הפקת RNA מן התאים Neuroprecursor שימוש Bio-Rad סך RNA Kit

שלום, אני ג'וש ש', סטודנט לתואר מתקדם במעבדתו של ד"ר אד מאקי באוניברסיטת קליפורניה ארווין. אדגים לכם כיצד להפיק RNA מתאי קדמיים נוירונליים באמצעות ערכת ה-BioRad to RNA mini kit. אני משתמש בערכה זו כבר מספר שנים במעבדה זו, והיא תמיד סיפקה לי תוצאות עקביות עם תתיב גבוה.

התאים שבהם אנו משתמשים הם תאי אב עצביים מסוג Eton and a half שפורקו באופן אקוטי מקליפות מוח עובריות, ואנו זורעים אותם בדרך כלל בלוחית 24 בארות שעברה טיפול לתרביות רקמה וצופה ב-PD L ובלמינאט, ואני זורע אותם בריכוז של 100,000 תאים לבאר. לפני שאתחיל, עליי לציין שעליכם לעבוד על שולחן עבודה ייעודי שבו אתם מבצעים את עבודת ה-RNA שלכם. הדבר הראשון שיש לעשות הוא לוודא ששולחן ה-RNA נקי.

הדרך המתאימה לניקוי השולחן היא להשתמש ב-RNA zap. למעשה, הוא משמיד את כל ה-RNAs, מכיוון שה-RNase בעצמו הורס את ה-RNAs שלכם. דבר נוסף הוא להרכיב כפפות תמיד בעת ביצוע ההפקה, כיוון שהעור שלכם מלא ב-RNAs אלו.

לכן, זהו דבר שאסור לעשות. אוקיי, מה שיש לי כאן הוא ערכת ה-BioRad total RNA mini. הוצאתי את תכולתה, אז הרשו לי להראות לכם מה היא כוללת.

ראשית, יש לנו PBS שעובד עם X dep C, וכן אתנול 70% שעובד עם DEP. יש לנו תמיסת רישוי ל-RNA כולל, לה נוסף אתנול. שנית, שטיפה ברמת מחומריות נמוכה (low stringency) לה נוסף אתנול 100%, שטיפה ברמת מחומריות גבוהה (high stringency), תמיסת דילול ל-DNA, ה-DNA עצמו, ואלואציה של RNA כולל.

את התמיסה נכניס לבלוק חימום של 70 מעלות. הדברים הנוספים שנזדקק להם הם מבחנות עם מכסה בנפח 1.5 מיליליטר. מבחנות אלו אינן מכילות DNA או RNAs, לכן ודאו שבידיכם מבחנות שאינן מכילות חומרים אלו.

ויש לנו שתי פרועות ללא מכסה בנפח 2 מ"ל. והדבר החשוב מכל הוא עמודי ה-RNA עצמם. בלעדיהם, לא ניתן לבצע את מיצויי ה-RNA.

כדי להרכיב את העמודות הללו, עליכם לקחת את עמודת ה-RNA ואת ה-two mil capless two, פשוט לחבר אותן כך ואתם מוכנים להמשך. ובסוף, הדבר האחרון שאנו תמיד זקוקים לו הוא התאים הללו. התאים כאן הם תאי מקור עצביים של Eton and a half.

הן הופרדו באופן אקוטי מקליפות מוח עובריות. הן גודלו במשך מספר ימים במצע גידול. הוצאתי את התאים מהדגרה בטמפרטורה של 37 מעלות.

פרוטוקול זה ספציפי לתאים נצמדים. תאים אלו גודלו על פלטות עם בארות בנפח 0.4 שעברו טיפול לתרביות רקמה וצופו ב-PDL ובלמינאט. כעת אשתמש בצינור ואקום כדי לשאוב את המצע.

השלב הבא הוא להוסיף כ-500 µL של dep SEA PBS. ושוב, עלינו להשתמש בקולבים עם פילטר. ה-PBS, למעשה, שוטף את המצע.

כדי שרכיבי המצע לא יכניסו לעמודת ה-RNA או יפריעו להפקת ה-RNA שלכם, שכן אם כך תהיה התוצאה, לא תקבלו תבואות טובות. בסדר? אשאב במהירות את ה-PBS מכיוון שתאי גזע עצביים אינם מגיבים טוב ל-PBS. כעת אוסיף 350 µL של lysis buffer לכל דגימה.

שוב, ודאו שיש לכם beta my capital ethanol בתוך תמיסת הליזיס. כעת אני אבצע פיפטינג (שאיבה ושחרור) של תמיסות הליזיס 15 פעמים כדי לוודא שהתאים עברו ליזיס, כך שנוכל להוציא את תכני ה-RNA.

