Name: שינוי גנטי של Picoeukaryote Ostreococcus tauri (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למדו שיטת אלקטרופורציה לשינוי גנטי של האצה הימית Ostreococcus tauri. טכניקה זו מאפשרת יצירת שורות טרנסגניות יציבות למחקר ברשיות תאיות מורכבות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SynthSys המרכז לביולוגיה אינטגרטיבית מערכות במימון BBSRC ואת הפרס EPSRC D019621. האיחוד האירופי FP6 רשת מענק מצוינות &quot;Genomics ימית&quot; כדי FYB מימנה פיתוח שיטות שינוי גנטי.

1. הכנת חומר אצות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בתרבית Ostreococcus הם מי ים מלאכותיים (ASW). מלחי ים (בדרך כלל כ -40 גרם לליטר) הם מומסים במים deionised למליחות של 30 ppt, כפי שנמדד באמצעות מד מליחות. אמצעי העשרה 11,12, יסודות קורט מתכות וויטמינים נוספים, כמתואר בטבלה 1-3. התקשורת היא אז פילטר עיקור באמצעות כמה 0.22 מיקרומטר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך תחזוקה, תאים של מתח Ostreococcus OTTH95 הם תת תרבות בסביבה נקייה מחיידקים, בדילול של 1/100 ב ASW טרי כל 7 ימים ו גדל תחת אור קבוע גידול צמחים בחממה מצויד אור הירח הכחול הסינון. עוצמת האור צריך להיות קרוב ל 20 μmol m -2 s -1 והטמפרטורה נשמרת על 20 ° C. התאים אינם דורשים תסיסה מתמדת, אבל הם מזועזעים אחת ל -2 עד 3 ימים כדי למנוע צבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשינוי זה, 50 מ&quot;ל של תאים נדרשים על התא דהnsity של 20-30 x 10 6 מ&quot;ל -1, שאמור להיות מושג לאחר 5-7 ימים culturing המשנה. צפיפות התאים axeny משוער ניתן לקבוע באמצעות אחת cytometry זרימה או haemocytometer לפחות הגדלה של X40. </li></ol> 2. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA לשינוי. לשינוי זה, 5 מיקרוגרם של ה-DNA, טהור פלסמיד linearised נדרש בריכוז של 1 מיקרוגרם / μl במים deionised סטרילית. כדי להשיג את ה-DNA, החוקרים ממליצים להשתמש midi Qiagen ערכת הכנה, אם כי שיטות אחרות יכול לעבוד באותה מידה. לעכל את המוצר עם האנזים החותך ב עמוד השדרה של וקטור פעם, אבל לא transgene או הגן הבחירה. יתר על כן לטהר ולרכז את ה-DNA ליניארי שהתקבל על ידי משקעים אתנול, ו resuspend המוצר בהיקף המתאים מים באיכות גבוהה deionised סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צינורות microcentrifuge המכילים DNA 5 מיקרוגרם לשינוי זה. Controאני עם ה-DNA לא נחוץ כל שורה בתא להשתנות. זכור את הצינורות על קרח, יחד עם קובט electroporation 2 מ&quot;מ לשינוי זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2.2 מ&quot;ל של חיץ resuspension לכל שינוי. ממיסים סורביטול לפתרון M 1 ב DDH 2 O, מוסיף 0.1% חומצה pluronic F68 ו-מסנן לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חומצה pluronic F68, לריכוז סופי של 0.1% אל התאים, ועל גלולה אותם במשך 10 דקות בכל 8000x גרם ב 10 ° C בצינור 50 מ&quot;ל עם תחתית בצורת חרוט. מיד resuspend התאים מ&quot;ל 1 של חיץ resuspension ידי pipetting למעלה ולמטה, ולהעביר את הצינור microfuge. ספין למטה במשך 10 דקות ב 8000 XG ב 10 ° C, עובד מהר, חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קצה גזירה, resuspend כל גלולה האחרון μl 40 מאגר resuspension. הוסף 40 μl של תאים resuspended אל צינור ה-DNA של כל linearised על קרח, לערבב בעדינות ולהעביר את קובט electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את קובט על electropנאום המכונה. לשנות את ההגדרות כדי kV 6 ס&quot;מ -1, 600 Ω, ו 25 μF. Electroporate התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים electoporated ב cuvettes את בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולהשתמש זמן להכין את תרבות צלוחיות רקמות. לתייג אותם להוסיף 30 מ&quot;ל של ASW טרי זה. קח 1 מ&quot;ל מתוך בקבוק אחד ובעדינות להוסיף אותו קובט המקביל. דגירה של 2 דקות בעדינות להסיר את ASW, עכשיו המכיל כדורית של תאים בעדינות ולאט לאט פיפטה ישירות ASW בבקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים בדרך כלל להישאר כדורית. יש להיזהר לא ללחוץ או להפריע את התאים מצטברים ברגע זה. אפשר התאים להתאושש בחממה למשך 1-2 שעות, resuspend מכן על ידי רועדת על צלוחיות. בשלב זה, התאים צריכים resuspend בחופשיות גושים לא צריך להיות גלוי. השאירו את התרבויות לשחזר לילה בחממה. </li></ol> 3. הכללה של תאים בצלחות במצע חצי מוצק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lאני&gt; למחרת, החיטוי פתרון של 2.1% נקודת התכה נמוכה agarose ב DDH 2 O בבקבוק המכיל מוט ערבוב. שמור מותכת על 65-90 מעלות צלזיוס בכוס גדולה יותר המכילה מים על stirrer חימום מגנטי. לשינוי זה להכין 8 צלחות פטרי (בקוטר 55 מ&quot;מ) ו -8 צינורות x 15 מ&quot;ל כל אחת מכילה 9 מ&quot;ל של ASW, בתוספת מבחר הנדרש. אם אתה משתמש Nourseothricin או G418, השתמש 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים השתנו מן החממה. עבודה flowhood סטרילית, הוסף 1 מ&quot;ל של רותחים LMP agarose כדי מ&quot;ל 9 באחד הצינורות. סגור את הצינור, ומערבבים על ידי היפוך. לאחר מכן הוסף 0.5 מ&quot;ל של תאים שהפכו זה עתה, לערבב במהירות ולשפוך לתוך הצלחת. חזור על תהליך זה עם 7 צינורות הנותרים, ואז להמשיך בקבוק השינוי הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו הצלחות לפתוח בשכונה זרימת במשך שעה, על agarose להגדיר. ואז לסגור את הצלחות ולהעבירם רבועים מנות גדולות פטרי, אשר תקיים 4 צלחות כל אחת. לאטום את השנינות צלחות מרובעH parafilm. לציין כי הצלחות לא יקבע לחלוטין, וכתוצאה מכך, ג&#39;ל הוא שברירי מאוד. יש להיזהר לא לשבור את הג&#39;ל במהלך הטיפול בו הצלחות. מניחים את כל צלחות מרובעות בחממה. </li></ol> 4. מבחר המושבות טרנספורמציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות אמור להופיע לאחר 10 עד 21 ימים על הצלחות שינוי, אך לא על צלחות שהפכו