Name: ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט באתר הכלאה (דגים) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: למד את שיטת ה-FISH לניתוח שעתוק גנים בתאים בודדים ב-Plasmodium falciparum. השיטה מאפשרת זיהוי מקביל של מספר גנים var ומספקת תובנות לגבי דינמיקת השעתוק בטפילי המלריה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למיכאל Alifrangis ואולה Abildtrup לgenotyping של טפילים וכריסטינה הולמת לסיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה על ידי הווארד יוז רפואי במכון (מענק 55005511), הקרן לונדבק (מענק R9-A840) ועל ידי נילס בוהר הקרן.

1. דור של אריתרוציטים הנגועים הנבחרים טרי עבור assay זה, את התוצאות הטובות ביותר מתקבלות בעת שימוש בתרבויות שנבחרו זה עתה לביטוי פני PfEMP1 חלבון. בניסוי המסוים הזה 3D7 פ שושלת falciparum נבחרה באמצעות נוגדנים ספציפיים כמתואר 1 בעבר. יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl הקציר של תאי דם ארוז מפ falciparum התרבות המכילה 2-5% אקספלורר שלב מאוחר על ידי צנטריפוגה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות גלולה בדם של 2 מ&quot;ל 37 ° C 0.75% פתרון חם ג&#39;לטין בצינור סטרילי 14 מ&quot;ל, ולצאת לדקות 15-20 על 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר IE אינו הנגוע וטבעת שלבים למשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את IE בשלב מאוחר, כלומר את השלב העליון, לתוך צינור חדש מ&quot;ל 14 ולשטוף פעמים עם 10 מ&quot;ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 μl של אנטי PfEMP הספציפי1 נוגדנים ב2 מ&quot;ל של 37 ° C תקשורת RBC-לשטוף ולסנן סטריליים החמימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את IE השטוף בשלב מאוחר עם נסיובי עוקר בדילול המלא בצינור סטרילי 14 מ&quot;ל ודגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר, ולשטוף פעמים עם 10 מ&quot;ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 50 μl של חלבון Dynabead השעיה פעמים עם תקשורת RBC-שטיפה באמצעות-15 DynaMaq מגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את Dynabeads ב300 תקשורת μl RBC-לשטוף ולהוסיף אותם לאקספלורר השטוף בשלב מאוחר. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הצינור למגנט DynaMaq-15. השאר למשך 1-2 דקות ולהסיר את כל הנוזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את Dynabeads במיליליטר 4-5 המדיה RBC-שטיפה. העברת הצינור בחזרה אל המגנט ולהשאיר אותה במשך 1-2 דקות לפני ההסרה כל הנוזלים. חזור על שלב כביסת פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את החרוזים המכובסים לו 25 סנטימטרים 2 סטרילי תרבותלאסק מכיל 200 תאי דם μl ארוז טרי אדומים. הוסף 5-6 מ&quot;ל של Albumax תקשורת בתרבות. אחסן לילה בCO 5% 2 ב 37 ° C. </li></ol> יום 2 <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Dynabeads מהתרבות כאשר IE שנבחר פלישה חוזרת של תאי הדם האדומים הטריים על ידי העברה כל התרבות לצינור סטרילי 14 מ&quot;ל. שים את הצינור אל-15 DynaMaq המגנט ולצאת ל1-2 דקות. לאחר מכן, שופך את כל הנוזל בחזרה לבקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות לכמה שפחות מחזורים ככל האפשר עד parasitemia של 5-10% וטפילים הן בringstage. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספלורר צריך להיות מנותח על ידי FACS כדי לוודא שהפנוטיפ המשטח הנכון, ביטוי חלבון כלומר של או and/orPF11_0008 PFD1235w הושג 1. </li></ol> 2. הכנת הבדיקות בדיקות antisense RNA נוצרו מהאזורים המשתנים ביותר של PFD1235w וvar PF11_0008 &lt;/ Em&gt; גנים מפ הדנ&quot;א הגנומי 3D7 falciparum. דנ&quot;א הוגבר באמצעות PCR ומשובט לתוך וקטור pSPT18 או 19 לשעתוק, בהתאמה לפי התיאור של היצרן (רוש). הבדיקות (580 זוגות בסיסים (bp) ו590 BP באורך) תויגו עם Digoxigenin (DIG) או ביוטין באמצעות DIG-RNA תיוג קיט או מיקס תיוג ביוטין רנ&quot;א, בהתאמה. אנחנו אשרנו את הספציפיות של הבדיקות הן על ידי ניתוח כתם הצפון ועל ידי ניתוח יחיד, תווית דגי 1. 3. למרוח דקים וקיבוע של טפילים לפני הכלאה באתר יום 1 כל הצעדים נעשים בסביבת RNase-חופשיה וכל המגיבים הם RNase חינם או מראש טופל-עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) או RNase Zap (Invitrogen). את השקופיות וחוטרי כיסוי יש לנקות עם אלכוהול כדי להסיר שומן ייצור שיורית. חשוב לבצע את הפרוטוקול ללא כל הפסקה בין צעדיםעל מנת למזער את הסיכון לזיהום nuclease. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות סרט דם דק בשיטת ההפצה הסטנדרטית 3. באמצעות העדשה אובייקטיבי שמן 100x של המיקרוסקופ, לספור את IE ולחשב את האחוז של IE בתרבות. בדקו ששלבי הטפיל הם בתיאום מקורב, בטבעת והשלבים מוקדמים של trophozoite מחזור IE. אלה הם mRNA הגן var להביע מראש שכפול, שלבים חד nucleate, ומתאים למבחנים בודדים סלולריים דגי שעתוק מסוג זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 50 μl של התרבות הטפילה, בparasitemia של 5-10%, לצינור 1.5 מ&quot;ל RNase ללא אפנדורף. צנטריפוגה לדקות 1 ב2000 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ולהוסיף pH 50 μl PBS 7.2 במי DEPC טופל. להתסיס את הצינור בעדינות. חזור על שלב שקיעת צנטריפוגלי פעמים כדי לשטוף את התאים חינם מתקשורת