Name: אוסף פרוטוקול לבלב אנוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למדו את שיטת הניתוח של הלבלב האנושי תוך שמירה על ההתמצאות האנטומית. השיטה מאפשרת איסוף דגימות משלושת אזורי הלבלב לניתוח הרכב איי לנגרהנס וצפיפותם במחקר סוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים משפחות של תורמים איברים הרכש ארגונים העוסקים במחקר זה ומריה מרטינו ואירינה Kusmartseva לסיוע המומחה שלהם. עבודה זו מומנה על ידי Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) בתמיכה של רשת לעוגב תורמים הלבלב עם סוכרת.

1. הגדרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל הקלטות עבור אבני פרפין ידנית בעיפרון, או באופן אוטומטי עם המדפסת קלטת. כלול את מזהה התורם (CaseID), סוג הדוגמה, מספר aliquot, וכל זיהוי ייחודי נוסף (גליון מקרה, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">נספח 1</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית אוקטובר תבניות כמו על קלטות עם סמן קבע. לגזור מלבנים 5-10 ס&quot;מ של נייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדפיס או באופן ידני תווית עם סמן קבע את כל צלוחיות ואבובים. כלול צלוחיות מספיק דגימות עבור הצמד קצוצים צינורות קפואים עם התקשורת RPMI עבור משלוחים טריים. על צלוחיות קפואים חפוז עם RNAlater, להוסיף 1 מ&quot;ל RNAlater כדי cryovial כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לוחות הנתיחה של בטיחות ביולוגית מכסה המנוע ואת צמרות הדלפק עם מכשירים הנתיחה מעוקרות (מלקחיים, אזמלים, להבים, פדי גזה (4x4)), כמו גם קלטות ותבניות אוקטובר מסודרים לפי סדר השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין אמבטיה קפוא על ידי הצבתקרח יבש בתוך קופסת קלקר בגודל בינוני (10x10 ס&quot;מ) עד לעומק של לפחות 3 ס&quot;מ ומוסיפים isopentane עד קרח יבש מכוסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: מילוי מיכל קטן דיואר עם חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הלבלב דרוש במיקרוסקופ אלקטרונים (EM), להכין מקבע TAAB ידי הוספת 1.25 paraformaldehyde מ&quot;ל 16%, 1.25 glutaraldehyde מ&quot;ל 8% ו 7.5 מ&quot;ל 0.1M PBS. הכן מקבע Lowicryl ידי הוספת 2.5 מ&quot;ל paraformaldehyde 16% עד 7.5 מ&quot;ל 0.1M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין פתרונות המשמשים לבידוד תאים. בקבוק 500 מ&quot;ל של DMEF (עם גלוטמין), בצע את טכניקות אספטיים תוך הוספת הבאה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסרום שור עוברית (FBS): הוסף 50 מ&quot;ל, 10% הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פניצילין / סטרפטומיצין (עט / דלקת, 10,000 יח&#39; / מ&quot;ל ​​/ 10000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​המלאי) - להוסיף 5 פן / דלקת המניות מ&quot;ל כדי RPMI ריכוז סופי של 100 U / mL / 100ug/mL. גם להוסיף 5 מ&quot;ל בקבוק 500 מ&quot;ל של DPBS כאשר נעשה שימוש לקיום קשרי הלימפה או דוגמאות הטחול. </li></ol></li></ol> 2. כוח אדם <oאני&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההליך מתבצע בצורה אופטימלית עם שלושה אנשי צוות יחד עם זאת ההליך יכול להתנהל עם אדם אחד מאומנים היטב. שני אנשים יכולים בדרך כלל, להשלים את ההליך ב -90 דקות. משך בפועל תלויה במספר רקמות שהתקבלו וקלות מציאת בלוטות הלימפה הלבלב. דוגמאות עבור isolations התא מתקיימים 4 ° C עד תום לנתיחה רקמות תוך דגימות סרום מעובדים במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , הפתולוג עוזר פתולוגיה, או שווה ערך, חבר צוות מנוסה מוביל טיפול רקמות ומבצע והניתוחים הגדולות, כולל חלוקה (ים) של ראש הלבלב והקציר בלוטות הלימפה הלבלב. המאמצים הראשונים מכוונים הלבלב ואחריו בדיקה של שומן פרי, הלבלב עבור בלוטות הלימפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טכנולוג מעבדה או שווה ערך, חבר צוות מאומן רקמות זמירה שאת האחריות העיקרית יש לשקול הלבלב אזורים ורקמות לקצץ עבור בלוקים קבועים