מדומים. לקחת מושבות להשתמש פיפטה 200 μl עם חתוכים טיפים. שעליך לעשות הוא לבחור מושבות בחינם ולמצוץ את המושבה הירוקה. יש להיזהר שלא לכלול תאים מן המושבות השכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים 2 מ&quot;ל של מדיום נוזל המכיל את הבחירה, בצלחת בארות 24. בעת שימוש Nourseothricin, השתמש 1.75 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מערבבים ידי pipetting מעלה ומטה. בחר 24-50 מושבות לכל שינוי. לאטום את הצלחות עם parafilm והעברה חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבוע, להעביר 100 μl של כל טוב 2 מ&quot;ל טרי ASW עם מבחר בצלחת בארות 24 ולגדול על additionaL-7 ימים. שורות תאים ששרדו יכול לשמש למחקרים נוספים. שילוב יציבה למספר הגנום הכניסה יש לנתח באמצעות PCR ו כתם הדרום. הדנ&quot;א הגנומי ניתן להשיג מטרות אלה באמצעות כל שיטה לאורך בקנה מידה סטנדרטית להפקת DNA הצמח. </li></ol> 5. נציג תוצאות פיצול תאים 1/100 הגיעו צפיפות של 25 מיליון תאים למיליליטר לאחר גידול של 7 ימים. Electroporation של תאים עם ההגדרות המתאימות הביא כמה זמן קבועים בין 10 ל 14 אלפיות השנייה. כאשר תאים מועברים בינוני צלוחיות תרבות, כדורית של תאים צריך טופס. כאשר מזועזע קלות אחרי שעה, התאים צריכים בקלות resuspend. הכללה של 1 מ&quot;ל תאים הופכים אגר LMP 0.2% אמורה לגרום ג&#39;ל חצי מוצק עקבי אבל רק. מושבות אמור להופיע לאחר 10 עד 21 ימים. כאשר למהפך 5 מיקרוגרם של ה-DNA linearised באמצעות פרוטוקול לעיל, 50-100 מושבות לכל שינויהצלחת היו אמורים בדרך כלל, לעומת אף על לוחות בקרה שליליות. ~ 80% מושבות הרים נבחרו באופן חיובי על ידי עמידות לאנטיביוטיקה במדיום נוזלי נעשה שימוש במחקרים הבאים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז סופי </td><td> המניות פתרון </td><td> נפח של 1 ליטר </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td> 8.83 x 10 -4 M </td><td> 75 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3.63 x 10 -5 M </td><td> 2.68 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> β-glycerophosphate </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2.16 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> H 2 3 SEO </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1.29 מ&quot;ג / ל &#39;ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריס בסיס (pH 7.2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121.1 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> K עקבות פתרון מתכת </td><td></td><td> טבלה 2 </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> f / 2 פתרון ויטמין </td><td></td><td> לוח 3 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1. המרכיבים בינוני לצמיחה של א &#39; tauri 11, 12. איפור בנפח כולל של 1 ליטר של מי ים מלאכותיים כדי מליחות של 30 ppt, ולהוסיף את המרכיבים הנ&quot;ל מפתרונות מניות כמצוין. סנן-לעקר בינוני ושימוש בתוך שבוע. מניות של כל תרכובות מלבד פתרון ויטמין ניתן ונקווה להוסיף 6 מ&quot;ל של פתרון זה עבור כל ליטר של המדיום. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז סופי </td><td> המניות פתרון </td><td> סכום של 1 ליטר </td></tr><tr><td> Na 2 </sUB&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41.6 גרם </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6 שעות 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3.15 גר &#39; </td></tr><tr><td> Na 2 מו 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6.3 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22.0 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 שעות 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10.0 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180.0 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9.8 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה <sub&gt; 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2. עקוב אחר פתרון מתכת 11,12. לעשות עד לסך של 1 ליטר, ב ד&quot;ה 2 O, וחום לפרק. הפתרון aliquot ומקפיאים לאחסון. הריכוזים האחרונים הצביעו מתייחסים בינוני של דבר, לא הפתרון מתכת עקבות. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז סופי </td><td> המניות פתרון </td><td> סכום של 1 ליטר </td></tr><tr><td> ויטמין B 12 </td><td> 1 x 10 מ -10 </td><td> 1 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ביוטין </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0.1 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> תיאמין • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> לוח 3. f / 2ויטמין הפתרון 11. לעשות עד לסך של 1 ליטר ב DH 2 O, פילטר לעקר, aliquot ומקפיאים. הריכוזים האחרונים הצביעו מתייחסים בינוני של דבר, לא הפתרון ויטמין. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה גרפית של תהליך השינוי. ייצוג סכמטי של הליך גנטית כדי להפוך Ostreococcus tauri ידי electroporation. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> איור 2. תאים גדילה והתרבות. הם תת תרבות בסביבה נקייה מחיידקים, בדילול של 1/100 ב ASW טרי כל 7 ימים, גדל תחת אור קבוע גידול צמחים בחממה מצויד אור ירח כחול הסינון. עוצמת האור צריך להיות קרוב ל 20 μmol m -2 s -1 והטמפרטורה נשמרת על 20 מעלות צלזיוס תאים אינם דורשים תסיסה מתמדת, אבל הם שלhaken אחת ל -2 עד 3 ימים כדי למנוע צבירה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> איור 3. במושבה היווצרות על 0.2% LMP agarose. העברת 4 צלחות פטרי צלחת גדולה בכיכר, ואת החותם עם parafilm (למעלה משמאל). כאשר הקימו מושבות, פשוט לבחור בחינם (באופן אידיאלי בצורת conically) מושבות (מימין למעלה) ולמצוץ אותם בצלחת עם טפטפת P200. לא אמורה להיות מושבות בשלט שלילית (מימין למטה).

