Name: פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: למד שיטה יעילה לייצור חלבונים מופרשים מתאי כליה עובריים אנושיים 293T. הפרוטוקול מאפשר ביטוי חלבונים רקומביננטיים בכמויות מיליגרם ובקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי HIV רשת אונטריו טיפול מחקר הפעלה גרנט (ROG-G645) וקנדה מכון פרס מחקר לחוקר הבריאות החדש (MSH-113554) כדי JEL, ואוניברסיטת טורונטו מלגות חה, FCA, וג&#39;וינט. המחברים מבקשים להודות מארני Fusco, דפנה אבלסון וד&quot;ר אריקה Ollmann Saphire במכון המחקר סקריפס (La Jolla, CA) עבור תאים המספקים, ebolavirus וקטור GP ביטוי וייעוץ כללי.

<ol><li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li>
<li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li>
<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li>
<li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li>
<li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric%2C+prefusion+Ebola+virus+GP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li>
<li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression%3A+developments+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li>
<li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li>
<li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li>
<li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha%2C+beta%2C+and+gammac+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

את 10-שכבת מפעלים סלולריים הם כלי יעיל לייצור כמויות מיליגרם של חלבון. היתרון הגדול של שימוש מפעל התא על כלי מסורתיים אחרים, כגון בקבוקים, צלוחיות הרים לוחצים או צלוחיות תיבת הטווח, היא שהם אינם דורשים רכישת ציוד מעבדה נוספת. תקן ה-CO 2 באינקובטור (~~~HEAD=NNS 6.0 מ&quot;ק. מטר) יהיה בקלות להכיל ארבעה 10-שכבת מפעלים סלולריים (איור 2). בנוסף, הכלים האלה דורש עבודה פחות שטח מאשר צלחות, צלוחיות או בקבוקים הרים לייצר תאים וחלבונים, 1 10-שכבת מפעל התא הוא שו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אלקליין phosphatase (BCIP / NBT) מצע נוזלי פתרון </td><td> סיגמא </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה / Antimycotic, 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA זיקה מטריקס, שיבוט 3F10 </td><td> רוש </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA Murine MAB, שיבוט 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> תרבות בקבוק נייד, T75 2 ס&quot;מ תרבות רקמות טיפול </td><td> קורנינג </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות בקבוק נייד, T225 2 ס&quot;מ תרבות רקמות טיפול </td><td> קורנינג </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>תרבות צלחות סלולריים ,6-גם תרביות רקמה טיפול </td><td> קורנינג </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> מפעל נייד, 10-שכבת CellSTACK </td><td> קורנינג </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate אומגה 5K קלטת </td><td> אריג אבל </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate אומגה 30K קלטת </td><td> אריג אבל </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> עמודות כרומטוגרפיה זכוכית, 1.0x10 ס&quot;מ </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> ציפרופלוקסאצין </td><td> סיגמא </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> שונה Dulbecco של הנשר של התקשורת (DMEM) </td><td> סיגמא </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית (FBS), חום מומת </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE HD מגיב transfection </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice מגיב transfection </td><td> EMD / מרק </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> גליצין </td><td> סיגמא </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> נגד העכבר עיזים IgG ו &#39;(&quot;א.ב.) 2 אלקליין </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> phosphatase-מצומדות נוגדן </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemagglutinin (HA) פפטיד, 100 מ&quot;ג </td><td> Genscript </td><td> אישית סינתזה </td><td></td></tr><tr><td> (רצף: YPYDVPDYA, טוהר 95%) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T תאים </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Householד אקונומיקה (4% w / v hypochlorite נתרן) </td><td> מותגים שונים זמינים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF הממברנה </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep ערכת טיהור פלסמיד, PureLink מהירה </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrep ערכת טיהור פלסמיד, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> 3 NaN </td><td> סיגמא </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> הביטוי pDISPLAY וקטור </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין (עט / דלקת), 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט בופר סליין (PBS), סטרילית 1X </td><td> סיגמא </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethyleneimine (PEI), ליניארי 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> אבקת חלב רזה יבש </td><td> צפורן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP ואקום PES סינון יחידה, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 מיקרומטר, 500 מ&quot;ל קיבולת </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין, EDTA, 0.05% (w / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> סיגמא </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה ולפרואית </td><td> סיגמא </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate מערכת זרימת משיק </td><td> אריג אבל </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 באינקובטור humidified, תקן 6.0 מ&quot;ק. מטר </td><td> מותגים שונים זמינים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אלקטרופורזה והעברת היחידה </td><td> מותגים שונים זמינים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> החממה, 37 ° C </td><td> מותגים שונים זמינים </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