קפוא עבור הצמד V קפואials. התריסריון מקבל והטחול מ עוזר פתולוגיה תהליכים אלה איברים תוך עוזר הפתולוגיה הוא עיבוד הלבלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוזרו, צוות המעבדה חבר המסייע השאר, כולל גוש וסימון הבקבוקון, מדגם המכובדת של cryovials, ועיבוד בסרום. </li></ol> 3. הלבלב Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התריסריון והטחול ולנקות את הלבלב של שומן, כלי זרים, והעצבים באמצעות דיסקציה בוטה וחד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הלבלב ניקה על לוח לנתח מכוסה במגבות נייר. טובלים צמר גפן המוליך שקצהו בדיו התפשטות כחול על פני השטח הקדמי של הלבלב. למחוק את העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: טובלים המוליך החדש בדיו התפשטות שחור על פני השטח האחורי של הלבלב. חזור הלבלב לכיוון הרגיל עם השטח הקדמי מול prosector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הלבלב ל 3 אזורים: ראש, גוף וזנב (איור 1). חותכים את הצומת בין heaד והגוף מכן לחלק את החלק הנותר ~~~HEAD=NNS חלקים שווים של הגוף והזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את כל האזור של משקולות הלבלב שיא (מקרה הבדיקות גיליון ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">נספח 1</a> )). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף (~~~HEAD=NNS 0.5 ס&quot;מ) כל האזור של הלבלב ב באופן רוחבי &quot;כיכר הלחם&quot; (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסעיפים משני צמתים בין אזורים עבור דגימות טחון. בהתאם לגודל הלבלב, מדגם מאזור גוף זנב בצומת עלול להיות קשה להשיג במקרה זה את מספר אבני פרפין יכול להיות ירידה להשיג דגימות קצוצים או דוגמאות בלבד מאזור הלבלב ראש הגוף ניתן להשיג. תווית cryovials לפי ראש או גוף לציון באזור הפרוקסימלי בצומת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשר טחון החלקים ולחלק שווה בשווה בין cryovials (≥ 1 גרם לכל בקבוקון). במהירות להקפיא צלוחיות ללא RNALater בחנקן נוזלי או קרח יבש - slurry isopentane מכן להעביר tOA -80 מעלות במקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על צלוחיות עם RNALater בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, כדי לאפשר איזון, רמיקס במהירות להקפיא בחנקן נוזלי או slurry קרח יבש isopentane מכן להעביר את המקפיא -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של חלקים מתחלפים עבור פרפין וחוסם אוקטובר החל פרפין (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להישען על כל הסעיפים רוחביים ימינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ~ 1.5 x 1.5 x 0.5 ס&quot;מ סעיפים הקלטות. אם בסעיפים רוחביים הם גדולים מדי, בחצי (איור 2b). לייבל הקלטות למחצית הקדמי כחול &quot;&quot; וחצי האחורי כמו &quot;B&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החלקים עדיין גדול מדי, מנותק מדי בניצב סעיף לקיצוץ הקודם (איור 2 ג). קלטות תווית לספירה באופן כיוון השעון. חתוך לחתיכות הדרושים נוספת כדי להתאים קלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר בלוקים ברצף בתוך האזור, החל בחלק המדיאלי ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בלוקים פרפין, עמדה גassettes כך התווית היא שמאלה במקום רקמות לתוך קלטת, שמירה על האוריינטציה שלו. המכסה סגור קלטת והעברת למיכל עם ~ 500 מ&quot;ל 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין (NBF). התחל קיבעון העיתוי כאשר את הקלטת האחרונה ממוקם מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בלוקים לאוקטובר, יוצקים שכבה דקה של אוקטובר מדיה לתוך תבנית prelabeled ואז להניח את רקמות עובש להיות בטוח כדי לשמור על האוריינטציה ומכסים רקמות עם אוקטובר לטבול במהירות את תבניות אוקטובר בקרח יבש - slurry isopentane דקה 1 ~. הסר slurry ומניחים על קרח יבש לאחסון זמני או -80 ° C במקפיא לאחסון ארוך טווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ~~~HEAD=NNS 0.5 x 