<ol><li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li>
<li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+ultrastructure+of+O.+tauri%3A+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749(2007).</li>
<li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li>
<li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li>
<li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+J%22%5BJournal%5D)">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li>
<li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+in+the+green+lineage%3A+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li>
<li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li>
<li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light%2Fdark+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192(2010).</li>
<li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li>
<li>Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. , 201001174050 (2010).</li>
<li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li>
<li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li>
<li>Djouani-Tari, elB. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus%3A+Application+to+circadian+clock+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471(2011).</li>
<li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957(2010).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

נייד axeny המדינה והתרבות היא בעלת חשיבות מכרעת לתהליך השינוי. למרות שתאי נשמרים בדרך כלל מחזורים של 12 שעות אור, 12 שעות חושך, יעילות השינוי בתאים הגדלים בתנאים הללו נמצאו מספיק. במהלך pelleting / resuspension צעדים חוזרים ונשנים, התאים תמיד צריך resuspend בקלות. אם תאים צבירה, או חומר דמוי ריר נוכח, עדיף להתחיל את התהליך מההתחלה שוב. בדרך כלל, ~ 50 מושבות ניתן לצפות על כל צלחת שינוי, לעומת אף על צלחת הביקורת השלילית. במקרה של יעילות הטרנספורמציה נמוכה, תנאי culturing צריכים להיות מגוונים על מנת להבטיח התאים נמצאים במצב אופטימלי. המשתנים המשפיעים על יעילות השינוי כוללים טמפרטורת הסביבה במעבדה (צריך להיות קרוב ל 20 מעלות צלזיוס) ומהירות הטיפול (נוהל מ pelleting תאים [2.3] להחלמה [2.7] צריך לקחת ~ 1 שעה). כמו כן, חשוב כי כל כמה פתרונותRe עשה טרי לפני כל שינוי. עבור הכללה צלחות, ריכוז LMP agarose הוא קריטי. תאים Ostreococcus לא יגדל ב ריכוזים גבוהים agarose, ויהיה לפזר בריכוזים נמוכים. שלושה וקטורים שינוי עבור Ostreococcus פורסמו בעבר 6, ו וקטורים נוספים צפויים להיות שנוצר ופורסם זמן קצר. וקטור קיים פוט לוק 6 מאפשר שימוש promotor הבחירה בשילוב עם תג גחלילית בטרמינל C-בלוציפראז המאפשר בחירת הקו מהונדס מהיר בתוספת דפוסי הביטוי צייתן, בעוד וקטור Potox 6 נושא מושרה חזק 13 promotor שנלקח Ostreococcus זיקה גבוהה פוספט Transporter (HAPT) הגן ביטוי יתר של הגן של עניין. וקטור Potox לוק נובע Potox, נושא בלוציפראז סמן נוסף שניתן להשתמש בו לבחירה ישירה של קווי overexpression <sעד&gt; 14. סמנים בחירה מוצלחת על וקטורים אלו Nourseothricin ו G148. עם זאת, תאים Ostreococcus עמידות מאוד בפני אנטיביוטיקה רבים, ריכוזי חומרים הדרושים מבחר מהונדס לתאי Ostreococcus הוא גבוה יותר מאשר עבור מערכות המודל המקובל (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל). אמנם התהליך נראה בלתי יעיל, מספר גדול של תאים ו-DNA פלסמיד צורך בהליך זה אינו מהווה מכשול משמעותי. הגבלה גדולה יותר היא שכל קו שנוצר כי הוא עמיד בפני סמן לבחירה צריך להיות מנותח בנפרד כדי לבדוק את המבנה כולו משולב ב-DNA. ראינו דוגמאות שבהן ביטוי מוצלח של סמן לבחירה לא תואמות את הכניסה של הגן בפועל של עניין, כלומר אינטגרציה חלקי יכול להתרחש. ככל הנראה, הכניסה אקראי לתוך הגנום גם אומר שאין שליטה על הכניסה לאתר באמצעות שיטה זו, ושיטות בased על רקומבינציה הומולוגיים כרגע בשלבי פיתוח. עם זאת, השיטה המתוארת כאן היא, למיטב ידיעתנו, כיום השיטה מאופיינת רק כדי לייצר תאים Ostreococcus מהונדסים גנטית. כמו Ostreococcus tauri רק לאחרונה נעשה שימוש כאורגניזם מודל ניסיוני, רוב שיטות עבודה עם תאים אלה עשוי להתפתח להיות מעודן על ידי קהילת המחקר הגוברת מעורב. פרוטוקול זה נועד לעזור לאנשים להתחיל לעבוד עם Ostreococcus, אבל בשום פנים ואופן לא מתיימר לתאר את כל מה שיש לדעת על שינוי גנטי של microalga זה. אמון המחברים כי הקוראים יוכלו להתאים את פרוטוקול לצרכים שלהם כמו הבדלים קטנים חממות (רמות האור או איכות) ופרמטרים נוספים יהיו קיימים וסביר צריך להיות מותאם במעבדה כל אדם לקבל את התרבויות בריאים הדרושים לכך פרוטוקול. לאחר שליטה בטכניקות שתוארו כאן,וקטורים ניתן לבנות ליצור זורח, פלורסנט, או קווים אחרים היתוך מתוייגים תחת שליטה של ​​מגוון רחב של promotors. זו פלטפורמה מרגש ניסיוני הספר יהיה שימושי ללמוד כמה בעיות ביוכימיות מסובכות נפתרות ב eukaryote מורכבות מופחתת, בו גישות תרופתי הם הקלו מאוד 3.