ופסולת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות ארבע מריחות דקות באיכות טובה. לכל כתם, כתם להפוך לאחד אל11 קוטר מ&quot;מ אחד הטוב של 4 שקופיות טובות, ארבע שקופיות זכוכית כלומר בסך הכל, במכסת מנוע RNase חינם (שלב קריטי). גל מחליק לרגע באוויר לייבוש. הפוך שלוש שקופיות נוספות לשקופית שלילית בקרות אחד להכתמת בדיקה אחת לכל גן רלוונטי אחר באמצעות בדיקה ספציפית, שקופית אחרת לטיפול RNase ושקופית המכילה 3 אקספלורר לא מבטא את הגן של עניין. השאר את השקופיות לייבוש על הספסל במשך 10-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הסרטים הדקים על ידי הוספת 60 μl של פתרון קיבעון המכיל paraformaldehyde 4% וחומצה אצטית קרחונים 5% לבארות. השאר למשך 10 דקות על הספסל בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות ב2x SSPE חיץ למשך 5 דקות על ידי תסיסה עדינה בטמפרטורת חדר. בקצרה סילוק נוזלים עודפים על ידי נגיעה בבארות המכילות את התאים בעדינות במגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את השקופיות עם פפסין 0.01% ב0.01 M HCl עבור 2 דקות על 37 מעלות צלזיוס (צעד מאוד קריטי). שטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תמיסת RNase לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. לכסות על כתמי בקרה השליליות עם 60 μl של פתרון RNase. דגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנה מייד לצעד ההכלאה. </li></ol> 4. כלאה של בדיקות RNA על שקופיות קבועות יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קאמרי הכלאה, כגון ThermoStar 100 HC4 או תיבת קצה פיפטה ריקה לשים בתנור נקי, על ידי ריסוס עם RNase Zap ומנגב אותו נקי במגבת נייר. מלא את הערוצים של חדר ההכלאה או התחתון של התיבה עם מי DEPC טופל כדי לוודא שהשקופיות לא תתייבשנה במהלך הכלאה. סגור את החדר ומחמם עד 48 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את החקירות בפתרון ההכלאה לריכוז סופי של 12 ng / μl. לפגל פתרון החללית על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בבלוק חימום. מייד לצנן על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה אוויר תיבש את השקופיות אחרי כביסת SSPE 2x. מוציא בזהירות את הנוזל עודף סביב הבארות במגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תא ההכלאה ולמקם את השקופיות בבית הבליעה. תחול אחת או בשתי הבדיקות בהיקף כולל של 60 μl לטוב. זהירות לכסות טיפת הנוזל עם תלוש כיסוי RNase-חופשי באמצעות מלקחיים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את התא ולהכליא את השקופיות ב48 מעלות צלזיוס במשך לפחות 16 שעות במשך הלילה. </li></ol> 5. נטיית נוגדן והגברת קרינה יום 2 השלבים הבאים מבוססים על מערכת TSA פלוס פלטת קרינה מפרקין אלמר. כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות 3 פעמים בTNT חיץ למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הבארות ב150 μl של חיץ TNB למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את נוגדן HRP-מצומדות α-DIG במאגר TNB ביחס של 1:100 ונוגדן HRP-מצומדות α-ביוטין במאגר TNB, ביחס של 1:500. הסר את כל חיץ TNB עודף מהשקופיות עם ממחטת נייר. כאשר גילוי 2 תעתיקים בו זמנית, שני הנוגדנים יכולים ללכת מייד. למרוח כמות כוללת של 100 μl של פתרון נוגדן לTNB היטב ולכסות בזהירות עם פתק כיסוי. דגירת השקופיות עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התלושים לכסות בזהירות. שטוף את השקופיות בTNT חיץ 3 פעמים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את FITC-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500 ולהחיל 100 μl של פתרון לכל באר. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מחליק בזהירות ולשטוף את השקופיות 3 פעמים למשך 5 דקות בחיץ TNT ידי תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את Cyan3-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500. הוסף לμl 100גם בפתרון זה. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מחליק בזהירות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות במהירות על ידי טבילה בחיץ TNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות 3 פעמים עם חיץ TNT למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות במהירות במי DEPC טופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את השקופיות לייבוש באוויר. הר את השקופיות עם ריאגנט אנטי לדעוך מכיל DAPI. לאטום את הפינות של תלושים לכסות עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את השקופיות מוכנות כעת למיקרוסקופיה. שמור את השקופיות מכוסות בנייר האלומיניום ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס, אם הניסוי הוא להסתיים ביום למחרת. איטום מלא של הצדדים של השקופיות יכול להתבצע 24 שעות לאחר ההחלה מגיבה נגד הדהייה. זה יאפשר את השקופיות שצלמו עד שבוע לאחר הפרוטוקול הושלם. </li></ol> 6. ויזואליזציה של בדיקות הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ. מיקרוסקופ immunofluorescence סטנדרטי הוא sufficient לסוג זה של ניסוי, אבל אם יש לך גישה למיקרוסקופ confocal אתה יכול גם להשתמש בזה לתמונות 3D או כדי לקבל קטעי וידאו של התאים המוכתמים שלך. אפשר מיקרוסקופ כדי להתחמם במשך 15-30 דקות. כבה את המחשב ואת התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את איכות הצביעה