קדמי;. התואר ראשון, basilar עורק; מרכז לאמנות עכשווית, עורק תרדמה משותף; ג ויליס, מעגל של ויליס; ECA, החיצוני התרדמה arteר&quot;י; יק&quot;א, עורק התרדמה הפנימית; MCA, עורק המוח האמצעי; PCA, עורק תקשורת אחורי; PPA, עורק pterygopalatine. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. סעיפי עטרה יציגים של מוח עכבר המוכתם בסגול cresyl אחרי 72 שעות שלאחר reperfusion. אזור אוטם (בעיקר סטריאטום, קליפה ואזורי מוח סמוכים) מופיעים בלבן (בתוליים ידי סגול cresyl). נפח הפציעה (חלק לבן, אונה ימנית) היה מופרד ומבוטא כאחוז מהשטח הנגדי אינו lesioned (אונה שמאלית).

מודל intraluminal המוח האמצעי, החסימה בעכברים מוצג במסמך זה. ההיקף אוטם מוחית מחושב על ידי ציון נוירולוגים וכתמים סגולים cresyl, מכתים חלופה לTTC, להציע את היתרון הגדול לבדיקה בסמני ריבית רבים במקביל.

מודל עכבר של MCAO intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים Cresyl

שבץ מוחי הוא גורם התמותה השלישי במדרגה והגורם המוביל לנכות בעולם. שבץ איסכמי מהווה כ-80% מכלל מקרי השבץ. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לדמות שבץ איסכמי בעכברים. ראשית, העורק הקרוטיד המשותף נקשר באופן זמני, בעוד שהעורק הקרוטיד החיצוני נקשר באופן קבוע רחוק ככל האפשר מהמקור. תפר זמני נוסף, המהודק מעט, ממוקם על ה-ECA מעל הפיצול.השלב השני הוא קליב של העורק הקרוטידי הפנימי באמצעות פינצטה בעלת פעולה הפוכה כדי למנוע דימום. לאחר מכן, יש לחתוך את ה-ECA בין הליגטורה הקבועה לזמנית. בשלב הבא, מוחדר למסלול ה-ECA סיב מונופילמנטי מצופה סיליקון.לאחר מכן הופכים את ה-ECA כדי להחדיר את המונילמנט אל ה-ICA עד שזה יכלול את בסיס העורק המוחי האמצעי. שעה לאחר מכן, מחזירים את זרימת הדם על ידי הסרת המונילמנט כדי לדמות את השחזור של זרימת הדם לאחר ליסיס של קריש תרומבואמבולי בבני אדם. לבסוף, ניתן להעריך את הגירעון הנוירולוגי, המשקף את הצלחת ה-T-M-C-A-O ואת חומרת האינפקט, מיד לאחר הפרפוזיה ובזמנים שונים לאחר הפרפוזיה.תוכנת Cyan image מ-NIH משמשת לחישוב נפח השבץ (infarct volume) בחתכי מוח מייצגים שנצבעו ב-cresyl Violet. אחד היתרונות המרכזיים של חסימה זמנית של העורק המוחי האמצעי באמצעות טכניקת הפילמנט התוך-לומינלי הוא שהיא מדמה שבץ איסכמי במטופלים, עם השבת זרימת הדם, ופיתוח פרוצדורה זו בעכברים מאפשר שימוש בכלי גנטיים מסומנים כדי לזהות את התפקיד של חלבון מטרה. בחסימה זמנית של העורק המוחי האמצעי לשבץ, הפעולה מבוצעת בעכברים זכרים מסוג C57BL/6 בני חודשיים עד שלושה, השוקלים בין 22 ל-28 גרמים.פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת הביו-אתיקה של IRCM כדי להגביר את השחזוריות של נפח השבץ (infarct volume). אנו משתמשים במונופילמנט בעל ציפוי סיליקון 6H, באורך 12 מילימטרים, הניתן לשימוש חוזר, מחברת Doco Corporation. שעתיים לפני הניתוח.הזריק לעכבר באופן תו-פריטוניאלי (intraperitoneal) בופרנורפין במינון של 0.03 milligrams per kilogram. כדי להתחיל את הפרוצדורה, הרדם את העכברים ב-5% isof fluorine ושמור על ההרדמה בריכוז של 2.5% ISO fluorine. השתמש במשטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה של העכבר במהלך הניתוח, וחטא את עור העכבר ב-70% ethanol או ב-Betadine. לאחר מכן, בצע חתך בקו האמצע בצוואר והרחק את הרקמות הרכות תחת מיקרוסקופ סטריאו.בצעו דיסקציה לא עדינה (blunt dissection) של צוואר העכבר כדי לחשוף את הקנה. לאחר מכן, הזיזו את השרירים כדי לאתר את העורקי העשלה (carotid artery). הפרדו בזהירות את העורקי העשלה המשותף השמאלי מהרקמות שסביבו.מקמו תפר משי זמני בדרגת 5-0, חתוך למקטעים של 20 millimeter, מסביב לעורק. היזהרו לא לפגוע בעצב הוואגוס. לאחר מכן, הפרידו בין הפיצול של העורק הקרוטיד הפנימי השמאלי (ICA) לבין העורק הקרוטיד החיצוני (ECA), ומקמו תפר קבוע מסביב ל-ECA רחוק ככל האפשר מהמרכז (דיסטלית).ותפר זמני נוסף על ה-ECA מעל הפיצול. לאחר מכן, סגרו את ה-ICA השמאלי באמצעות פינצטה עם פעולה הפוכה כדי למנוע דימום. שוב, היזהרו מאוד לא לפגוע בעצב הוואגוס.בצעו חור קטן ב-ECA לפני ההסתעפות ל-ECA ול-ICA ובין התפרים הקבועים והזמניים שהוצבו קודם לכן. לאחר מכן, הכניסו תפר מונופילמנט מצופה סיליקון במידה של 12 מילימטר ובעובי 6-0 לתוך ה-ECA, חתכו את ה-ECA באופן מלא והעבירו את המונופילמנט לתוך ה-ICA. קשרו את התפר בחוזקה כדי למנוע דימום והוציאו את הפינצטה בעלת פעולת ההיפוך.