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> בינוני מרכיבים </td></tr><tr><td> כימי </td><td colspan="2" > מספר קטלוגי </td><td> ספק </td></tr><tr><td> מיידית האוקיינוס ​​ימית מלח </td><td colspan="3"> מ <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> או <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> 2-גליצרול פוספט הרכב: מימה מלח </td><td colspan="2"> G9422-100 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> H 2 3 SEO </td><td colspan="2"> 84920-250 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> אולטרה טהורים טריס </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500 גרם </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6 שעות 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Na 2 מו 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100 גרם-R </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 שעות 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ויטמין B 12 (cyanocobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ביוטין </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> תיאמין • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td colspan="2"> A9518-25 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Neomycin </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td colspan="4"> חומרים מתכלים ל culturing </td></tr><tr><td colspan="2"> פריט </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ספק </td></tr><tr><td colspan="2"> תרביות רקמה קנקן T25 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> תרביות רקמה קנקן T75 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedלא </td></tr><tr><td colspan="2"> תרביות רקמה קנקן T175 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> הדף TPP בקבוק מסננים, 1 ליטר, להשלים </td><td> 99950T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP מסננים בקבוק העליון, 500 מ&quot;ל, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> הדף TPP בקבוק מסננים, 250 מ&quot;ל, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> הדף TPP בקבוק מסננים, 150 מ&quot;ל, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> מליחות מטר ימית Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3" > כימיקלים לשינוי </td></tr><tr><td> כימי </td><td> קטלוגמספר </td><td> ספק </td></tr><tr><td> D-סורביטול </td><td> S6021-1 ק&quot;ג </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> F-68 Pluronic פתרון </td><td> P5556-100 מ&quot;ל </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> ורנר </td></tr><tr><td> נקודת התכה נמוכה agarose </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> מתכלים לשינוי </td></tr><tr><td> פריט </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ספק </td></tr><tr><td> תרביות רקמה קנקן T25 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> תרביות רקמה קנקן T75 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> תרבות Flask רקמות T175 השעיה Cultures פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> גריינר צינורות צנטריפוגות 50 מ&quot;ל </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> הגן Pulser / MicroPulser cuvettes, 0.2 הפער ס&quot;מ, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> ביו רד </td></tr><tr><td> פטרי צלחת עגולה PS 3 פתחי אוורור H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR הבינלאומי </td></tr><tr><td> פטרי צלחת מרובעת עם קלקר פתחי 4 סטרילית ידי 120mm קרינה ברורה </td><td> FB51788 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> אור ירח כחול בהיר מסנן </td><td> 183 </td><td> לי תאורה </td></tr></tbody></table>

