אימונוהיסטוכימיה Wholemount על טופוגרפיה חושפני המוח קומפלקס

המטרה הכללית של הליך זה היא לחשוף דפוסים מורכבים של ביטוי גנים במבנה שלו של מוח שלם. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע פרפוזיה לבעל החיים והוצאת המוח. לאחר מכן, השבקול (cerebellum) מופרד ומעובד באמצעות פרוטוקול צביעה של דגימה שלמה (whole mount staining).

השלב הסופי הוא ויזואליזציה של ביטוי גנים באמצעות תגובת צבע היסטוכימית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיית שדה בהיר (bright field microscopy) כדי לדגום דפוסי ביטוי גנים על פני השטח. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה של חתכי רקמה, הוא היכולת להדגים דפוסים מורכבים בתלת-ממד ללא צורך בשחזור.

ג'ושוע וייט, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי, מדגים את הפרוצדורה. לאחר הקרבת בעל החיים והוצאת המוח מהגולגולת, הפרד את המוח הקטן (cerebellum) משאר חלקי המוח על ידי החדרת קצותיהן של פינצטה למרכז הקליים (calli) העליון והתחתון. לאחר מכן, בעזרת זוג פינצטות שני, הפרד בזהירות את הקליים ואת קליפת המוח (cortex) מהמוח הקטן.

כוון את המזחור (cerebellum) כך שהצד הקדמי פונה כלפי מטה וגזע המוח פונה כלפי מעלה. כעת, הכנס את הפינצטה אל תוך החדר הרביעי שבין גזע המוח לבין השפתיים (labials) 9 ו-10 של המזחור. חתוך את הלוחיות (peduncles) על ידי לחיצה עם הפינצטה משני הצדדים, ולאחר מכן הרם בעדינות את המזחור מהגזע של המוח.

בצעו קיבוע משני (Postfix) של המוחון על ידי טבילה ב-4%paraldehyde בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות לכל הפחות. ניתן לאחסן את המוחון ב-4%paraldehyde לפרק זמן ממושך בעבודה תחת מנדף כימיים. שפכו בעדינות את תמיסת ה-paraldehyde והחליפו אותה ב-dense fix.

הניחו את המבחנה המכילה את ה-cerebellum ואת תמיסות הקיבוע על מכשיר טלטול (mutator) וטלטלו בעדינות במשך שש עד שמונה שעות. לאחר סיום זמן הדגירה, שפכו את הקיבוע הריכוזי והחליפו אותו במלבין ריכוזי. הדגירה של ה-cerebellum בתמיסה זו תתבצע למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C, עם טלטול למחרת.

החליפו את התמיסה שבמבחנה ב-100% methanol. הניחו את המבחנה על ה-mutator ונערה בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר סיום זמן הדגירה, החליפו את התמיסה ב-100% methanol רענן וחזרו על הדגירה כדי להבטיח את דהידרטציה של ה-cerebellum.

כעת, בצעו הקפאה והפשרה של הרקמה במתנול 100% על ידי הנחת המבחנה במיכל עם קרח יבש והקפאה למשך 30 דקות. לאחר זמן זה, השתמשו בפינצטה כדי להוציא את המבחנה מהקרח היבש והניחו אותה על משטח העבודה להפשרה למשך 15 דקות. חזרו על הליך ההקפאה וההפשרה לפחות ארבע פעמים כדי לשפר את חדירותן של תמיסות הצביעה.

לאחר ההפשרה האחרונה, הניחו את המבחנה במקפיא של 80- מעלות צלזיוס למשך לילה. ניתן לאחסן את הרקמה לתקופות זמן ממושכות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס, בין מיד לפני או אחרי שלבי ההקפאה-הפשרה. אחרת, יש להמשיך בביצוע הפרוטוקול.

ביום למחרת. בצעו רהידרטציה למסביב המוח (cerebellum) על ידי טבילה עם נעתוק ב-50% methanol 50% PBS, לאחר מכן ב-15% methanol ו-85% PBS, ולבסוף ב-100% PBS, למשך 60 עד 90 דקות בכל שלב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, עבור רקמה של מסביב המוח מעכבר בוגר, העבירו את הרקמה עיכול אנזימטי באמצעות 10 micrograms per milliliter proteinase K ב-PBS למשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר עם נעתוק.

שלב עיכול זה אינו נחוץ עבור דגימות מהמוח הקטן (cerebellum) של עכברים בני P5 או צעירים יותר. לאחר העיכול, שפכו מיד את ה-proteinase K ושטפו את המוח הקטן ב-PBS 3 פעמים למשך 10 דקות בכל פעם, כדי למנוע עיכול יתר. לאחר השטיפה האחרונה, החליפו את התמיסה ב-PBS-M-T ו-ROCK למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C, כדי לחסום את הרקמה למחרת.