0.5 ס&quot;מ פרוסות מצומת ראש הגוף של מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM). מקום אחד פרוסה מקבע TAAB ו פרוסה אחר מקבע Lowicryl. אחסן את שני סוגי מקבע עם דגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 48 שעות ו / או ללא הגבלת זמן עד עיבוד נוסף עבור EM. </li></ol> 4. , טחול לימפה הצומת Dissecולהמליץ ​​רירית התריסריון והניתוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את בלוטות הלימפה הלבלב (PLN) משומן לקצץ את כל רקמת החיבור אל הקפסולה הצומת. מקום בצלחת סטרילית התרבות התא המכיל DMEF. בהתאם המספרים הכוללים מבודדים, לחלק PLN אל aliquots עבור משלוחי טריים, isolations סלולריים cryopreserved, פרפין / או בלוקים לאוקטובר, ואת צלוחיות. בשר טחון צמתים גדולים לחתיכות לא גדולות יותר מ -0.5 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשר טחון הלבלב ללא בלוטות לימפה וטחול אל ~~~HEAD=NNS (0.5 ס&quot;מ) לקוביות קטנות. מקום מקבע, אוקטובר מדיה, או DMEM למשלוחים מדגם טריים או isolations סלולריים cryopreserved לפי כמויות של חומרי המוצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התריסריון בעדינות לנגב את רירית התריסריון נקי של ריר עם כרית גזה לח. לחתוך קטעים של רירית עבור פרפין ו / או קפואים אבני אוקטובר דגימות טחון על צלוחיות, עם ובלי RNAlater. להקפיא כמו דוגמאות אחרות. </li></ol> 5. לעטוף בנייר כסף אוקטובר בלוקים מראש שכותרתו אלומיניום ומניחים אבני אוקטובר ו<html> צלוחיות בתיבות עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות ג 6. שלח דוגמאות קבוע עבור עיבוד פרפין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון רקמות במשך 16 שעות (טווח של 20 ± 4 שעות) באמצעות מעבד פרפין אוטומטית או ידנית באמצעות תזמון. תהליך רחובות פרפין באמצעות מעבד אוטומטי ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">נספח 2</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ סעיפים בכיוון המדויק כפי שבוצעה על ידי prosector עם תווית קלטת משמאל. להטביע את רירית התריסריון עם משטח חיתוך למטה על מנת לאפשר בדיקה של ניצב רירית כדי submucosa. </li></ol> 7. יש לנקות ולחטא תחומים הנתיחה. לשטוף כלים הנתיחה מחדש לחטא. מניחים רקמות שריד האדם מקבע פורמלין לאחסון כפסולת ביו. מחק פסולת ביו פי התקנות המקומיות תוך חודש. 8. לעדכן את מערכת מלאי לדוגמא ve_title &quot;&gt; 9. נציג תוצאות הליך זה יהיה תהליך הלבלב האנושי שלם עם מדגם מייצג לאורך כל איבר כולל סימון של שלושה אזורים מרכזיים, כלומר, הראש, הגוף והזנב תוך 2 שעות. האזור אונקלי, נמצא באזור הראש האחורי, נכלל לנתיחה הראש. משקל הלבלב החציוני תורמים איברים ללא סוכרת היה 82.4 גרם (52.7 - 139.0 גרם). משקולות הלבלב אזוריות היו שווים כ (איור 3). הליך זה יכול גם לאפשר את שיקומה של הלבלב כולו באמצעות שקופיות מוכתמים מן פרפין רציף וחוסם אוקטובר. בפורמטים מרובים הם ריאלי המאפשר ניצול מרבי של טכנולוגיות הנוכחיים והעתידיים. בגליון הנוכחי במקרה nPOD מסופק ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">נספח 1</a> ) המשמש לתעד דוגמאות התאושש proc לאחר מכןessing ידי aliquot סוגים וכמויות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> באיור 1. התוכנית הכוללת של ההליך. הלבלב כולו מעובד תוך שמירה על נטיות אנטומיים. באזור הראש ארוך בציר מעולה, נחות בשל נוכחותם של האונה הלבלב הגחון באזור האחורי הכולל את האזור אונקלי. אזור בקעו בצמתים לציין אזורים המשמשים דגימות קצוצים cryovials. P, פרפין, O, אוקטובר <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> איור 2. ערכת האותיות של סעיפים הלבלב. פרוסות הלבלב רוחביים ניתן לחלק לחצאים או לרבעים ו בכתב בצורה כיוון השעון. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> איור 3. הלבלב משקולות איברים מתורמים ללא סוכרת. אתהלבלב שלם מתורמים מבוגרים (&gt; 17 שנים) נשקל מכן מחולקים לאזורים ומשקולות אזוריים שהתקבלו. הנתונים הם ממוצעים ± SEM (N = 15).