לאחר מכן, הכניסו את המונילמנט למעגל ויליס עד שהמונילמנט חוסם את בסיס ה-MCA. יש להחדירו כ-9 עד 10 מילימטרים מעבר להסתעפות של ה-ECA וה-CCA. בדרך כלל, המונילמנט ייבלם ולא יוכל לנוע יותר.היזהרו שלא לחתוך את עורק ה-tego palatine. קשרו את התפר על ה-ECA בחוזקה כדי לקבע את הפילמנט במקומו. כעת סגרו את העור באמצעות מערכת סגירת פצעים מסוג auto clip.הזריקו מיליליטר אחד של תמיסת סאלין תת-עורית והניחו את העכברים תחת מנורת חימום אינפרא-אדומה במהלך תקופת הפוסט-אוקלוזיה, הנמשכת 60 דקות. הרדימו את העכברים כפי שנעשה קודם לכן והסירו את תסביכי ה-auto clips; פתחו מעט את התפר על ה-ECA כדי לאפשר את נסיגת המונילמנט ואת הפרפוזיה החוזרת של הדם. לאחר מכן, קשרו באופן קבוע את התפר הזמני על ה-ECA כדי למנוע איבוד דם.שעה לאחר השבץ, הוצא את המונופילמנט ושמור אותו לשימוש חוזר. לאחר מכן, הסר את התפר הזמני מה-CCA כדי לאפשר לדם לזרם שוב. סגור את הפצע ואת השכבה התת-עורית.הזריק מיליליטר אחד נוסף של תמיסת סלין לעכברים. לאחר שווידאת שהחיה קיבלה בחזרה את יכולת התנועה, החזר אותה לכלוב והנח מחצית מהכלוב על משטח החממה כדי לאפשר לעכברים לבחור את סביבתם. 12 שעות לאחר הניתוח, העכברים יקבלו מנה נוספת של buprenorphine עבור כל ניסויי השם (sham operations).כל ההליכים זהים, למעט העובדה שהמונופילמנט אינו מוחדר לאחר הניתוח. הגירעון הנוירולוגי מוערך כדי לאשר את הצלחת ה-T-M-C-A-O ולקבוע את ציון היעילות שלו; הגירעונות הנוירולוגיים של העכברים נמדדים בנקודות זמן של 1, 24, 48 ו-72 שעות לאחר הפרפוזיה, על פי סולם של שש נקודות באופן הבא: אפס שווה לתקין; אחת שווה לקל, סיבוב עם או בלי התכרבלות לא עקבית בעת ההרמה מהזנב; יותר מ-50% מניסיונות ההתכרבלות הם לצד הקונטרלטרלי.שתיים שווה להתכרבלות קלה ועקבית מעל ל-50% מהניסיונות להתכרבל לצד השני. שלוש שווה להתכרבלות עקבית, חזקה ומיידית. העכבר שומר על תנוחה מכורבלת למשך יותר משנייה אחת עד שתי שניות.כאשר אפו כמעט מגיע לזנבו. ציון ארבע שווה לקירוב חמור. התקדמות למצב של "חבית" (barreling), אובדן רפלקס ההליכה או הכתיבה, ציון חמש שווה למצב קומטוזי או גוש.לאחר פרפוזיה עם תמיסת PBS, קפיאו את המוחות במהירות באיזופנטן ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. שימו לב כי ניתן לבצע פרפוזיה למוחות של עכברים גם עם 4% פאראפורמאלדהיד, בהתאם למחקרי האימונוהיסטוכימיה המתוכננים. לאחר מכן, השתמשו בקריוסטט לחיתוך נתחים קורונליים של המוח בעובי 17 מיקרון תוך שימוש ב-30 שקופיות.הניחו חתך אחד מכל 30 על אותה שקופית. לאחר מכן, צבעו את השקופית הראשונה ואת השקופית ה-15 ב-crystal violet. להערכה מדויקת יותר של נפח הפגיעה, השתמשו במערכת לניתוח תמונות כגון Scion image של ה-NIH כדי להעריך את עומק הנגע, את שטח האינפארקט המופיע בצבע לבן בחצאי המוח השמאלי והימני.חזור על הגבלה זו של ה-D בכל פרוסות המוח. חשב את נפח האינפארקט ביחידות שרירותיות והבע אותן כאחוז משטח האזור הנגדי שאינו פגוע עבור כל חתך. שמור את השקופיות האחרות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס (°C) לצורך מחקרי אימונוהיסטוכימיה.הערכת מדד הנוירו (neuro score) מאשרת את הצלחת ה-T-M-C-A-O בעכברים שהוכפפו לפרוצדורה האינטרא-לומינלית. כפי שניתן לראות כאן, נצפה קירוב (curling) עקבי, חזק ובינוני, והעכבר שומר על תנוחה מקוערת למשך יותר משנייה אחת עד שתי שניות, כאשר אפו כמעט מגיע לזנבו. בניסוי שלנו, כל העכברים הראו קירוב עקבי קל לפחות, המקביל למדד נוירו של 2 לאורך כל תקופת הבדיקה.צביעה ב-Kressel violet בוצעה כדי להעריך את היקף האוטם במוח. בעקבות T-M-C-A-O, מוצגים כאן חתכי כתר (coronal sections) מייצגים של מוח עכבר שנצבעו ב-crest violet לאחר 72 שעות מרפרפוזיה. אזור האוטם, בעיקר הסטריאטום, הקורטקס ואזורי מוח סמוכים, המסומנים, מופיע בצבע לבן כיוון שאינו נצבע על ידי ה-crest.הצבע הסגול המוצג כאן מייצג את נפח הפגיעה, שהוא החלק הלבן של ההמיספירה הימנית המבוטא כאחוז משטח ההמיספירה הנגדית ללא הפגיעה בצד שמאל. נפח האינפארקט בעכברים זכרים מסוג C 57 black six בעקבות שבץ איסכמי מייצג כ-70% מההמיספירה ללא הפגיעה. פרוצדורה זו מספקת הדירות גבוהה של הפגיעה.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע שבץ איסכמי זמני בעכברים. בנוסף, גישת ה-quiz viol למדידת נפח המוח בפועל, מעניקה לכם את היתרון הגדול של זמינות חומרים רבים לבדיקת סממנים רלוונטיים באמצעות אימונוכימיה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.