שינוי גנטי של picoeukaryote<em&gt; ostreococcus tauri</em

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

בעיות נפוצות פוגע ההתקדמות המהירה במדעי הצמח כולל רקמות הסלולר, והמורכבות האורגניזם כולו, בעיקר רמה גבוהה של יתירות גנומית להשפיע על הגנטיקה פשוטים צמחים גבוהים יותר. אורגניזם מודל הרומן Ostreococcus tauri הוא הקטן ביותר החופשי חי eukaryote הידוע עד כה, ו בעל גודל הגנום הקטינה באופן משמעותי את המורכבות ואת 1,2 הסלולר, באה לידי ביטוי על ידי נוכחות של רק אחד רוב האברונים (mitochondrion, הכלורופלסט, מחסנית Golgi) לכל התא, גנום המכיל רק ~~~HEAD=NNS 8000 גנים. יתר על כן, השילוב של unicellularity והתרבות קל מספק פלטפורמה מקובל גישות וביולוגיה כימית. לאחרונה, Ostreococcus כבר מצליחים ללמוד המנגנונים הבסיסיים העומדים בבסיס מדידת זמן היממה 3-6. תוצאות של אורגניזם מודל זה השפיעו לא רק מדע הצמח, אלא גם בביולוגיה של יונקים 7. דוגמה זו מדגישה עד כמה ניסויים מהירהeukaryote פשוט משושלת ירוק יכול להאיץ מחקר באורגניזמים מורכבים יותר על ידי יצירת השערות לבדוק בדיקה בשיטות אפשרי מבחינה טכנית רק רקע זה של מורכבות מופחתת. ידיעת הגנום ואת האפשרות לשנות את הגנים הם כלים חיוניים כל מין המודל. גנומי 1, Transcriptomic 8, ומידע proteomic 9 על מין זה הוא זמין בחינם, בעוד השיטות שפורסמו בעבר 6,10 גנטית להפוך Ostreococcus ידועים במעבדות ספורות בעולם. במאמר זה, את שיטות ניסיוניות גנטית להפוך את יצור דגם הרומן עם ביטוי יתר לבנות באמצעות electroporation מתוארים בפירוט רב, כמו גם את שיטת הכללת תאים טרנספורמציה של אחוז agarose נמוכה על מנת לאפשר בחירה של קווים ששינו שמקורם אחד הפך התא. בעקבות יישום מוצלח של Ostreococcus למחקר היממה, ההתעניינות הגוברת Ostreococcus ניתן לצפות תחומי מחקר מגוונים בתוך ומחוץ מדעי הצמח, כולל בתחומים ביוטכנולוגיים. חוקרים מגוון רחב של מדעים ביולוגיים ורפואיים שעובדים על הביוכימיים המשתמרים לשקול מחקר ב רודף Ostreococcus, ללא המורכבות גנומית האורגניזם המינים מודל גדולים יותר.

מאמר זה מתאר את השינוי הגנטי של unicellular אצה ימית<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; על ידי electroporation. זה האורגניזם האיקריוטים הוא פלטפורמה מודל יעיל צמחים גבוהים יותר, possesing המורכבות גנומית הסלולר הקטינה באופן משמעותי ולהיות מקובל בקלות לתרבות הן התא וביולוגיה כימית.