רקומביננטי ביטוי החלבון חיידקים, בדרך כלל א &#39; coli, הייתה האסטרטגיה המוצלחת ביותר עבור ביטוי בכמות מיליגרם של חלבונים. עם זאת, המארחים פרוקריוטים הם לעתים קרובות לא בהתאם ביטוי של חלבונים אנושיים, ויראלי או האיקריוטים בשל הרעילות של מקרומולקולה החוץ, ההבדלים מכונות קיפול חלבונים, או בשל חוסר שיתוף שינויים או שלאחר translational מסוימים של חיידקים. מערכות ההבעה על בסיס שמרים (pastoris פ או cerevisiae ס) 1,2, baculovirus-נגוע חרק (ס &#39;frugiperda או ט&#39; ני) 3 תאים, תא ללא במבחנה תרגום מערכות 2,4 שימשו בהצלחה לייצר חלבונים יונקים. באופן אינטואיטיבי, את ההתאמה הטובה ביותר היא להשתמש המארח יונקים על מנת להבטיח את הייצור של חלבונים רקומביננטיים המכילים הנכון לאחר שינויים של תרגום. מספר שורות תאים יונקים (קיד עובריים אנושייםניי (HEK) 293, C-V-1 התאים O rigin הנושאים V40 S larget T-antigen (COS), השחלות אוגר סיני (CHO), ועוד) כבר נוצלו בהצלחה overexpress כמויות מיליגרם של מספר חלבונים אנושיים 5-9. עם זאת, היתרונות של שימוש בתאי יונקים הם לעתים קרובות הגיב עלויות גבוהות יותר, הדרישה של ציוד מעבדה מיוחד, תשואות נמוכות יותר חלבון, ושעות ארוכות לפתח יציבות התא קמטי הבעה. הגדלת התשואה חלבונים לייצר מהר יותר, תוך שמירה על עלויות נמוכות, הם הגורמים העיקריים למעבדות אקדמיים ומסחריים רבים. כאן אנו מתארים זמן ועלות יעיל, חלק 2, הליך לביטוי של חלבונים המופרשים אדם חסיד תאים HEK 293T. מערכת זו הוא מסוגל לייצר מיקרוגרם כמויות מיליגרם של חלבון פונקציונלי ללימודי מבניים, biophysical ו ביוכימי. החלק הראשון, בונה רבות של הגן של עניין הם מייצרים<html> ד במקביל transfected זמני אל חסיד תאים HEK 293T בקנה מידה קטן. זיהוי וניתוח של חלבון רקומביננטי מופרש לתוך המדיום תרבית תאים מבוצע על ידי ניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית המכוונים נגד תג וקטור המקודד טיהור חלבונים. לאחר מכן, בונה מתאים לייצור בקנה מידה גדול חלבון transfected זמני באמצעות polyethyleneimine (PEI) ב -10 מפעלים שכבת תאים. חלבונים המופרשים לתוך ליטר למוצרי כרכים של המדיום אוויר מרוכזים לתוך כמויות לניהול באמצעות סינון זרימת משיק, ואחריו טיהור ידי כרומטוגרפיה נגד HA זיקה. השירות של פלטפורמה זו היא הוכחה על ידי היכולת שלו לבטא את כמויות מיליגרם של ציטוקינים, קולטנים ציטוקינים, קולטנים בתא השטח, גורמים פנימיים, וכן הגבלה גליקופרוטאינים ויראליים. בשיטה זו השתמשו בהצלחה גם בקביעת המבנה של 5,10 גליקופרוטאין trimeric ebolavirus. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; לסיכום, פלטפורמה זו מציעה מהירות וקלות שימוש, ויכולת הרחבה תוך מיקסום איכות החלבון ופונקציונליות. יתר על כן, הציוד ללא תוספת, למעט תקן humidified CO 2 באינקובטור, נדרשת. הליך זה עשוי להתרחב במהירות למערכות מורכבות יותר, כמו ביטוי משותף של קומפלקסים חלבונים, אנטיגנים ונוגדנים, ייצור של וירוסים כמו חלקיקים עבור חיסונים, או לייצור של adenoviruses או lentiviruses עבור התמרה של שורות תאים קשים.

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

ביטוי של חלבונים רקומביננטיים בחיידקים, ובמיוחד ב-E. coli, היה האסטרטגיה המצליחה ביותר להבעה של חלבונים בכמויות של מיליגרמים.