במיקרוסקופ immunofluorescence. בחר מקום המכיל כמה טפילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הרווח של כל ליזר באופן ידני. התאם פיקסל להתעכב כדי 4-6 מ &#39;-1 של -1 והצעדים ל512 x 512 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונת בדיקה באמצעות המסגרת למבדה. להסתגל רווח הליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מינימום של 20 תמונות טובות של תאים בודדים ניאון. לפחות 2-5 תמונות של שדה המכיל 5-20 טפילים נדרשות על מנת לקבל סקירה הוגנת של אחוז הטפילים חיוביים. </li></ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheeseborough%2C+M+%22District+Laboratory+Practice+in+Tropical+Countries%22">District Laboratory Practice in Tropical Countries</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2006).</li>
<li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117(2009).</li>
<li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li>
<li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li>
<li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li>
<li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li>
<li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li>
<li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ניתוח דגי רנ&quot;א, בניגוד לשיטות כמו סופג צפון וRT-PCR, מאפשר אפליה של תעתיקי mRNA ספציפיים ברמת התא הבודדה. זה מאפשר להבחין בין תאי תעתיק פעילים ולא פעילים, בדוגמה זו, פ falciparum הטפיל פרוטוזואה בתוך תאי דם אדומים אנושיים. תצפיות כאלה כל תא הן לעתים הכרחיות ויכולות לחשוף דפוסי תעתיק חשובים ורומן 1. למרות שיטות דגי RNA אחרות כבר תארו 4-10, יש כבר צורך בפיתוח פרוטוקול חדש ומעודן ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> 338826-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> Albumax מדיה: 1640 פתרון גלוטמין RPMI </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 המ&quot;ל RPMI 1640 פתרון 5 מ&quot;ל גלוטמין </td></tr><tr><td> Albumax תקשורת: Gentamycin גופרת Albumax-פתרון </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 מ&quot;ל gentamycin גופרה 50 מ&quot;ל Albumax-פתרון </td></tr><tr><td> Albumax-פתרון: Hypoxanthine </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> H9377 </td><td> 0,8 גרם Hypoxanthine </td></tr><tr><td> Albumax-פתרון: AlbuMAX השני </td><td> אניnvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 גרם Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-פתרון: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 הליטר RPMI 1640 ממס עם מגנט במקסימום. 50 ° C. סנן לעקר ולאחסן ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> סיגמא </td><td> A5710-110g </td><td> שרף לdeionize פוראמיד. </td></tr><tr><td> הצמוד peroxidase אנטי ביוטין עז PAB </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן אנטי Dig </td><td> נובוס ביולוגי </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> ריאגנט אנטי לדעוך עם DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> תקשורת ההרכבה יש לרפא עבור 24 שעות לפני שהוא סגר את השקופית לחלוטין. </td></tr><tr><td> ביוטין רנ&quot;א תיוג מיקס </td><td&gt; רוש </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית </td><td> מראה דיגיטלי ניקון DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> מנזל-גלזר </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> 25 משטח תרבות בקבוק 2 סנטימטר Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / סיגמא </td><td> 32490-100 מ&quot;ל </td><td> 1 המ&quot;ל DEPC במי 1000 מ&quot;ל deinonized. הוסף בר מערבבים ומערבבים במשך 12 שעות. חיטוי למשך 30 דקות. </td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית </td><td> מראה דיגיטלי ניקון DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חלבון Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> מגנט DynaMaq-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> פוראמיד bioultra 99% </td><td> Fluka/ סיגמא </td><td> 47671-1l-F </td><td> פוראמיד deionized: 5 גרם של שרף חילוף יונים לכל 100 מ&quot;ל של פוראמיד. מערבב 30 דקות. לסנן דרך נייר Whatman. </td></tr><tr><td> . ג&#39;לטין 0 75% פתרון: ג&#39;לטין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G2500 </td><td> 3.75 גר &#39;ג&#39;לטין 500 המ&quot;ל בRPMI 1640. חום עד 56 מעלות צלזיוס להמסה. סנן לעקר כאשר 56 ° C. חנות ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> . ג&#39;לטין 0 75% פתרון: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3.75 גר &#39;ג&#39;לטין 500 המ&quot;ל בRPMI 1640. חום עד 56 מעלות צלזיוס להמסה. סנן לעקר כאשר 56 ° C. חנות ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> פתרון גלוטמין: L-glutamin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G3126 </td><td> 14.6 גלוטמין גרם לליטר ב500 מ&quot;ל 0,9% NaCl. להתמוסס, מסנן שלterilize ולאחסן ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> פתרון גלוטמין: HCl </td><td> סיגמא </td><td> H1758 </td><td> 14.6 גלוטמין גרם