שפכו את תמיסת החסימה P-B-S-M-T והדגירו את הרקמה בנוגדן ראשוני המדולל ב-P-B-S-M-T, בתוספת 5% DMSO, למשך 48 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך כדי נדנוד. לאחר תום זמן ההדגרה, שטפו את המוזילום (cerebellum) שתיים עד שלוש פעמים, למשך שתיים עד שלוש שעות בכל פעם, ב-P-B-S-M-T בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך כדי נדנוד, כדי להסיר נוגדנים ראשוניים שאינם קשורים.

לאחר מכן, דגרו את הרקמה בנוגדן משני בתמיסת P-B-S-M-T עם 5% DMSO בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה. למחרת, תוך כדי נדנוד, שטפו את המוזילום (cerebellum) ב-P-B-S-M-T כפי שבוצע קודם לכן. לבסוף, בצעו שטיפה אחרונה ב-PBT למשך שעה עד שעתיים עם נדנוד בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

שלב זה מסיר שאריות חלב ומשפר את בהירות הצביעה. לבסוף, דגרו את הרקמה בתמיסת DAB. מומלץ להשתמש ב-DAB בחושך עד להשגת עוצמת הצביעה האופטימלית.

מכיוון שאור גורם לשקיעה של הכרומוגן, דבר שעלול להגביר את צביעת הרקע, תוצר התגובה החום צריך להיות גלוי בבירור תוך 10 דקות, כאשר מגיעים לעוצמת הצביעה האופטימלית. עצירה את התגובה על ידי העברת המוחיך (cerebellum) ל-PBS עם 0.4% sodium azide.

ניתן לאחסן את הרקמה בפתרון זה לטווח אPropertyChanged. יש לצלם רקמה שנצבעה בשיטת whole mount בעוד היא טבולה ב-PBS או במצע אחר שיספק מקדם שבירה אופטימלי. כדי למקם בקלות את דגימת ה-whole mount לצילום, הכינו ג'ל אגר 1% בתוך צלחת פטרי מפלסטיק.

בשלב הבא, חוררו חורים קטנים בג'ל ולאחר מכן הצמידו את המוחיצן (cerebellar) לחורים אלו בכיוון הרצוי לצילום; כסו את המוחיצן ב-PBS. הרקמה הצבועה מוכנה כעת לצילום באמצעות מיקרוסקופיה של אור. ZEIN two Adelaide c.

אימונוהיסטוכימיה חושפת פסי שגג (sagittal bands) בחתכים רוחביים של המוח הקטן. השפתיים ארבע, חמש ושלוש מסומנות בתרשים. לצורכי התמצאות, סרגל המقياس מייצג 500 microns.

ZEIN שתיים. Adelaide's C מבוטא באופן בלעדי בתתי-קבוצות של גופי תאי kinji ודנדריטים. בתמונה זו, סרגל המقياس מייצג 150 microns.

תמונה זו מציגה דגימת cerebellum שלמה שצבעה zein two, Adela C, המראה פסי תאי bikini בתמונות של האזורים הקדמיים, המרכזיים והאחוריים של ה-cerebellum. הספרות הרומיות מציינות את ה-cerebellar loles. LS הוא ה-loist simplex.

PML מייצג את ה-paramedian labial. COP מציין את הפרמטרים הקופולריים והתוויות. Crust one ו-crust two מציינים את השמות של שני LOEs של ההמיספירה, וסימוני P one ו-P three מבוססים על נומנקלטורה סטנדרטית המשמשת לציון פסי BR two ספציפיים.

לפרטים נוספים, ראו Sillitoe and Hawks 2002. סרגל המقياس מייצג מילימטר אחד. כאן המוזגו (cerebellum) עבר צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדן ל-cocaine and amphetamine regulated transcript peptide.

ניתן לראות כי חלבון זה באהביעור בתתי-קבוצות של סיבים מטפסים העוברים דרך שכבת תאי הפירמידה המסומנת כ-PCL ומסתיים בשכבה המולקולרית המסומנת כ-ml. כאן, סרגל הקנה מייצג 100 microns.

ניתן לראות בתמונה זו כי סיבי ה-cart החיוביים מקרינים פסים של דנדריטים של תאי bikini בשכבה המולקולרית של קליפת המוח דגמי, כולל אזורים כגון ה-Oculus המסומן כ-PFL וה-Oculus המסומן כ-fl. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להימנע מחיתוך של המוח דגמי. כל נזק חיצוני יעיב על הנראות של דפוסי צביעה מורכבים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחשוף דפוסים מורכבים ומעניינים של ביטוי גנים בנוירונים ובסיבים היוצרים עמם מגע במוח השלם.