כעת אוסיף אתנול 70% לכל באר; לאחר הוספת 350 µL של אתנול 70% זה, אבצע שאיבה ושחרור (pipetting) 10 פעמים בכל באר. ביצעתי שאיבה ושחרור 10 פעמים עבור כל באר. כעת אכוון את הפיפט ל-700 µL ומעלה, מכיוון שהנפח הכולל של כל באר הוא 700 µL.

לאחר מכן, אשאב את הנוזל מהנפחים שמעל 700 µL ואעביר אותו לעמודת RNA. לאחר הוספת התוכן לעמודה, אעבירה אותה לצנטריפוגה ואסובב אותה למשך 30 שניות במהירות מקסימלית. לאחר סבב הצנטריפוגה הראשון של הליזט, אשפוך את התסנין למכל ריק כדי להשליכו.

או שחלק מאנשים אחרים משתמשים בצינור ואקום כדי לשאוב את התסנין. בשלב הבא, יש להוסיף 700 µL של בופר שטיפה ברמת מחמירות נמוכה. ושוב, ודאו שאתם מוסיפים לתוכו את האתנול.

כעת אסחרר את הדגימה למשך 30 שניות במהירות מקסימלית. לאחר סחרור של באפר השטיפה בעל הרגישות הנמוכה, אשלוף ואשליך את התסנן. אוקיי? לאחר מכן אכין את תמיסת ה-DNA.

לכן, לכל דגימה תוסיפו 5 µL של DNAs. במקרה שלנו, למעשה ביצענו חלוקה לאליקוטים של ה-DNAs עוד לפני שהתחלנו בתהליך, כיוון ששוב, מדובר באנזים.

עדיף לאחסן אותם כמנות (aliquots). אחסון של כל הכמות יחד יגרום לכך שמחזורי ההקפאה וההפשרה יהרסו את הפעילות האנזימטית. לכן, לאחר הוספת 5 µL של DNAs, אני אדלל אותם עם 75 µL של תמיסת הדילול ל-DNA.

לאחר ההוספה, הנפח הכולל יהיה 80 µL של תמיסת DNA. כעת אוסיף 80 µL של תמיסת DNA לכל דגימה. ודאו שהנוזל מגיע לממברנה של העמודה.

כך תבטיחו שפתרון ה-DNA ייספג בממברנה. באופן זה תסלקו את ה-DNA, ובכך תגדילו את תפוקת ה-RNA.

לאחר הוספת ה-DNAs, יש להמתין 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לאנזים לפעול. שוב, יש לדגור את העמודה למשך 15 דקות. ובכן, הזמן עבר.

לאחר דגירה של 15 דקות, אעביר את הדגימה לצנטריפוגה ואסחר את ה-DNAs למשך 30 שניות במהירות מקסימלית. לאחר סחיטה של 30 שניות להסרת ה-DNAs, אשפוך את התסנין. כעת אוסיף 700 µL של בופר בעל מחמירות גבוהה (high stringency buffer) כדי לשטוף שאריות של DNAs.

לאחר מכן, אחרי הוספת הרכיב, אסחרר שוב למשך 30 שניות נוספות בצנטריפוגה. לאחר הסבב, אשליך את התסנין בעל הסלקטיביות הגבוהה על ידי שפיכתו למכל. לאחר מכן, נוסיף 700 µL של בופר בעל סלקטיביות נמוכה.

בפעם זו, אסבב את הדגימה במשך דקה אחת במהירות מרבית בסנטריפוגה. לאחר שטיפת מחזוריות נמוכה ראשונה של דקה אחת, אשליך את התסנן. הפעם לא אוסיף דבר, אלא אסבב שוב למשך שתי דקות נוספות כדי להיפטר משאריות השטיפה בעלת המחזוריות הנמוכה, מכיוון שהשטיפה בעלת המחזוריות הנמוכה מכילה אתנול, דבר שעלול להפחית את תולדת ה-RNA שלכם.

כעת אוציא את תחליל an elution מבלוק החימום של 70 מעלות. רק כדי להזכיר, ודאו לפני תחילת הניסוי שתחליל ה-elu נמצא בטמפרטורה של 70 מעלות; עלינו לשמור אותו חם כדי להגביר את יעילות תנובת ה-RNA. העמודות שלי מוכנות.

הם הוצאו מהצנטריפוגה. בשלבים הבאים, מוציאים את העמודות. אוקיי, אני אשליך את מבחנות המכסה ואנחנו נעביר אותם למבחנות המכסה הללו.

יש להוסיף 50 µL של תמיפת Lucian לכל עמודה. ודאו שתמיפת ה-illusion מגיעה לממברנה כך שהיא תיספג בה היטב. אם לא תעשו זאת, לא תקבלו תבואת RNA טובה.

כעת יש להמתין דקה או שתיים כדי להבטיח שהתמיסה נספגת בממברנה של העמוד. אוקיי, עברה דקה אחת. כעת אני יכול להעביר אותו לצנטריפוגה.