לליטר ב500 מ&quot;ל 0,9% NaCl. להתמוסס, לסנן לעקר ולאחסן ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> פתרון הכלאה: פוראמיד ביו אולטרה 99% SSC 20x </td><td> Fluka / סיגמא </td><td> 47671-1l-F </td><td> סה&quot;כ 20 מ&quot;ל, לשמור קפוא ב -20 ° C בaliquots 10 פוראמיד deionized מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון הכלאה: התרכיז של 50x Denhardt </td><td> סיגמא </td><td> D2532 </td><td> 20xSSC 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון הכלאה: ריאגנט שמרים tRNARoche חסימה </td><td> סיגמא </td><td> R-6750 </td><td> 2 מ&quot;ל של 50x Denhardt 250 20 מ&quot;ג למ&quot;ל μl שמרי tRNA </td></tr><tr><td><sטרונג&gt; פתרון הכלאה: DNA זרע הסלמון </td><td> Fluka / סיגמא </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g רוש חסימת מגיב 1 מ&quot;ל של 10 מ&quot;ג לכל דנ&quot;א זרע סלמון מ&quot;ל (קריטי: לפגל הסלמון spermDNA בגיל 96 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני שמוסיף לפתרון ההכלאה) </td></tr><tr><td> מכליא ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil המכשירים GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> יכול להיות מוחלף על ידי תאי הכלאה חופשיות RNase מרופדים במי DEPC תנור הכלאה ו. </td></tr><tr><td> טבילת שמן UV שקוף פלואורסצנטי חופשי </td><td> סיגמא </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ immunofluorescence או confocal </td><td> ניקון D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> ניתן להשיג בכל בית מרקחת </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionized H 2 O </td><td></td><td></td><td> pH Ajust ל -7.4 160 גרם 4 גרם 23 גרם 4 גרם 1 הליטר </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4% </td><td> Fluka / chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 גרם PFA ב80 המ&quot;ל PBS / DEPC. חום עד 65 מעלות צלזיוס עד שPFA נמס. הוסף 20 המ&quot;ל PBS, מאפשר הפתרון לצינון. התאם את ה-pH ל -7.4. לסנן. חנות בaliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4% / חומצה אצטית 5% </td><td></td><td></td><td> 950 paraformaldhyde μl + 50 חומצה אצטית μl </td></tr><tr><td> עכלן </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> מצומדות peroxidase אנטיביוטין </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-לשטוף מדיה: 1640 פתרון גלוטמין RPMI </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 1640 פתרון מיליליטר RPMI 5 מ&quot;ל גלוטמין </td></tr><tr><td> RBC-לשטוף תקשורת: סולפט Gentamycin </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 מ&quot;ל gentamycin גופרה </td></tr><tr><td> RNase </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td></td><td> הפוך פתרון מניית מ&quot;ל 10 מ&quot;ג /. </td></tr><tr><td> 1.5 צינור RNase החופשי מ&quot;ל </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות 4 בארות 11mm </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> סיגמא / אלהיידריך </td><td> S9625 </td><td> M 3 NaCl (175 גר &#39;/ ליטר) 0.3M Na 3 ציטראט x H 2 O (88 ג&#39;/ ליטר) התאם ל -7.0 pH עם 1M HCl </td></tr><tr><td> SSC 20x: מייבשי ציטראט נתרן </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> W302600 </td><td> M 3 NaCl (175 גר &#39;/ ליטר) 0.3M Na 3 ציטראט x H 2 O (88 ג&#39;/ ליטר) התאם ל -7.0 pH עם 1M HCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> S9625 </td><td> 175.3 גרם NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: Nah 2 PO 4 </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> S0751 </td><td> 27.6 גרם לאא 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA אבקה </td><td></td><td></td><td> 9.4 גרם אבקת EDTA מוסיף מי DEPC, להתאים pH 7.4. אוטומטיClave ל20 דקות </td></tr><tr><td> TNB חיץ: TNT חיץ </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ל TNT חיץ </td></tr><tr><td> TNB חיץ: ריאגנט חסימה </td><td></td><td></td><td> מגיב חסימת 0.05g כדי לפזר את מגיב החסימה, מחמם את התמיסה ל 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם ערבוב. חנות ב -20 ° C. (נגזר פרקין אלמר TSA-הפרוטוקול). </td></tr><tr><td> TNT חיץ: טריס / HCl </td><td> סיגמא </td><td> T1503 </td><td> 1M טריס / HCl, 8.0 pH </td></tr><tr><td> TNT חיץ: NaCl </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S9625 </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> TNT חיץ: Tween20 </td><td> סיגמא </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 מ&quot;ל 1 המ&quot;ל DEPC DH 2 O869 מ&quot;ל התאם pH ל -7.5 בטמפרטורת חדר. (נגזר פרקין אלמר TSA-הפרוטוקול). </td></tr><tr><td> TSA בתוספת מערכת Cyanine3 / fluorescein </td><td> פרקין אלמר </td><td> NEL753000IKT </td><td> קראו את הפרוטוקול מTSA פלוס מערכת פלטת פלואורסצנטי בקפידה לפני תחילת הניסוי. </td></tr><tr><td> צינורות 14 מיליליטר סטרילי </td><td> Almeco - Aps LAB CM </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי rna פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