בסרטון זה, אנו מתארים פרוצדורה יעילה מבחינת זמן ועלות לביטוי של חלבונים מופרשים מתאי HEC 2 9 3 T. ראשית, מכינים תרבית תאי HEC 2 9 3 T בנשיאות של 40% בצלחת שש באריים. לאחר מכן, מכינים תערובת טרנספקציה על ידי דילול של gene juice, ולאחר מכן של פלסמידי הבדיקה, בתווך נטול סרום.תערובת הטרנספקציה מורססת על התאים, אשר לאחר מכן מדגגרים בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר ביטוי של חלבון. ניתן לבצע זיהוי של החלבון בנוזל העל (supernatant) באמצעות western blot. לאחר זיהוי קונסטרקט מתאים, ניתן להגדיל את קנה מידה של הפרוצדורה באמצעות מפעלי תאים (cell factories) של 10 שכבות.התאים עוברים טרנספקציה באמצעות PEI כחומר הטרנספקציה. ניתן לאסוף את החלבון מנוזלי העל של התרבית באמצעות סינון זרימה טנגנציאלית (tangential flow filtration) ולאחריו כרומטוגרפיית זיקה (affinity chromatography). בסופו של דבר, פלטפורמה זו מאפשרת ביטוי של מגוון רחב של מקרו-מולקולות בכמויות של מיליגרמים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביטוי בתאי חרקים המבוסס על נגיפי baculovirus, הוא שניתן לסנן מספר רב של מבנים (constructs) ולהגדיל את קנה המידה של הביטוי, כאשר התוצאות מתקבלות בתוך שלושה שבועות. את הפרוצדורה הזו ידגימו שדה זיני וג'ונתן קוק, שלושה סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. התחילו בזריעה של 250,000 תאי HEC 2 9 3 T לכל באר בנפח של 1 mL בתוך פלטה של 6 בארות. הוסיפו 1 mL לכל באר של DMEM מועשר ב-10% FBS ופניסילין-סטרפטומייסין, וסובבו את הפלטה כדי לפזר את התאים באופן שווה.לאחר מכן, דגרו את התאים למשך לילה באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. ברגע שהתאים מגיעים למסנכרנות (confluency) של כ-40%, החליפו את ה-SUP natum בשני milliliters של מצע טרי כדי להכין את תערובת הטרנספקציה. ראשית, העבירו מנה של 90 microliters של DMEM נטול סרום לשפופרת eend orph.לאחר מכן, הוסיפו 3 µL של gene juice, ריאגנט הטרנספקציה, ערבבו בעדינות את תוכן המבחנה והדגרירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL מתמיסת מלאי בריכוז 100 ng/µL של DNA פלסמידי מטוהר שנקבח בשיטת mini prep, להעברה בטרנספקציה.ערבבו את תכולת המבחנה והניחו לה לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי לבצע את הטרנספקציה, העבירו את התערובת על תאי HEC 2 9 3 T. טפטפו את התערובת טיפה אחר טיפה, תוך כדי ניעור עדין של הפלטה כדי להפיץ את תערובת הטרנספקציה באופן שווה.לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר 24 שעות, הוסיפו 1 mL של מצע טרי לכל באר ודגרו למשך 48 שעות נוספות. שלושה ימים לאחר הטרנספקציה, אספו את העלייה (supernatant) וזהו את רמות הביטוי של החלבון הנחקר באמצעות western blot.לאחר זיהוי קונסטרקט מתאים, ניתן להגדיל את קנה המידה של הליך הטרנספקציה. באמצעות מפעלי תאים של 10 שכבות, מלאו מפעל תאים ב-1.2 liters DMEM מועשר ב-5%FBS. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיליון תאי HEC 2 9 3 T, תוך חלוקה שווה של התאים לכל השכבות.ארבעה בקבוקי תרבית תאים מסוג T 225 סמ"ר שגדלו עד ל-100% התמלאות (confluency) מכילים כ-200 מיליון תאים. דגרו את התאים ב-37 °C למשך לילה. הכינו את תערובת הטרנספקציה בבקבוק T 75 על ידי דילול של 840 µg של DNA ב-84 mL של 1x PBS סטרילי.הוסיפו 2.5 milliliters של תמיסת polyethylene ion או PEI בריכוז של one milligram per milliliter, והדגירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. התמיסה אמורה להפוך לעכורה. לאחר מכן, שפכו באיטיות את תערובת הטרנספקציה אל תוך ה-cell factory ופזרו אותה באופן שווה.שכבות כלליות. הוסף חומצה ולפרואית בריכוז סופי של four millimolar. פעולה זו תגדיל את תשואי הביטוי לאחר הוספת תערובת הטרנספקציה.דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבעה ימים כדי לאפשר ביטוי של חלבונים. אספו את המצע ארבעה ימים לאחר הטרנספקציה ונקו מיד את מפעל התאים (cell factory) לצורך שימוש חוזר; סובבו את המצע שנאסף בצנטריפוגה ב-6,000 G למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, וסננו אותו באמצעות התקן סינון בוואקום עם קפסולת סטריליזציה של 0.22 micron כדי להסיר חלקיקים. לאחר מכן, השתמשו במערכת סינון זרימה טנגנציאלית (tangential flow filtration) מסוג CentraMate כדי לרכז את עליון התרבית (supernatant) ל-75 milliliters.לאחר ריכוז הנוזל העליון (supernatant), ניתן לטהר את החלבון המבוקש באמצעות כרומטוגרפיית זיקה (affinity chromatography). בניסוי זה, טיהרנו את תתי-היחידות המצומדות ל-HA של הדומיין החוץ-תאי של קולטני AAL two אנושיים באמצעות המערכת רחבת ההיקף המתוארת כאן, ולאחריה כרומטוגרפיה עם anti THA בעלת זיקה גבוהה. כפי שמוצג בניתוח SDS page זה, שנצבע ב-kumasi.הדומיינים החוץ-תאיים של תתי-היחידות אלפא וגמא של קולטן האינטרלוקין 2 נעים במשקלי מולקולריים של 40 kilodaltons ו-46 kilodaltons. ההטרוגניות של גליקנים מסוג EnLink הנוכחים ב-IL two R alpha וב-IL two R gamma גרמה להרחבת הפסים בגל ה-SDS page. הפס בעל המשקל המולקולרי הגבוה מייצג זיהום של BSA.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה של אופן ביטוי חלבונים מתרביות תאים אנושיים באמצעות מפעלי תאים בעלי 10 שכבות. זכרו כי תאי HC 2 93 T נחשבים לחומרים בעלי סיכון ביולוגי ויש לטפל בהם ברמת בטיחות ביולוגית 2. יש ללבוש תמיד ביגודי מגן אישיים מתאימים, ויש לחטא את המשטחים בהתאם להנחיות המוסדיות והממשלתיות.