<ol><li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li>
<li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas%3A+the+effects+of+age+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li>
<li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas%3A+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatobiliary+Pancreat.+Surg%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li>
<li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+concentration+in+the+head%2C+body%2C+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li>
<li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li>
<li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst.+Monogr%22%5BJournal%5D)">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li>
<li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li>
<li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+%CE%B2-cell+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li>
<li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li>
<li>Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

מטרת נוהל זה היא להגדיר עיבוד הלבלב הרגיל יכול להיות המתואמת פני אתרים מרובים איסוף ובכך לאפשר השוואה של התוצאות שהושגו על ידי קבוצות שונות. שיטת לנתיחה מבוסס על תקן נהלי הפתולוגיה כירורגית עם צעדים נוספים ביאור האזורים הלבלב העיקריים ואחריו התוך אזוריים יחידות משנה. סטנדרטיזציה של שיטות עיבוד biospecimen נדרש כדי להקל על איסוף דגימות באיכות גבוהה המייצגים אותו פרסום של שיטות עבודה מומלצות עבור אוסף biospecimen מארגונים biobanking לאומיים כגון סרטן 6. Biobanking של דגימ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> דיסקציה מכשירים כולל אזמלים עם 22 להבים </td><td> שונים </td><td> שונים </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגות מבחנות (15 ו - 50 מ&quot;ל) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 05-539-5, 430828 </td><td> סטרילי </td></tr><tr><td> Cryotubes (1.8 מ&quot;ל) </td><td> VWR בצפון אמריקה </td><td> 89004-300 </td><td> סטריליים, בר קודים אופציונליים </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> דיו פתולוגיה כירורגית </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> קלטות </td><td> מרצדס רפואי </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 10% ניטרלי שנאגרו פורמלין </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> אוקטובר Media הקפאת </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> תבניות </td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td> בגדלים שונים </td></tr><tr><td> Isopentane </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> O3551-4 </td><td> אוקטובר מצמרר אמבטיה </td></tr><tr><td> קרח יבש </td><td></td><td></td><td> אוקטובר מצמרר אמבטיה </td></tr><tr><td> חנקן נוזלי בבקבוק ויסקי </td><td></td><td></td><td> הצמד cryovials הקפאת </td></tr><tr><td> תרבות צלחת תא (100 מ&quot;מ) </td><td> קורנינג </td><td> 430167 </td><td> סטרילי </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> חנות סטרילית, בקירור, כולל גלוטמין </td></tr><tr> &lt;td&gt; בסרום שור עוברית </td><td> Cellgro </td><td> 35-010-CV </td><td> סטריליות, aliquots קפואים חנות </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין / פטריות </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> סטריליות, aliquots קפואים חנות </td></tr><tr><td> הקלד 9 פרפין </td><td> ריצ&#39;רד אלן, מדעי </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1X D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> סטרילי </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> EM למדעים </td><td> 15710 </td><td> להפוך את החנות טרי, בקירור </td></tr><tr><td> 8% Glutaraldehyde </td><td> EM למדעים </td><td> 16019 </td><td> להפוך את החנות טרי, בקירור </td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית רמה 2 מכסה המנוע </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נמוך במיוחד במקפיא </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קלטת סאקורה מדפסת </td><td> סאקורה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סאקורה VIP300 </td><td> סאקורה </td><td></td><td> פרפין אוטומטי מעבד </td></tr><tr><td> הטבעה פרפין תחנה </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים ספציפיים וציוד.

אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

Collection Protocol for Human Pancreas

דיסקציה זה הליך הדגימה שפותח עבור רשת לעוגב תורמים הלבלב עם תוכנית (nPOD) סוכרת לתקנן הכנת הלבלב התאושש תורמי איברים מוות. הלבלב מחולק ל -3 אזורים עיקריים (ראש, גוף, זנב) ואחריו חלקים רוחביים סדרתי ברחבי המדיאלי על ציר לרוחב. חלקים מתחלפים משמשים פרפין קבוע בלוקים קפואים טריים דגימות שריד הם טחון עבור הצמד ההכנות מדגם קפואים, עם או בלי RNAse מעכבי, כי ה-DNA, RNA, או בידוד חלבון. המטרה הכללית של ההליך לנתיחה הלבלב הוא לדגום את הלבלב כולו, תוך שמירה על הכיוון אנטומי. תא האנדוקרינית הטרוגניות מבחינת הרכב גודל איון,, ומספרים מדווח על איים אדם לעומת איים מכרסמים 1. רוב איים אדם מן הראש הלבלב, אזורי הגוף והזנב מורכבים containin אינסוליןגרם בטא תאים ואחריו פרופורציות נמוכות יותר של גלוקגון, המכיל אלפא-תאים ו somatostatin המכילים δ-תאים. פוליפפטיד המכיל תאים בלבלב PP ו גרלין המכילים תאים אפסילון גם כיום, אך במספרים קטנים. לעומת זאת, האזור מכיל אונקלי איים אשר מורכב ברובו פוליפפטיד המכיל תאים בלבלב עמ &#39;2. אלה וריאציות אזוריות איון נובעים הבדלים התפתחותיים. הלבלב מתפתחת ניצנים הלבלב הגחון ועל הגב ב במעי הקדמי ואחרי סיבוב של הקיבה והתריסריון, המהלכים באונה הגחון ומתאחה עם הגב 3. האונה הגחון מהווה את החלק האחורי של הראש כולל את תהליך אונקלי בעוד האונה הגב מעורר שאר האיברים. וריאציה הלבלב האזורית מדווח גם באזור הזנב בעל צפיפות גבוהה יותר איון בהשוואה לאזורים אחרים באונה הגבית הנגזרות רכיבים שעברו ניוון סלקטיבית של סוכרת מסוג 1 <sאת&gt; 4,5. איברים ורקמות נוספות הם התאוששו לעתים קרובות התורמים איברים וכוללים הלבלב בלוטות לימפה, טחול שאינם הלבלב בלוטות הלימפה. דוגמאות אלה הם התאוששו עם תבניות דומות של הלבלב עם תוספת של בידוד של תאים cryopreserved. כאשר התריסריון הפרוקסימלי כלול הלבלב, רירית התריסריון ניתן לאסוף עבור חוסם פרפין קפוא ותכשירים הצמד טחון קפוא.