הידבקות של אריתרוציטים Plasmodium falciparum הנגועים (IE) לקולטנים אנדותל אדם במהלך זיהומי מלריה מתווכת על ידי ביטוי של PfEMP1 גרסות חלבונים המקודדות על ידי גני var. הפלואידים פ falciparum הגנום מטפח כ 60 גני var שונים אשר אחד בלבד כבר האמינו שעבד לכל תא בכל פעם בשלב הדם של הזיהום. איך רגולציה סותרת כזה של שעתוק הגנים var מושגת לא ברור, כפי שהוא זיהוי גני var בודדים או תת קבוצות של גנים הקשורים לvar קולטנים שונים והתוצאה של מחייב הפרש בתוצאה הקלינית של פ זיהומי falciparum. לאחרונה, הפרדיגמה שעתוק מוציאות כבר נקראה בספק על ידי מבחני שעתוק המבוססים על פ פרט זיהוי תמליל falciparum בinf אחתתאי האריתרוציטים ected באמצעות רנ&quot;א ניאון כלאה באתר (FISH) ניתוח של שעתוק הגנים var ידי הטפיל בגרעינים בודדים של פ falciparum 1-IE. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע המתודולוגיה RNA-FISH לניתוח של שעתוק הגנים var בגרעינים בודדים של פ falciparum נגוע אריתרוציטים אדם. השיטה מבוססת על השימוש בdigoxigenin וביוטין שכותרתו RNA באמצעות בדיקות antisense TSA פלוס מערכת פלואורסצנטי פלטת 2 (פרקין אלמר), ניתוחים מיקרוסקופים ונבחר טריים פ falciparum IE. בשיטת כלאה באתר ניתן להשתמש כדי לפקח על שעתוק ורגולציה של מגוון רחב של גנים הביע בשלבים השונים של פ מחזור חי falciparum וניתן להתאמה למינים אחרים מלריה טפיל ואורגניזמים אחרים וסוגי תאים.

