אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הלבלב האנושי באופן השומר על האוריינטציה האנטומית. זה מושג על ידי הוצאת התריסריון והטחול מהלבלב, ולאחר מכן פינוי עודפי שומן וכלים מהלבלב. השלב השני הוא לצבוע את המשטח הקדמי בדיו כחול ואת המשטח האחורי בדיו שחור.

לאחר מכן, הלבלב מחולק לשלושה אזורים. לאחר מכן כל אזור נחתך לרוחב ללוחות אחידים ומניח על קלטות פרפין, תבניות OCT או טוחן עוד יותר ומניח בבקבוקונים. בסופו של דבר, נאספות דגימות מכל שלושת אזורי הלבלב, בעוד שהכיוון האנטומי הנכון נשמר לניתוח עתידי.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר סוכרת מסוג 1, כגון המנגנונים העומדים בבסיס אובדן מסת תאי בטא, או תפקוד, ואופי התקפת תאי החיסון. הדגמה חזותית של שיטת עיבוד הלבלב היא קריטית מכיוון ששמירה על כיוון in vivo של הלבלב דורשת תשומת לב לפרטים. ידגימו את ההליך לינדה סניידר, טכנולוגית היסטו ואמילי מונטגומרי, מדענית ביולוגית במעבדה שלי.

התחל בהכנת כל החומרים הדרושים להליך. ראשית, סמן את הקלטות שיחזיקו את גושי הפרפין עם מזהה תורם, סוג מדגם, מספר ציטוט וכל מידע נוסף. לאחר מכן, סמן את תבניות ה-OCT באותו אופן.

חותכים מספיק חתיכות נייר אלומיניום כדי לעטוף כל בלוק OCT ומניחים אותן בצד לשימוש מאוחר יותר. הכן את כל הבקבוקונים הדרושים לאחסון הדגימות הטריות והקפואות. הוסף RNA מאוחר יותר ומדיית RPMI כאשר הדבר מתאים.

לאחר מכן, הכינו את אזורי העבודה, הניחו לוחות חיתוך, מכשירים מעוקרים וכל שאר האספקה הדרושה להליך הן במכסה המנוע והן על השיש. סדר את כל הקלטות ותבניות ה-OCT לפי סדר השימוש. הסמוכים. צור אמבט קפוא על ידי הוספת מספיק איזופ פנטן כדי לכסות את הקרח היבש בתחתית קופסת קלקר.

כדי להתחיל בדיסקציה, הסר את התריסריון והטחול. מתחילים להפריד את התריסריון והלבלב בקצה אחד, וממשיכים עד לניתוק מוחלט. הטחול מחובר באופן רופף ומוסר בקלות מהשומן והלבלב.

לאחר מכן, יש לנקות את הלבלב מכלי שומן ועצבים זרים באמצעות שילוב של דיסקציה קהה וחדה. הניחו בצד את השומן ובלוטות הלימפה לעיבוד מאוחר יותר. לאחר הניקוי, הניחו את הלבלב על קרש חיתוך מכוסה במגבות נייר.

שמירה על הכיוון הנכון של הלבלב היא ההיבט הקשה ביותר בהליך זה. כדי להבטיח הצלחה, המשטחים הקדמיים והאחוריים צבועים בדיו בצבעים שונים. טבלו מוליך כותנה בדיו כחול, מרחו את הדיו על המשטח הקדמי של הלבלב ומחקו את העודפים.

לאחר מכן, טבלו מוליך חדש בדיו שחור ופזרו אותו על המשטח האחורי של הלבלב. החזר את הלבלב לכיוון הרגיל שלו. כאשר המשטח הקדמי פונה כלפי מעלה, הלבלב מוכן כעת לחיתוך לשלושה חלקים.

ראשית, חתוך את הצומת בין הראש לגוף. לאחר מכן, חלקו את החלק הנותר לחלקים שווים בערך כדי להפריד בין הגוף לזנב, רשמו את המשקל של כל אזור בלבלב. החל מחלק הראש.

מחלקים כל אזור לחלקים של כ-0.5 סנטימטר על ידי חיתוך רוחבי, בדומה לחיתוך כיכר לחם. לאחר שכל אזור בלבלב נחתך, הסר את החלק האחרון של אזור הראש, שהוא קטע צומת גוף הראש, והנח אותו על לוח חיתוך נפרד. טחנו את החלק הזה לחתיכות קטנות וחלקו את החלקים באופן שווה בין בקבוקוני קריו מסומנים עם ובלי RNA.

מאוחר יותר, הבקבוקונים מוקפאים. על פי נהלים סטנדרטיים. חזור על הליך זה עבור קטע צומת זנב הגוף.

לאחר איסוף הדגימות הטחונות, נשען על כל החלקים הרוחביים ימינה. חלקים מתחלפים של כל אזור יוסרו. עבור גושי פרפין ו-OCT, הסר את החלק הראשון לחסימת פרפין.

אם קטע גדול מדי, חותכים אותו לשניים. סמן את הקסטות כ-A ו-B.אם היצירה עדיין גדולה מדי, חתוך כל קטע בניצב לחיתוך הקודם, ולאחר מכן סמן את הקסטות A עד D בכיוון השעון. כפי שניתן לראות כאן, מקם את הקסטה כך שהתווית תהיה משמאל.

לאחר מכן, הכניסו את הטישו לתוך הקסטה וסגרו את המכסה. העבירו את הקסטה למיכל המכיל פורמין ניטרלי. מספר את הבלוק ברצף בתוך כל אזור, החל מהקטע המדיאלי ביותר עבור בלוקים של OCT.

יוצקים שכבה דקה של מדיה OCT לתבנית מסומנת מראש לפני הכנסת הרקמה, מכסים את הרקמה במדיה OCT ומקפיאים במהירות את הדגימה לשימוש מאוחר יותר בחזרה לרקמה שהונחה קודם לכן. בודד את בלוטות הלימפה בלבלב על ידי חיתוך השומן ורקמת החיבור המקיפה את קפסולת הצומת. מניחים את הצמתים בכלי סטרילי המכיל DMEF טוחנים צמתים גדולים לחתיכות שאינן גדולות מ- 0.5 סנטימטרים.

לאחר בידוד בלוטות הלימפה בלבלב, חלקו את הרקמה בין הבקבוקונים המוכנים לקלטות להמשך עיבוד. לאחר סיום בלוטות הלימפה, הטחול נטחן ומאוחסן בצורה דומה. כדי לעבד את התריסריון, השתמשו בפד גזה לח כדי לנגב את הרירית מריר, גזרו את הרירית ואז חתכו אותה לחלקים.

חלקו את דגימות הרירית כפי שהוצג קודם לכן. באמצעות הליך זה נאספות דגימות מייצגות של כל אזור בלבלב כפי שניתן לראות כאן. משקלי הראש, הגוף והזנב היו שווים בערך.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לעבד לבלב אנושי לסוגי דגימות שונים, במיוחד היכולת לשמור על הכיוון, כמו גם כיצד לבודד בלוטות לימפה מהשומן היקפי הלבלב.