סרט הווידאו הזה מדגים הליך לנתיחה לעיבוד הלבלב האנושי לתוך תבניות אחסון מרובים. אוריינטציה אנטומי נשמר לאורך כל האזורים הלבלב כדי לאפשר הגדרת הרכב איון הצפיפות באזור.

פרוצדורת הנתיחה ודיגום הדגימות זו פותחה עבור תוכנית הרשת של תורמי איברים עם סוכרת בלבלב (nPOD) כדי להבטיח הכנה סטנדרטית של...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע נתיחה של הלבלב האנושי באופן השומר על האוריינטציה האנטומית. הדבר מושג על ידי הסרת התריסריון והטחול מהלבלב, ולאחר מכן פינוי שומן וכלי דם עודפים מהלבלב. השלב השני הוא צביעת המשטח הקדמי בדיו כחול והמשטח האחורי בדיו שחור.בשלב הבא, הלבלב מחולק לשלושה אזורים. כל אזור נחתוך לאחר מכן במקטעים רוחביים לפרוסות שוות ומונח בתוך קסטות פאראפין, תבניות OCT, או קצוץ עוד יותר ומונח בתוך מבחנות. לבסוף, נדגמים דגימות מכל שלושת האזורים של הלבלב, תוך שמירה על האוריינטציה האנטומית הנכונה לצורך ניתוח עתידי.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר על סוכרת מסוג 1, כגון המנגנונים העומדים בבסיס האובדן של מסת תאי בטא, או תפקודם, ואופיים של התקפות תאי מערכת החיסון. הדגמה חזותית של שיטת עיבוד הלבלב היא קריטית, שכן שמירה על האוריינטציה של הלבלב כפי שהייתה in vivo דורשת תשומת לב לפרטים. את הפרוצדורה ידגימו לינדה סניידר, טכנולוגית היסטולוגית, ואמילי מונטגומרי, מדענית ביולוגית במעבדתי.התחילו בהכנת כל החומרים הדרושים לפרוצדורה. ראשית, סמנו את הקסטות שיכילו את בלוקי הפראפין עם מזהה התורם, סוג הדגימה, מספר האליקוואוט וכל מידע נוסף. לאחר מכן, סמנו את תבניות ה-OCT באופן דומה.גזרו מספיק חתיכות של נייר אלומיניום כדי לעטוף כל בלוק OCT והניחו אותן בצד לשימוש מאוחר יותר. הכינו את כל המבחנות הדרושות לאחסון הדגימות הטריות והקפואות. הוסיפו RNA later ומצע RPMI לפי הצורך.בשלב הבא, הכינו את אזורי העבודה, והניחו לוחות ניתוח, מכשירים סטריליים וכל שאר הציוד הדרוש לפרוצדורה הן בתוך מנדף בטיחות ביולוגית והן על משטח העבודה. סדרו את כל הקסטות ותבניות ה-OCT לפי סדר השימוש, במקום נגיש. הכינו אמבט הקפאה על ידי הוספת isop pentane בכמות מספיקה כדי לכסות את הקרח היבש בתחתית של קופסת פוליסטירן.כדי להתחיל בנתיחה, הסירו את התריסריון ואת הטחול. התחילו בהפרדת התריסריון והלבלב מקצה אחד, והמשיכו עד להפרדה מלאה. הטחול מחובר באופן רופף וניתן להסירו בקלות מהשומן ומהלבלב.בשלב הבא, נקו את הלבלב משומן מיותר, כלי דם ועצבים באמצעות שילוב של דיסקציה קהה וחדה. הניחו בצד את השומן ואת קשרי הלימפה לעיבוד מאוחר יותר. לאחר הניקוי, הניחו את הלבלב על לוח דיסקציה המכוסה בנייר סופג.שמירה על האוריינטציה הנכונה של הלבלב היא ההיבט הקשה ביותר בפרוצדורה זו. כדי להבטיח הצלחה, צובעים את המשטחים הקדמי והאחורי בדיו בצבעים שונים. טבלו מקל עם טיפ cotton-tipped בדיו כחול, מרחו את הדיו על המשטח הקדמי של הלבלב וספגו את העודפים.