a-convenient-general-expression-platform-for-production-secreted

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תפוקה גבוהה, פלטפורמה אוטומטית של פיתוח וייצור קו התא לייצור חלבונים ותרופות מתואר. יישום סדרן BD Cell Aria FACS, CloneSelect Imager וטקאן חופש מערכת EVO טיפול הנוזל הוכיחה יכולת עיבוד גדל באופן משמעותי בפיתוח קו התא עם איכות הקו השתפרה התא reproducibility גבוהה.

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

פרוטוקול של חמישה ימים זה מתאר את כל השלבים, ציוד ותוכנה נוספת דרושה ליצירה והפעלת מערכת ביטוי תא ללא TX-TL מאפס חיידקי Escherichia אנדוגני יעילים מבוססים. עם חומרים כימיים, הפרוטוקול לוקח 8 שעות או פחות להגדרת תגובה, לאסוף, ולעבד נתונים.

פרוטוקולים ליישום חיידקי Escherichia בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

יש לפתח חלבוני היתוך biotinylatable יישומים פוטנציאליים רבים בתחומים שונים של מחקר. הנדסת חלבון רקומביננטי היא הליך ישר קדימה כי הוא חסכוני, המספק תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד.

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

אנו מתארים כאן מערכת ביטוי גרנזים חסכונית המשתמשת בתאי HEK293T המייצרת תפוקות גבוהות של פרוטאז טהור, מסוכרר לחלוטין ופעיל אנזימטית.

תשואה גבוהה ומערכת ביטוי עלות-יעילה של Granzymes האדם בתאי יונקים

זהו פרוטוקול מהיר וחסכוני לייצור חלבוני יונקים מופרשים ומסוכררים וטיהור חד-שלבי לאחר מכן עם תפוקות מספיקות של חלבון הומוגני לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומחקרים ביופיזיקליים אחרים.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור ניצול של חרקים תא baculovirus חלבון ביטוי ומערכת לייצר כמויות גדולות של חלבונים צמח מופרש על התגבשות חלבון. וקטור ביטוי baculovirus השתנה עם GP67 או hemolin חרקים פפטיד אות לביטוי הפרשת חלבון צמחי בתאי חרקים.

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

פרוטוקול זה מפרט את השלבים, ' עלויות ' הציוד הנדרש לייצר e. coli-המבוסס על תמציות תא וליישם במבחנה תגובות סינתזת חלבון תוך 4 ימים או פחות. למנף את אופי גמיש הפלטפורמה עבור יישומים רחב, נדון תנאי ריאקציה, כי ניתן להתאים אופטימיזציה.

Escherichia coli-המבוסס על סינתזת החלבון ללא תא: פרוטוקולים עבור טכנולוגיית פלטפורמה חזקים, גמישים ונגישים

מחקרים מבניים וביוכימיים של מובילי ממברנות אנושיים דורשים כמויות מיליגרם של חלבון יציב, שלם והומוגני. כאן אנו מתארים שיטות ניתנות להרחבה לסינון, ביטוי וטיהור מובילי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים לקודון.

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

למד שיטה יעילה לייצור חלבונים מופרשים מתאי כליה עובריים אנושיים 293T. הפרוטוקול מאפשר ביטוי חלבונים רקומביננטיים בכמויות מיליגרם ובקנה מידה גדול.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

גלה סרטונים נוספים