כעת אני אכניס את העמודות לצנטריפוגה. אני אסובב אותן למשך דקה אחת במהירות מלאה. זהו שלב הצנטריפוגה האחרון, שבו תאספו את ה-el pollutant או את ה-RNA לתוך מבחנות עם פקקים אלו.

כעת, לאחר הסתיימות הצנטריפוגה האחרונה, הוציאו את התוכן, הסירו את העמודה ואתם יכולים להשליכה, סגרו את המבחנה, וכעת ניתן לאחסן אותם בטמפרטורה של 80- מעלות, ולאחר מכן תוכלו להשתמש בהם כרצונכם. כך חילצתי RNA באמצעות ערכת ה-BioRad RNA. כעת אני עומדת למדוד את ריכוז ה-RNA שחילצנו, או שנוכל לקרוא את ה-OD שלו באמצעות ספקטרופוטומטר.

זהו השלב שאדגים לכם. ראשית, עלינו להכין תערובת דילול. זה יהיה דילול של 1:5.

אנו נערבב את ה-RNA שלנו עם מים מזוקקים מסוננים (MQ). לכן, ראשית אכין דגימת ביקורת (blank). אקח 2 µL מתמיסת האלוציה שבה השתמשנו כדי לאלוץ את ה-RNA בשלב מוקדם יותר, ואוסיף 8 µL של מים מזוקקים. בסדר?

זהו הבלנק שלנו. כעת אכין את הדגימה. נשתמש ב-2 µL של ה-RNA המדובר.

נוסיף שוב 8 µL של מי MQ. כך נקבל דילול של 1:5, נכון? יש לי כאן קיווטה מזכוכית שבה אשים את הדגימות שלי, ואטען את הקיווטה הזו לתוך הספקטרומטר.

כעת נמדוד זאת. לפני שאמדוד את ה-OD של דגימות ה-RNA, עליי לנקות את ה-cuvette. שוב, הנה ה-cuvette מזכוכית.

אסור לכם לגעת בחלקו הקדמי. כך תשאירו עליו טביעות אצבע ואני אקבל מדידות שגויות. לכן, הדבר הראשון שאעשה הוא לשטוף את ה-glass key bet במים מזוקקים כפולים (double DI water).

לאחר מכן אשתמש בצינור ואקום כדי לשאוב את המים. אחרי שטיפה זו, אשטוף את הדגימה ב-95% ethanol, ואז אשתמש שוב בצינור ואקום כדי להסיר את ה-ethanol.

כעת אני מוכן להטעין את הבקרה (blank). עלינו להשתמש בבקרה תחילה כדי לנרמל את הקריאות שלנו. לכן, אקח 10 µL מהתערובת שהרכנו כעת.

אני אערבב את התמיסות שלנו למעלה ולמטה כדי להגיע למעבב טוב. אני אעביר אותן לספקטרופוטומטר הזה. זהו מכשיר Ultra Spec 3, 100 probe, ואנו נמדוד את ריכוז ה-RNA.

כעת פתחו את המכשיר, נניח את הדגימה באחד התומכים הללו. נגדיר את התוכניות כך שייקראו RNA בלבד. שוב, ביצענו דילול של 1:5.

אם כן, אנו רוצים לקבוע את מקדם הדילול לחמישה. אוקיי, אני מוכן להתחיל. לכן, אלחץ על run כדי לבצע כיול למשבצת הריק (blank).

בסדר, כעת בוצע איפוס. כעת אנו מוכנים למדוד את הדגימה שלנו. לכן, אני אוציא את תחתית הזכוכית.

אני אשאב החוצה את התוכן של הבלנק. שוב, אני אשטוף אותו עם double DIS water. אני אשטוף אותו עם 5% ethanol.

כעת אני מוכן לטעון 10 µL מהדגימה שלנו. לכן, שוב, ודאו שערבבתם היטב את הדגימה. נטען אותה לתוך המבחנה מזכוכית.

כעת אנו מוכנים לקריאה. לאחר מדידת ה-od, אלו הם הערכים עבור תנובה וטוהר תקינים: יחס בליעת RNA של 2.60 עד 2.80, שצריך להיות סביב 2. והתנובה היא כ-144 µg/mL.

למרות שהמכונה מראה 72 micrograms per mil, עלינו להכפיל זאת בשניים בגלל חצי האורך בביטס שלנו, שני סנטימטרים הראו לכם כיצד לבודד RNA מתאי מקדם עצביים. שוב, אנו משתמשים בערכת total mini RNA של BioRad. ניסינו ערכות אחרות וזו הערכה הטובה ביותר שבה אנו משתמשים בהתבסס על יעילותה.

פעולה זו מניבה RNA באיכות גבוהה. אם תשתמשו בערכה זו, תקבלו את אותן תוצאות באיכות גבוהה שאנו מקבלים תמיד.