לאחר מכן, טבול אפליקטור חדש בדיו שחור ומרח אותו על פני השטח האחוריים של הלבלב. החזר את הלבלב למנחו הרגיל. כאשר פני השטח הקדמיים פונים כלפי מעלה, הלבלב מוכן כעת לחיתוך לשלושה חלקים.ראשית, חיתכו את החיבור בין הראש לגוף. לאחר מכן, חלקו את החלק הנותר למקטעים שווים בקירוב כדי להפריד בין הגוף לזנב, ורשמו את משקלו של כל אזור בלבלב. התחילו במקטע הראש.חלקו כל אזור למקטעים של כ-0.5 סנטימטר על ידי חיתוך בצורה רוחבית, בדומה לחיתוך כיכר לחם. לאחר שכל אזור בלבלב נחתך, הסירו את המקטע האחרון של אזור הראש, שהוא מקטע נקודת החיבור בין הראש לגוף, והניחו אותו על לוח ניתוח נפרד. קצצו מקטע זה לחתיכות קטנות וחלקו את החתיכות באופן שווה בין מבחנות קריו מסומנות, עם ובלי RNA.בהמשך, המבחנות יוקפאו. יש לפעול לפי הפרוטוקולים הסטנדרטיים. חזר על הליך זה עבור אזור החיבור בין הגוף לזנב.לאחר איסוף הדגימות הגרוסות, הטה את כל החתכים הרוחביים ימינה. חתכים לסירוגין מכל אזור יוסרו. עבור בלוקים של פאראפין ו-OCT, הסר את החתך הראשון עבור חסימת פאראפין.אם חלק גדול מדי, חתכו אותו לחצי. סמנו את הקסטות כ-A ו-B. אם החלק עדיין גדול מדי, חתכו כל חלק בניצב לחתך הקודם, ולאחר מכן סמנו את הקסטות A עד D באופן סיבובי עם כיוון השעון. כפי שניתן לראות כאן, מקמו את הקסטה כך שהתווית תהיה משמאל.בשלב הבא, מקמו את הרקמה בתוך הקסטה וסגרו את המכסה. העבירו את הקסטה למכל containing neutral buffered formalin. מספרו את הבלוקים ברצף בתוך כל אזור, כאשר תתחילו מהחתך המדיאלי ביותר עבור בלוקים של OCT.שפכו שכבה דקה של מצע OCT לתוך תבנית מסומנת מראש. לפני הכנסת הרקמה, כסו את הרקמה במצע OCT והקפיאו במהירות את הדגימה לשימוש מאוחר יותר, תוך חזרה לרקמה שהופרשה קודם לכן. בודדו את קשרי הלימפה הלבלביים על ידי הסרת השומן והרקמה החיבורית המקיפה את קפסולת הקשרית. הניחו את הקשריות בתוך כלי סטרילי המכיל DMEF וקצצו קשריות גדולות לחלקים שגודלם אינו עולה על 0.5 סנטימטרים.לאחר בידוד קשרי הלימפה הלבלביים, חלק את הרקמה בין המבחנות והקסטות שהוכנו לעיבוד המשך. לאחר סיום הטיפול בקשרי הלימפה, קצץ את הטחול ואחסן אותו באופן דומה. לעיבוד התריסריון, השתמש ברפידה גזה לחה כדי לנקות את הרירית מהריר, גזור את הרירית ולאחר מכן חתוך אותה למקטעים.חלקו את דגימות הרירית כפי שהודגם קודם לכן. באמצעות הליך זה, נאספות דגימות מייצגות מכל אזור בלבלב כפי שניתן לראות כאן. המשקלים של אזורי הראש, הגוף והזנב היו שווים בקירוב.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה לגבי האופן שבו יש לעבד לבלב אנושי לסוגי דגימות שונים, ובפרט את היכולת לשמור על האוריינטציה של האיבר, וכן כיצד לבודד קשרי לימפה מהשומן הפרי-פנקראטי (peripancreatic fat).

