פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

בסרטון זה, אנו מתארים הליך חסכוני בזמן ובעלות לביטוי חלבונים המופרשים מתאי Durant HEC 2 9 3 T. בתחילה, תרבית תאים 40% Cofluent HEC 2 9 3 T מוכנה בצלחת שש עולמות. לאחר מכן מיוצרת תערובת טרנספקציה על ידי דילול מיץ גנים, ולאחר מכן בדיקת פלסמידים במדיום נטול סרום.

תערובת הטרנספקציה מופקדת על התאים, אשר לאחר מכן מודגרים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר ביטוי חלבון. זיהוי חלבון בסוכן הסופאן יכול להתבצע על ידי כתם מערבי. לאחר זיהוי מבנה מתאים, ניתן להגדיל את ההליך באמצעות מפעלי תאי שכבה של 10

תאים עוברים טרנספקציה באמצעות PEI כטרנספקציה. ניתן לקצור ריאגנטים וחלבון מהתרבית באמצעות סינון זרימה משיקי ואחריו כרומטוגרפיה של זיקה. בסופו של דבר, פלטפורמה זו מאפשרת ביטוי של מגוון רחב של מקרומולקולות בכמויות של מיליגרם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון ביטוי תאי חרקים מבוסס נגיף באלו, הוא שניתן לסנן מספר רב של מבנים ולהגדיל אותם לביטוי עם תוצאות המתקבלות תוך שלושה שבועות. הדגמה של הליך זה תהיה שלום איידן עבור שאדה זיני וג'ונתן קוק. שלושה סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי מתחילים בזריעה של 250,000 תאי HEC 2 9 3 T לבאר בנפח של מיליליטר אחד בצלחת של שש בארות מוסיפים מיליליטר אחד לבאר של 10% FBS פנטרה בתוספת DMEM ו- S מסובבים את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה.

לאחר מכן דגרו את התאים למשך הלילה בחממת פחמן דו חמצני לחה של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאים מגיעים לשטף של כ-40%, החלף את ה-SUP natum בשני מיליליטר של מדיום טרי להכנת תערובת הטרנספקציה. ראשית ציטוט 90 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום בשפופרת orph.

לאחר מכן מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של מיץ גנים, מגיב הטרנספקציה מערבבים בעדינות את תוכן הצינור ודוגרים אותו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של 100 ננוגרם למלאי מיקרוליטר של הפלסמיד המטוהר המיני prep, DNA. לטרנספטציה.

מערבבים את תכולת הצינור ונותנים לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי לבצע את הטרנספקציה, הפקידו את התערובת על תאי HEC 2 9 3 T. טיפה אחר טיפה, נפח את הצלחת בעדינות כדי לפזר את תערובת הטרנספקציה באופן שווה.

לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. 24 שעות לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום טרי לכל באר ודגרו למשך 48 שעות נוספות. שלושה ימים לאחר הטרנספקציה, קצרו את הסופינט וזהו את רמות הביטוי של החלבון המעניין על ידי כתם מערבי.

לאחר שזוהה מבנה מתאים, ניתן להגדיל את הליך הטרנספקציה. באמצעות מפעלי תאים של 10 שכבות, מלאו מפעל תאים ב-1.2 ליטר DMEM בתוספת 5% FBS. לאחר מכן הוסיפו 200 מיליון תאי HEC 2 9 3 T, והפיצו את התאים באופן שווה לכל השכבות.

ארבע צלוחיות תרבית תאים בגודל 225 סנטימטר רבוע שגדלו ל-100% Co fluency מכילות כ-200 מיליון תאים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הכינו את תערובת הטרנספקציה בבקבוק T 75 על ידי דילול 840 מיקרוגרם DNA ב -84 מיליליטר סטרילי פעם אחת. PBS.

מוסיפים 2.5 מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר, תמיסת יון פוליאתילן או PEI, ודוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הפתרון צריך להיות מעונן. לאחר מכן, שפכו לאט את תערובת הטרנספקציה למפעל התאים והפיצו אותה ביסודיות.

שכבות כלליות. הוסף חומצה ולפרואית בריכוז סופי של ארבע מילימולר. זה יגדיל את תפוקת הביטוי לאחר הוספת תערובת הטרנספקציה.

דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים כדי לאפשר ביטוי חלבון. קצרו את המדיום ארבעה ימים לאחר הטרנספקציה ונקו מיד את מפעל התאים לשימוש חוזר בצנטריפוגה של המדיום שנאסף ב-6,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס וסנן אותו דרך מנגנון סינון ואקום סטרית של 0.22 מיקרון כדי להסיר כל חומר חלקיקי. לאחר מכן השתמש במערכת סינון הזרימה המשיקה של centra mate כדי לרכז את הסופרנטנט ל-75 מיליליטר.

לאחר ריכוז הסופרנטנט, ניתן לטהר את החלבון המעניין על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. בניסוי זה, טיהרנו את תת-היחידות המחוברות של התחום החוץ-תאי של קולטני AAL אנושיים באמצעות המערכת בקנה מידה גדול המתוארת כאן, ואחריה כרומטוגרפיה אנטי THA בעלת זיקה גבוהה. כפי שמוצג בניתוח דפי SDS מוכתמים בקומאסי.

התחומים החוץ-תאיים של תת-היחידות אלפא וגמא של אינטרלוקין, שתי קולטנים, נודדים במשקלים מולקולאריים של 40 קילודלטון ו-46 קילודלטון. ההטרוגניות של גליקנים EnLink הקיימים ב-IL שני R alpha ו-IL 2 R gamma גרמה להרחבת הפס בג'ל הדף SDS. רצועת המשקל המולקולרית הגבוהה יותר מייצגת BSA מזהם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא חלבונים מתרבית תאים אנושית באמצעות מפעלי תאים של 10 שכבות. אל תשכח שתאי HC 2 93 T נחשבים למסוכנים ביולוגית ויש לטפל בהם ברמת בטיחות ביולוגית שתיים. אנא לבשו תמיד ביגוד מגן אישי מתאים, ויש לחטא את המשטחים בהתאם להנחיות המוסדיות והממשלתיות.