mouse-model-intraluminal-mcao-cerebral-infarct-evaluation-cresyl

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אנו מדגימים את הוידאו שיטה לייצור באמצע חסימה בעורק המוח בעכברים בוגרים באמצעות monofilament intraluminal. כמו כן, אנו מראים כיצד להעריך את מידת אוטם מוחי על ידי מכתים 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC).

עכבר דגם ספיגה התיכון עורק מוחי

עורק המוח האמצעי intraluminal חסימה (MCAO) מודל הוא מודל בשימוש השכיח ביותר בקרב מודלים ניסיוניים שבץ איסכמי. להלן נדגים את המודל כולו בפירוט עם מדריך של flowmetry לייזר דופלר, והתוצאות מי מטעמה.

Intraluminal העורקים התיכון מוחין ספיגה (MCAO) מודל שבץ איסכמי עם הדרכה דופלר Flowmetry לייזר עכברים

ניטור זלוף מוחות הודגם לשיפור דיוק במודלים של שבץ איסכמי. קשיים טכניים לעתים קרובות להגביל את השימוש בכלי חיוני זה למחקר כלי דם במוח. בסרטון הזה, מערכת אופטימיזציה מוצגת להשיג ניטור המודינאמית בודד או מרובה אתרים בחסימת עורק מוח האמצעית intraluminal בחולדות.