איור 1 מדגים תרשים זרימה של השלבים העיקריים ומשך הזמן של המתודולוגיה דגי רנ&quot;א. סדרה של תמונות מייצגות של ניסויים וגם גרועים השתמרו מוכתמים mRNA דגים באמצעות פ אחת falciparum אקספלורר מוצגים באיור 2. protozoan התאי זו יש גרעין קטן (1-1.5 קוטר מיקרומטר) שהוכתם כחול עם DAPI. עשרים וארבע שעות לאחר פלישה כדורית אדומה בפ falciparum תהליך רביית השסע, חלוק...

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים) כדי לזהות תעתיקי mRNA בתאים בודדים מאפשרת ניתוח של פעילות polygenic כגון שעתוק סימולטני של חבר אחד או יותר של<em&gt; Var</em&gt; משפחת multigene ב<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; אריתרוציטים נגועים<sup&gt; 1</sup&gt;. הטכניקה ניתנת להתאמה, וניתן להשתמש בסוגים שונים של גנים, תאים ואורגניזמים.

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

היצמדות של כדוריות דם אדומות (IE) נגועות ב-Plasmodium falciparum לרצפטורים אנדותליאליים אנושיים במהלך זיהומי מלריה מתוּוכת על ידי ביטוי של וריאנטים של חלבון PfEMP1 המקודדים על ידי גני var. הגנום ההפלואידי של P. falciparum מכיל כ-60 גני var שונים, כאשר עד כה סברו כי רק גן אחד מהם מותעת בכל תא בבת אחת במהלך שלב הדם של הזיהום. לא ברור כיצד מושגת רגולציה הדדית בלעדית שכזו של תעתוק גני var, וכמיכה גם זיהוי גני var בודדים או תתי-קבוצות של גני var הקשורים לרצפטורים שונים, והשפעת קישור דיפרנציאלי על התוצאה הקלינית של זיהומי P. falciparum. לאחרונה, פרדיגמת התעתוק ההדדי הבלעדי הוטלה בספק על ידי בדיקות תעתוק המבוססות על זיהוי תעתוקים בודדים של P. falciparum בתאי כדוריות דם אדומות נגועות בודדות, באמצעות אנליזת היברידיזציה של RNA באתר (FISH) של תעתוק גני var על ידי הטפיל בגרעינים בודדים של P. falciparum IE. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע מתודולוגיית RNA-FISH לצורך אנליזה של תעתוק גני var בגרעינים בודדים של כדוריות דם אדומות אנושיות נגועות ב-P. falciparum. השיטה מבוססת על שימוש בח probes של RNA אנטי-סנס המסומנים בדיגוקסיגנין ובביוטין באמצעות מערכת TSA Plus Fluorescence Palette (Perkin Elmer), אנליזות מיקרוסקופיות ו-P. falciparum IE שנבחרו לאחרונה. ניתן להשתמש בשיטת ההיברידיזציה באתר כדי לנטר תעתוק ורגולציה של מגוון גנים המבטאים את עצמם במהלך השלבים השונים של מחזור החיים של P. falciparum, והיא ניתנת להתאמה למינים אחרים של טפילי מלריה ולאורגניזמים וסוגי תאים אחרים.

