אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע נתיחה של הלבלב האנושי באופן השומר על האוריינטציה האנטומית. דבר זה מושג על ידי הסרת התריסן והטחול מהלבלב, ולאחר מכן ניקוי עודפי שומן וכלי דם מהלבלב. השלב השני הוא סימון השטח הקדמי בדיו כחול והשטח האחורי בדיו שחור.

בשלב הבא, הלבלב מחולק לשלושה אזורים. כל אזור נפרס באופן רוחבי לפרוסות שוות המונחות בקסטות פאראפין, בתבניות OCT, או שנקצץ עוד יותר ומונח במבחנות. בסופו של דבר, נאספים דגימות מכל שלושת אזורי הלבלב, תוך שמירה על הכיוון האנטומי הנכון לצורך ניתוחים עתידיים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר על סוכרת מסוג 1, כגון המנגנונים העומדים בבסיס האובדן של מסת תאי בטא או תפקודם, ואופי התקיפה של תאי מערכת החיסון. הדגמה חזותית של שיטת עיבוד הלבלב היא קריטית, מכיוון ששמירה על האוריינטציה של הלבלב כפי שהייתה in vivo דורשת תשומת לב לפרטים. את הפרוצדורה יעמידו בהדגמה לינדה סניידר, טכנאית היסטולוגית, ואמילי מונטגומרי, מדענית ביולוגית במעבדתי.

התחילו בהכנת כל החומרים הדרושים להליך. ראשית, סמנו את הקסטות שיכילו את בלוקי הפרפין במזהה התורם, סוג הדגימה, מספר האליקוואוט וכל מידע נוסף. לאחר מכן, סמנו את תבניות ה-OCT באופן דומה.

גזרו מספיק חתיכות של נייר אלומיניום לעטיפת כל בלוק OCT והניחו אותן בצד לשימוש מאוחר יותר. הכינו את כל המבחנות הדרושות לאחסון הדגימות הטריות והקפואות. הוסיפו RNA later ומצע RPMI במידת הצורך.

בשלב הבא, הכינו את אזורי העבודה, והניחו לוחות ניתוח, מכשירים סטריליים וכל שאר האספקה הדרושה לפרוצדורה הן במכסה בטיחות ביולוגית והן על משטח העבודה. סדרו את כל הקסטות ותבניות ה-OCT לפי סדר השימוש בקרבת מקום. הכינו אמבט הקפאה על ידי הוספת כמות מספקת של isop pentane כדי לכסות את הקרח היבש בתחתית קופסת קלקר.

כדי להתחיל בנתיחה, הסירו את התריסריון ואת הטחול. התחילו בהפרדת התריסריון והלבלב מקצה אחד, והמשיכו עד להפרדה מלאה. הטחול מחובר באופן רופף וניתן להסיר אותו בקלות מהשומן ומהלבלב.

שלב הבא, נקו את הלבלב משומן מיותר, כלי דם ועצבים באמצעות שילוב של דיסקציה קהה וחדה. הניחו בצד את השומן ואת קשרי הלימפה לעיבוד מאוחר יותר. לאחר הניקוי, הניחו את הלבלב על לוח דיסקציה מכוסה בנייר סופג.

שמירה על האוריינטציה הנכונה של הלבלב היא ההיבט הקשה ביותר בפרוצדורה זו. כדי להבטיח הצלחה, צובעים את המשטחים הקדמי והאחורי בדיו בצבעים שונים. טבול מקל עם טיפ cotton בדיו כחול, מרח את הדיו על המשטח הקדמי של הלבלב וספוג את העודפים.

בשלב הבא, טבול אפליקטור חדש בדיו שחור והפץ אותו על פני השטח האחוריים של הלבלב. החזר את הלבלב למכוון המקורי שלו. כאשר פני השטח הקדמיים פונים כלפי מעלה, הלבלב מוכן כעת לחיתוך לשלושה חלקים.

ראשית, חתכו את החיבור בין הראש לגוף. לאחר מכן, חלקו את החלק הנותר למנות שוות בקירוב כדי להפריד בין הגוף לזנב, ורשמו את משקל כל אחד מאזורי הלבלב. התחילו במקטע הראש.

חלקו כל אזור למקטעים של כ-0.5 סנטימטר על ידי חיתוך במישור הרוחבי, בדומה לחיתוך כיכר לחם. לאחר שכל אזור בלבלב נחתך, הוציאו את המקטע האחרון של אזור הראש, שהוא מקטע החיבור בין הראש לגוף, והניחו אותו על לוח ניתוח נפרד. קצצו מקטע זה לחתיכות קטנות וחלקו את החתיכות באופן שווה בין מבחנות קריו מסומנות, עם ובלי RNA.

בהמשך, מקפיאים את המבחנות, בהתאם לנוהלי העבודה הסטנדרטיים. חוזרים על פעולה זו עבור מקטע חיבור הגוף והזנב.

לאחר איסוף הדגימות הקצוצות, הטה את כל החתכים הרוחביים ימינה. חתכים לסירוגין מכל אזור יוסרו. עבור בלוקים של פאראפין ו-OCT, הסר את החתך הראשון עבור חסימת פאראפין.

אם חלק גדול מדי, חתכו אותו לשניים. סמנו את הקסטות כ-A ו-B. אם החתיכה עדיין גדולה מדי, חתכו כל חלק בניצב לחתך הקודם, ולאחר מכן סמנו את הקסטות מ-A עד D עם כיוון השעון. כפי שניתן לראות כאן, מקמו את הקסטה כך שהתווית תהיה משמאל.

בשלב הבא, מקמו את הרקמה בתוך הקסטה וסגרו את המכסה. העבירו את הקסטה למכל containing neutral buffered formin. מספרו את הבלוקים באופן רציף בתוך כל אזור, החל מהחתך המדיאלי ביותר עבור בלוקי OCT.

שפכו שכבה דקה של מדיום OCT לתוך תבנית המסומנת מראש. לפני הכנסת הרקמה, כסו את הרקמה במדיום OCT והקפיאו את הדגימה במהירות לשימוש מאוחר יותר, תוך חזרה לרקמה שהוצנחה קודם לכן. בודדו את קשרי הלימפה הלבלביים על ידי הסרה של השומן ורקמת החיבור המקיפה את קפסולת הקשר. הניחו את הקשרים בתוך צלחת סטרילית המכילה DMEF וקצצו קשרי לימפה גדולים לחלקים שגודלם אינו עולה על 0.5 סנטימטרים.

לאחר בידוד קשרי הלימפה הלבלביים, חלק את הרקמה בין המבחנות והקסטות שהוכנו להמשך עיבוד. לאחר סיום העבודה עם קשרי הלימפה, קצץ את הטחול ואחסן אותו באופן דומה. לצורך עיבוד התריסריון, השתמש ברפידה של גזה לחה כדי לנקות את הרירית מהריר, גזור את הרירית ולאחר מכן חתוך אותה למקטעים.

חלקו את דגימות הרירית כפי שהודגם קודם לכן. באמצעות הליך זה, נאספות דגימות מייצגות מכל אזור בלבלב, כפי שניתן לראות כאן. המשקלים של אזורי הראש, הגוף והזנב היו שווים בקירוב.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן עיבוד לבלב אנושי לסוגי דגימות שונים, ובפרט את היכולת לשמר את האוריינטציה, וכן כיצד לבודד קשרי לימפה מהשומן הפריפנקראטי.