מערכת אופטימלית לניטור זלוף מוחות במודל שבץ העכברוש של חסימת עורק מוח האמצעית intraluminal

Photothrombosis היא טכניקה מהירה, מינימאלי פולשנית לגרימת אוטם קטן ומופרד היטב בתחומי העניין באופן מאוד לשחזור. זה מתאים במיוחד ללימוד תגובות תאיות ומולקולריים שבבסיס פלסטיות מוח בעכברים מהונדסים.

איסכמיה Photothrombotic: דגם נגע פולשנית לשעתק פוטו קליפתיים לעכבר מחקרי שבץ

מודלים עכבריים שונים של חסימת עורק המוח אמצעית (MCAO) נמצאים בשימוש נרחב בחקר המוח ניסיוני. הנה, אנחנו מדגימים את המודל של MCAO דיסטלי הקבוע transcranial אשר מייצר אוטם קליפת המוח עקבי של גודל המתאים לנזק שהוטל על ידי הרוב המכריע של מקרי שבץ איסכמי אנושיים.

דוגמנות שבץ בעכברים: קרישה קבועה של עורקי דיסטלי התיכון מוחין

אפיון תאי מיאלואידית מוח לאחר שבץ יכול להתבצע על ידי stereology בשיטת fractionator האופטית, או על ידי ניתוח התזרים cytometric של מוח לויקוציטים השעיות. שניהם טכניקות שימושיות לבצע הבחנה phenotypical מדויקת של תת תא מיאלואידית העיקרי נמצאים במוח איסכמי.

Stereological וcytometry זרימת אפיון תת-אוכלוסיות יקוציט במודלים של חולף או קבוע מוחין איסכמיה

במחקר זה, נוכל לשנות שיטה ניסיונית קיימת כדי להשיג תוצאות לשחזור יותר, על-ידי יצירת מודל העכבר סגר (MCAO) של עורק המוח התיכון. אוראלי מינהל Glycyrrhizae בסיס et תמצית מתנול קנה שורש (גר) (GRex), בעקבות שבץ אינדוקציה, ירד באופן משמעותי אוטם סה כ נפח ביחס קבוצת הביקורת שלא טופלו.

הערכת אפקטים Neuroprotective של בסיס Glycyrrhizae et Rhizoma לחלץ באמצעות מודל העכבר חסימה של עורק המוח התיכון ארעית

מודלים שונים של אומת עורק המוח האמצעי (MCAo) משמשים במחקר שבץ ניסיוני. כאן, מודל שבץ ניסיוני של MCAo חולף דרך העורק הראשי החיצוני (ECA) מתואר, שמטרתו לחקות שבץ אנושי, שבו פקקת המוח מוסרת עקב תמוגה קריש ספונטני או טיפול.

שבץ דוגמנות בעכברים: אומת עורק מוחי אמצעי חולף דרך העורק הראשי החיצוני

פרוטוקול זה מדגים מודל שבץ עכבר ייחודי עם אוטם בגודל בינוני ושיעור הישרדות מצוין. מודל זה מאפשר לחוקרי שבץ פרה-קליניים להאריך את משך האיסכמיה, להשתמש בעכברים מזדקנים ולהעריך תוצאות תפקודיות ארוכות טווח.

מודל שונה של חסימת עורק מוחי אמצעי טרנס-גולגולתי לחקר תוצאות שבץ מוחי בעכברים מזדקנים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל חסימת עורק מוחי אמצעי דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6J ומעריכים את ההתנהגות הנוירולוגית והתכונות ההיסטופתולוגיות שלאחר מכן.

השראת שבץ איסכמי חריף בעכברים באמצעות טכניקת חסימת העורק האמצעי הדיסטלי

מודלים של חולדה in vivo הם כלים הכרחיים לחקירת המנגנונים הפתולוגיים והמטרות הטיפוליות לשבץ איסכמי. עבודה זו תתאר ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית בפרוסות מוח עם אוטם לאחר חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO) בחולדות.

הערכת איתות מוות תאי על ידי אימונופלואורסצנציה במודל חולדה של שבץ איסכמי

למדו את מודל החסימה התוך-לומינלית של העורק המוחי האמצעי בעכברים לחקר שבץ איסכמי. השיטה כוללת הערכת נזקים נוירולוגיים וצביעת מוח בחומר Cresyl Violet לכימות נפח האוטם.

מודל עכבר של MCAO intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים Cresyl

גלה סרטונים נוספים