שמי אלנה רנד ואני עובדת במרכז לפתולוגיה רפואית באוניברסיטת קופנהגן שבדנמרק. כאן, כ-60 אנשים מחלקים שונים בעולם עוסקים במלריה. הקבוצה שלנו עובדת עם טפילים מסוג plasmodium foci.הם הזנים האלימים ביותר הגורמים למחלת המלריה בבני אדם. *P. falciparum* מבטא חלבונים שטח בעלי תפקידים שונים, כגון היצמדות לתאי מאכסן. הקבוצה הגדולה ביותר של חלבוני היצמדות היא חלבוני ממбраנת תאי הדם האדומים של *P. falciparum*, המכונה PfMP1.קיימים לפחות 60 וריאנטים, אשר לגביהם סברו שרק אחד מהם נשחח בכל תא בבת אחת במהלך שלב הדם של הזיהום. במחלקה שלנו, אנו סבורים כי ייתכן שיותר מחלבון אחד נשחח בו-זמנית בטפילים. שיטה אחת לזיהוי פעילות זו היא השתמשת ב-mRNA פלואורסצנטי בשיטת hybridization fish.כאן אנו מציגים שיטה המותאמת אישית לזיהוי mRNA, תמלילים של שני גנים שונים בגרעין בודד של Erythrocytes נגועים ב-odum FCI. השלמת השיטה אורכת יומיים. היום הראשון כולל הכנה של גששים של RNA, הוספתם לטפילים המקובעים על למסות זכוכית והיברידיזציה במקום.היום השני כולל ריכוז נוגדנים, הגברה פלואורסצנטית והדמיה של הטפילים הצבועים במיקרוסקופ קונפוקאלי. כדי לספק סקירה כללית של הניסוי, מוצג תרשים זרימה של הפעולות והריאגנטים וחומרים קריטיים שנעשה בהם שימוש בניססוי: ערכת סימון RNA zap dig, biotin, RNA, labeling mix, paraform aldehyde, glacial acetic acid, pepin, anti dig antibody, anti biotin antibody, TSA PL plus fluorescence palate system, DPI RNAs, microtubes בנפח 1.5 mL, ETH ethanol, שקופיות זכוכית נקיות, כיסית זכוכית שעברה עיקור באוטוקלאב, ציוד סטרילי כגון מספריים ופינצטות, וצנצנת זכוכית לצימוד.יש לבדוק את הכריתיות הבלועות על ידי צביעת גימסון כדי לוודא שהן נמצאות בשלב ההתפתחותי הנכון. כלומר, ששלבי הטבעת המבצעים שעתוק של VAR נמצאים בסנכרון ובמצב טוב. קריטי לבחור את השלב ההתפתחותי המדויק של מחזור החיים שבו מתרחש השעתוק.מאחר שסוגי RNA בודדים נמצאים בשלבים שונים של ביטוי, מותסכים באופן ספציפי ומעובדים במהירות, יש לשטוף את התאים בעדינות לפני הכנת מריחות דם דקות ואיכותיות מאוד על שקופיות זכוכית נקיות; לאחר מכן מקבעים שכבה אחידה של תאי דם אדומים נגועים על שקופית הזכוכית בתמיסה של 4% paraform aldehyde ו-5% glacial acetic acid למשך 10 דקות. לאחר מכן שוטפים את שקופיות הזכוכית פעמיים ב-PBS, ומסירים בעדינות את הנוזל מהשקופיות באמצעות נייר סופג. לאחר מכן מבצעים פרמיליזציה לתאים בעזרת תמיסת hydrogen chloride בריכוז 10 millimolar שחוממה מראש, לפני הוספת ה-Pepsi.דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך שתי דקות לפני ההכשרה (hybridization). את הגששים (probes) דנטורו בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות, קררו במהירות על קרח, ולאחר מכן הוסיפו לתאים, שכעת מקובעים על השקופית. הניחו כיסוי זכוכית מעל התאים והסִירו בועות אוויר באמצעות קצה של פפיט קטן. לחחחו את תא ההכשרה על ידי הוספת טיפות של מים מזוקקים פעמיים למסבי תא ההכשרה, כדי שהשקופיות יישארו לחות בתוך התא.במהלך הליך ההכלאה (היברידיזציה), הכניסו את השקופיות לתוך תא ההכלאה להשכבה למשך הלילה בטמפרטורה של 48 °C. לאחר 16 עד 17 שעות של הכלאה, הוציאו בזהירות את השקופיות מתא ההכלאה. מהשלב הזה ואילך, אין דרישה מוחלטת לסביבה נקייה מ-RNase.