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

בעיות נפוצות המעכבות התקדמות מהירה במדעי הצמחים כוללות מורכבות ברמת התא, הרקמה והאורגניזם השלם, ובייחוד רמה גבוהה של מורכבות גנומית...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק ולבחור שושלות טרנסגניות יציבות של אורגניזם המודל החדש, *Austria Occus Tori*, מין של אצות פיקו-איקריוטיות ימיות. הדבר מושג תחילה על ידי הפקת משקעי תאים מ-50 milliliters של תרבית ALG דחוסה לכל טרנספורמציה. השלב השני הוא ערבוב התאים עם DNA ליניארי, ולאחר מכן ביצוע אלקטרופורציה.לאחר דילול התאים שעברו טרנספורמציה במצע טרי ודגירה למשך לילה, יש להוסיף 0.2% agarose בנקודת התכה נמוכה וסוכן ברירה, ולשפוך את התערובת לתוך צלחות פטרי קטנות. השלב הסופי הוא בידוד המושבות שצמחו לאחר שבועיים עד שלושה שבועות של דגירה באור כחול קבוע. לבסוף, נעשה שימוש בברירה במצע נוזלי ובניתוחים מולקולריים עוקבים כגון PCR ו-southern blot כדי להוכיח שילוב מוצלח של ה-construct לגנום של הקווים הטרנסגניים שנוצרו.היתרון העיקרי בשימוש באורגניזם זה על פני אורגניזמי מודל קיימים כמו Arabidopsis הוא ההפחתה המשמעותית של המורכבות הגנומית, המאפשרת לחקור רשתות בקרה ברקע כמעט ללא כפילות גנטית. למרות שבמעבדה שלי השתמשנו ב-osteo occus כדי לחקור את השעון הביולוגי של הצמח, ניתן להשתמש בו כדי לחקור רשתות תאיות מורכבות רבות אחרות. לפיכך, ההשלכות של טכניקה זו חורגות הרבה מעבר לתחום הביולוגיה של הצמחים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שלמרות שהשלבים הבודדים נראים פשוטים למדי, טיפול נכון בתאים וזרימת עבודה יעילה חיוניים להשגת תוצאה טובה. חלקים מההליך יודגמו על ידי Culin Kish, עוזר מחקר מהמעבדה. תאי Austria Occus גודלים במי מלח מלאכותיים או ב-SW; כדי להכין SW המיסו 40 גרם לליטר.מלחים ימיים במים דיוניים עד למליחות של 30 חלקים לאלף או PPT כפי שנמדד. באמצעות מד מליחות, הוסיפו העשרה, רכיבי קו৷ם של מתכות קו৷ם וויטמינים, ולאחר מכן סננו בסטריליזציה דרך מסנן של 0.22 מיקרון תאים גולמיים של Austria cocus זן O TT H 95 ב-SW תחת תאורה קבועה. באינקובטור גידול צמחים המצויד במסנן אור כחול (moonlight blue), עוצמת האור צריכה להיות קרובה ל-20 micromoles per meter square per second, והטמפרטורה תישמר ב-20 °C. התאים אינם דורשים ערבוב קבוע, אך נוערים פעם אחת בכל יומיים עד שלושה ימים כדי למנוע אגרגציה.לתחזוקה, בצעו תרבית משנית של התאים באופן אספטי בדילול של 1 ל-100 ב-SW טרי בכל שבעה ימים. כל טרנספורמציה דורשת 50 milliliters של תאים בצפיפות תאים של 20 עד 30 כפול 10⁶ תאים ל-milliliter. יש להגיע לצפיפות זו חמישה עד שבעה ימים לאחר התרבית המשנית.ניתן להעריך את צפיפות התאים והחיוניות באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer) בהגדלה מינימלית של 40 เท่า, או באופן מועדף באמצעות ציטומטריה זרימה (flow cytometry). דוגמה של תרביות בריאות לעומת תרביות שאינן בריאות מוצגת כאן.כל תרשים פרמטרי ביולוגי מציג פיזור צדי או SSC על ציר ה-y מול פלואורסצנציה אדומה לתא או FL three על ציר ה-x. FL three מייצג פלואורסצנציה אדומה של כלורופיל, ו-SSC מעיד על גודל תא יחסי. תאים בריאים נמצאים בתוך חלון ה-Austria Occus, בעוד שתאים גוועים או חיידקים מזיהמים נמצאים מחוץ לחלון זה.באופן אידיאלי, יותר מ-99% מהתאים צריכים להיות בחלון ה-Austria Occus. עבור טרנספורמציה גנטית יעילה, כל טרנספורמציה דורשת five micrograms של פלסמיד ליניארי טהור, DNA בריכוז של one microgram per microliter. במים דה-יוניים סטריליים, הפלסמיד הולניארされました על ידי אנזים שחותך בעמוד השדרה של הווקטור המשמש, אך לא בטרנסגן או בגן הבחירה.שמרו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה המכילה DNA על קרח יחד עם קטר electroporation בגודל שני מילימטרים עבור כל טרנספורמציה. בקרה ללא DNA נחוצה עבור כל שלב של טרנספורמציה של קו תאים. עבור כל טרנספורמציה, העבירו 50 milliliters של תאים למבחנה בעלת תחתית קונית, הוסיפו 0.1%onic acid F 68, וסבבו בצנטריפוגה במשך 10 דקות ב-8, 000 times G בטמפרטורה של 10 degrees Celsius.