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון האדם הלבלב (אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב) בשיטה אוטומטית שונה.

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון הלבלב האנושי (חלק II: טיהור והתרבות של איים אדם) באמצעות שיטה אוטומטית שונה.

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

אספקת 2 איים סוכרת סוג למחקר אינה מספיקה. כאן אנו חולקים פרוטוקול שלנו לבידוד איים של חולים שעברו pancreatectomy חלקית. גישה זו מהווה מקום מפגש ייחודי לקבלת איים של סוכרת מסוג 2 שאינם מתאימים קלינית סוכרת הנושאים במספרים נאותה מחקרים בסיסיים וקליניים.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

סרט הווידאו הזה מדגים נהלים ואפיון של איים הלבלב אדם באמצעות hematoxylin ו eosin (H &amp; E) ו אימונוהיסטוכימיה (IHC). סעיפים הלבלב מן הראש, הגוף, באזורים הזנב מוכתמות על ידי שני H &amp; E ו-IHC לקבוע הרכב האנדוקרינית איון (אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד), שכפול תאים (Ki67), וכן מחלחל דלקתיות (H &amp; E, CD3). האזור אונקלי הוא מקומי באמצעות IHC של הלבלב פוליפפטיד.

הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם

פרוטוקול לבודד, אשכולות תאי איון התרבות, ותמונה (ICCS) שמקורם בתאי לבלב עובריים אנושיים מתואר. השיטה מפרטת את הצעדים הדרושים כדי ליצור ICCS מרקמות, תרבות כמו monolayers או בהשעיה כאגרגטים, ותמונה לסמנים של התפשטות וגורל החלטות תא לבלב.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

כאן, אנו מציגים פסיבים פרוטוקול לסעיפים לבלב אנושי התמונה בתלת מימד (3D) באמצעות אופטימיזציה ניקוי שיטות. כתב יד זה מדגים אלו נהלי סליקה אופטי פסיבי ואחריו מספר immunofluorescence מכתים לזהות את המרכיבים העיקריים של אוטונומי, חושי רשתות עצביות innervating אנושי איונים.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של הרשת נוירו-סקסיסטית לבלב אנושי

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאי הלבלב איון העכבר לסינון את inductions ROS מאת ואינטראקציות על מנת לזהות פוטנציאל diabetogenic xenobiotic כימיקלים.

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה סינכרונית ורישום משותף של אירועי איתות תוך תאיים והפרשת אינסולין וגלוקגון על ידי פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים באמצעות העברה אדנו-ויראלית של ביו-סנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP), גלאי הפרשי cAMP באתרו (cADDis) ומערכת מיקרופריפיוזיה.

מערכת פסאודואיסלט אנושית להערכה סינכרונית של דינמיקה ביו-חיישנית פלואורסצנטית ופרופילי הפרשת הורמונים

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לקציר כירורגי, עיכול אנזימטי וטיהור גרדיאנט צפיפות של איי הלבלב של עכברוש לואיס, המאפשר הכנות בעלות תפוקה גבוהה וטוהר לשימוש ישיר בהשתלות או במחקרים במבחנה .

בידוד וטיהור איי הלבלב מחולדות לואיס באמצעות עיכול אנזימטי והפרדה בין צפיפות לגרדיאנט

למדו את שיטת הניתוח של הלבלב האנושי תוך שמירה על ההתמצאות האנטומית. השיטה מאפשרת איסוף דגימות משלושת אזורי הלבלב לניתוח הרכב איי לנגרהנס וצפיפותם במחקר סוכרת.

אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

גלה סרטונים נוספים