שטפו את השקופיות בתוך צנצנת זכוכית מלאה ב-TNT buffer, תוך כדי וידוא שזכוכית הכיסייה נפרדת מהשקופית. חזרו על הליך השטיפה שלוש פעמים, ולאחר מכן חסמו אותן ב-TNB buffer למשך חצי שעה. הוסיפו לתאים את הנוגדנים המסומנים ב-anti dig או anti biotin המשוררים ל-HRP.ניתן להוסיף את שני סוגי הנוגדנים המסומנים בו-זמנית. אם מטרת הניסוי היא לזהות שני תמלילי mRNA בתאים, יש לדלל את הנוגדנים מראש. לאחר מכן, יש להדגיר בבופר TNB למשך שעה עד שעתיים, לשטוף שלוש פעמים בבופר TNT, ואז להוסיף לתאים השטופים פלואורוכרום אחד, FSE מדולל או cyan.יש להכין שלושה תמיסות באופן טרי. משלב זה ואילך, חשוב שלא לחשוף את השקופיות ישירות לאור חזק. יש להדגיר את השקופיות למשך 10 עד 15 דקות עם הפלואורוכרום.במידה ומגלים שני תמלילי mRNA לאחר הדגירה הראשונה, יש לשטוף את הצבע הראשון ולהוסיף את השני. בצעו שטיפה סופית ב-TNT Buffer. טבלו את השקופיות במים מזוקקים פעמיים לפני ייבוש באוויר.הוסיפו את הדגימה והניחו זכוכית כיסוי על השקופית. הסירו בועות אוויר ואיטמו את שולי זכוכית הכיסוי באמצעות לכה או לק לציפורניים בעל ייבוש מהיר. כאן ניתן לראות תא דם אדום (erythrocyte) נגוע בודד המכיל טפיל אחד.הצבע הכחול, ה-DPE, מייצג את ה-DNA של הטפיל, והצבע הירוק מייצג את ה-mRNA של גן אחד הנכתב. בתמונה השנייה, הצבע האדום מייצג את ה-mRNA של הגן השני, ובתמונה השלישית ניתן לראות את הצביעה הכפולה של שעתוק שני הגנים. התמונות חושפות גם שה-mRNAs המחוברים ממוקמים על גבי ה-DNA הגרעיני, ולא באופן כללי מעליו או לצדו.ב-99% מהאריתרוציטים המזוהמים, ניתן לזהות תעתוק mRNA של שני גנים. היבט חשוב של ניסוי זה הוא לבדוק שהגששים אינם נקשרים לגנים אחרים. בתמונה זו, הדגרנו את האריתרוציטים המזוהמים עם שני הגששים, אך רק גשש אחד נקשר ל-IE. הגנים האחרים אינם עוברים תעתוק כאן.מצב זה הפוך בתמונות האחרות הללו של הכריocytes הinfected שהוצגו. לטפילים מסוג odium phos palm יש בדרך כלל ממברנות שמורות היטב עם צביעה מוגדרת של DNA ושל RNA כאחד. אם התאים הם באיכות נמוכה מסיבה כלשהי, גם הצביעה תהיה דלה.כפי שמוצג בתמונה זו, ה-DNA וה-RNA ייראו מפוזרים, עכורים ולא מוגדרים יחסית. לסיכום, ניתן לומר שניתן ליישם שיטה זו בקלות גם על טפילים אחרים המועברים בדם. נתוני השעתוק שלנו נתמכו גם בניסויים לזיהוי החלבונים המתורגמים מה-mRNAs שנותחו, באמצעות נוגדנים ספציפיים המכוונים לחלבוני pf EMP one המבוטאים על פני השטח של תאים נגועים.

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

על ידי שילוב של כל שיטות להר...

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע...

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

תאי ענק טרופובלסט (TGCs) ממלאים תפקיד מפתח בשליה כדי להבטיח הריון בריא. אנו מציגים פרוטוקול להערכת מצב השעתוק של גנים ב-TGCs על ידי הכלאה פלואורסצנטית מתפתחת באתרה על קטעי קריוסטט של עוברים לאחר השרשה או תרביות לטווח קצר של קונוסים חיצוניים עובריים ביום 7.

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em&gt; In vivo</em&gt; תאים ענקים Trophoblast או<em&gt; במבחנה</em&gt; לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

למד את שיטת ה-FISH לניתוח שעתוק גנים בתאים בודדים ב-Plasmodium falciparum. השיטה מאפשרת זיהוי מקביל של מספר גנים var ומספקת תובנות לגבי דינמיקת השעתוק בטפילי המלריה.

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט

גלה סרטונים נוספים