כדי לשקע את התאים, יש להסיר מיד את הנוזל העליון ולהוסיף לתאים מיליליטר אחד של תמיסת Resus suspension buffer. יש לסuspended את התאים על ידי פיפטינג מעלה ומטה, להעביר לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה ולסובב במשך 10 דקות ב-8,000 ×g בטמפרטורה של 10 °C. תוך עבודה מהירה, יש לשטוף את התאים פעם נוספת לאחר הסבב השני.גזרו קצה של טיפ P 200 כדי לסבסב (resuspend) כל משקע ב-40 µL של Resus suspension Buffer. העבירו 40 µL של התאים המסובסבים לכל מבחנה של DNA לינארי על קרח. ערבבו בעדינות והעבירו למכשיר האלקטרופורציה.הניחו את הקובייטה במכשיר האלקטרופורציה. כוון את ההגדרות ל-6 kV/cm, 600 ohms ו-25 µF. בצעו אלקטרופורציה לתאים.דגרו את התאים בקוובטות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. במהלך זמן זה, סמנו את בקבוקי תרבית הרקמה והוסיפו 30 milliliters של a SW טרי לכל בקבוק. הוציאו מיליליטר אחד של a SW מכל בקבוק והוסיפו אותו בעדינות לקוובט המתאימה, ודגרו למשך שתי דקות.בשלב הבא, הוצא בעדינות את ה-a SW המכיל כעת את גוש התאים, ובזהירות ובאיטיות פט bezpośrednio לתוך ה-a SW. בבקבוק התרבית, התאים יישארו בדרך כלל בגוש גדול. הקפד לא לנער או להפריע לתאים המגובשים בשלב זה. אפשר לתאים להתאושש באינקובטור במשך שעה עד שעתיים.לבסוף, השעה את התאים על ידי ניעור ידני של הבקריקה. בשלב זה, התאים אמורים להתחדר בחופשיות לתרחיף ולא אמורים להיראות גושים. השאר את התרביות להתאוששות למשך הלילה באינקובטור; ביום שאחרי האלקטרופורציה, עקר באוטוקלאב תמיסה של 2.1% low melting point haase במים מזוקקים פעמיים בבקבוק המכיל מוט מגנטית.שמרו במצב נוזלי בטמפרטורה של 65 עד 90 °C בתוך כלי כימי גדול יותר המכיל מים על בוחש מגנטי מחומם. עבור כל טרנספורמציה, הכינו שמונה צלחות פטרי בנפח 50 מילימטר ושמונה מבחנות בנפח 50 מיליליטר, שכל אחת מהן מכילה 9 מיליליטר של SW פלוס. הברירה הנדרשת.הוציאו את התאים שעברו טרנספורמציה מהאינקובטור. החלק המאתגר ביותר בפרוצדורה זו הוא הכנסת התאים שעברו טרנספורמציה לתוך ג'לי agros בריכוז נמוך מבלי לפגוע בשלמות התאים עקב חשיפה לחום רב מדי. לכן, חשוב לבצע את השלבים הבאים של הפרוצדורה במהירות וביעילות תחת מנדף זרימה סטרילי.הוסיפו 1 mL של aase בנקודת התכה נמוכה, בטמפרטורה הקרובה לרתיחה, ל-9 mL של a SW. באחת הפרובות, סגרו את הפרובה והפכו אותה כדי לערבב. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 mL של תאים שעברו טרנספורמציה טריים. סגרו במהירות והפכו את הפרובה כדי לערבב, ואז שפכו את תוכנה אל תוך צלחת פטרי.חזור על תהליך זה עם שבעת המבחנות הנותרות ולאחר מכן המשך לבקבוק הטרנספורמציה הבא. השאר את הצלחות פתוחות במנדף הזרימה למשך שעה כדי שהמערך יתייצב. לאחר מכן, כסה את הצלחות והעבר אותן בזהירות לצלחות פטרי ריבועיות גדולות, שכל אחת מהן מכילה ארבע צלחות עגולות.מכיוון שהצלחות לא התקשחו לחלוטין, הג'ל שברירי מאוד. היזהרו לא לשבור את הג'ל בעת טיפול בצלחות. אטמו את הצלחות המרובעות באמצעות פאראפילם והכניסו אותן לאינקובטור.ברגע שמופיעות מושבות, השתמשו בפיפט של 200 µL עם טיפים בעלי מסנן (cutoff tips). כדי לבודד מושבות תחת מנדף סטרילי, בחרו פשוט מושבות מבודדות ושאבו מושבה ירוקה. הקפידו לא לכלול תאים ממושבות סמוכות.העבירו את התאים לשני מיליליטרים של מצע נוזלי המכיל את הסלקטור. בתוך פלטה בעלת 24 בארות, ערבבו באמצעות פיפוט למעלה ולמטה. לאחר בחירת 24 או 48 מושבות לכל טרנספורמציה, אטמו את הפלטות באמצעות פארא-פילם (Parafilm) והעבירו למדגרה.לאחר שבוע, העבירו 100 µL מכל באר ל-2 mL של מצע SW טרי עם סלקציה. בצלחת 24 בארות, גדלו למשך שבעה ימים נוספים. ניתן להשתמש בשורות התאים ששרדו למחקרים נוספים באמצעות טרנספורמציה של 5 µg של DNA ליניארי.בשימוש בפרוטוקול זה, אמורות להופיע 20 עד 60 מושבות לכל צלחת טרנספורמציה לאחר שבועיים עד שלושה שבועות. כ-80% מהמושבות שנבחרו נבחרו באופן חיובי על ידי עמידות לאנטיביוטיקה במצע נוזלי, ושימשו במחקרים הבאים לאחר ביצוע הליך זה.ניתן לבצע לאחר מכן שיטות אחרות, כגון PCR או Southern blot, כדי לאמת את מספר ההכנסות ואת מיקומו של הגן trench לאחר פיתוחו. טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחומי השעון הביולוגי ומחזור התא להבין את הרכיבים וההתנהגויות המורכבים של המערכות שלהם באורגניזם מודל חדש זה, Austria Caucus. Tori. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן יצירת קווי Austria caucus טרנסגניים.

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הפרוטוקול מתאר ביטוי חלבון באמצעות שמרים...

ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris</em

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

מקור: Stefan, A., et al., היתרונות הרב-צדדיים של ביטוי משותף של חלבון ב-Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את ההליך להפיכת Escherichia coli עם פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה, כולל הכנת תאים, אלקטרופורציה, התאוששות ובחירת טרנספורמציה.

הכנה וטרנספורמציה של חיידקים באמצעות אלקטרופורציה במתח גבוה

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

ביטוי משותף של חלבונים הוא אלטרנטיבה רבת עוצמה לבנייה מחדש במבחנה של קומפלקסים של חלבונים, והוא מסייע בביצוע בדיקות ביוכימיות וגנטיות in vivo. כאן אנו מדווחים על השימוש בביטוי משותף של חלבונים ב-Escherichia coli כדי להשיג קומפלקסים של חלבונים, ולכוונן את תדירות המוטציות של התאים.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

שינוי Biolistic הוא שיטה המשמשת ליצירת אינטגרציה יציבה של DNA לתוך הגנום של neoformans הפתוגן קריפטוקוקוס האופורטוניסטי באמצעות רקומבינציה ההומולוגית. נדגים שינוי biolistic של מבנה, שבו יש קינאז אצטט גן המקודד התמזג mCherry תג הניאון לneoformans ג.

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

אנו מציגים כאן תיאור אחיד של טכניקות שיכולות לשמש לפיתוח, לשנות, לנהל, ולבדוק ביטוי חלבון Heterologous של boulardii Saccharomyces שמרים פרוביוטיים.

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

ביולוגיה סינתטית מאפשר ההנדסה של חלבונים עם מאפיינים חסרת תקדים באמצעות החדרת חומצות אמינו קאנונית co-translational. . הנה, הצגנו איך spectrally אדום-העביר גרסה של fluorophore GFP-סוג עם מאפייני ספקטרוסקופיות הרומן פלורסצנטיות, הנקרא חלבון פלואורסצנטי "זהב" (GdFP), מופק ב e. coli באמצעות הלחץ הסלקטיבי ההתאגדות (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.

שיטות לאלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה ב- Limosilactobacillus reuteri DSM20016

בכתב יד זה, אנו מספקים פרוטוקול מקיף להערכת הישרדות אנטיביוטיקה עבור Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus, הפיכת פלסמידים ל - P. aeruginosa ו- S. aureus כדי ליצור זני כתב ולדמיין וריאנטים פנוטיפיים, כגון מתמידים, על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר.

הדמיית מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר של Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus פנוטיפים הטרוגניים

פרוטוקול זה משתמש במדווח ביולומינסנט המאפשר מדידות של פעילות השעתוק ב-Saccharomyces eubayanus כדי לנטר את המעבר מגלוקוז למלטוז, מה שמאפשר ניתוח בזמן אמת של התאמות מטבוליות ותומך באופטימיזציה של זנים לתסיסה תעשייתית בתנאים מגוונים.

ב Vivo ניטור פעילות שעתוק במהלך מעבר מטבולי באמצעות מדווח ביולומינסנט בשמרים

למדו שיטת אלקטרופורציה לשינוי גנטי של האצה הימית Ostreococcus tauri. טכניקה זו מאפשרת יצירת שורות טרנסגניות יציבות למחקר ברשיות תאיות מורכבות.

שינוי גנטי של Picoeukaryote

גלה סרטונים נוספים