ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי לג'ימי לשעבר Electroporation

השיטה של ​​העברת גנים לעוברי עוף בשלבי דגירה מאוחר יותר (מעל גיל המבורגר המילטון הבמה (ה"ה) 22) מתואר. שיטה זו מתגברת על החסרונות של

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע העברת גנים לעוברי עוף מבוגרים in vivo כדי לחקור את תפקוד הגנים והוויסות בשלבי התפתחות מבוגרים יותר. זה מושג על ידי פיצוח ביצה תחילה בערך ביום הדגירה 2.5 והעברת העובר כולו למערכת צלחת פטרי. השלב השני הוא הזרקת הפלסמיד, המקודד את הגן המעניין לחלק המתאים של העובר.

לאחר הזרקת אלקטרודות הנחת הפלסמיד ליד העובר וביצוע אלקטרופורציה של X ovo, השלב האחרון הוא איסוף העוברים האלקטרופוטיים לניתוח. בסופו של דבר, אימונוהיסטוכימיה משמשת לאיתור ביטוי של גנים שהועברו בעובר. היום נראה לכם כיצד לבצע את האלקטרופורציה הסגלגלה X באמצעות BULs עוף.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ש-X על פני אלקטרופורציה יכול להתגבר על הבעיות של אלקטרופורציה יתר המשמשת להעברת גנים בעוברי עוף מבוגרים. תרבית X ovo מוצלחת של עוברי עוף דורשת שימוש בביצים מופרות טריות. אין להשתמש בביצים המאוחסנות בטמפרטורה של 12 מעלות צלזיוס יותר משבוע.

הטילו את הביצים על דפנותיהן הארוכות בחממת טיוטה מאולצת בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס עם לחות של 60% לאחר הדגירה למשך 2.5 ימים. כאשר העוברים הם בערך המבורגר והמילטון. שלב 17, הוציאו את הביצים מהחממה.

סמן את החלק העליון של כל ביצה בעיפרון כדי לציין את כיוון הפיצוח של כל ביצה. שופכים כ -20 מיליליטר מים מזוקקים סטריליים לצלחת פטרי נקייה וגדולה בקוטר 145 מילימטרים. מניחים צלחת פטרי סטרילית קטנה בקוטר 94 מילימטרים לתוך צלחת הפטרי הגדולה.

לאחר מכן, פצחו כל ביצה בתחתית כנגד קצה מתכת חד. פותחים בזהירות את הביצה ומעבירים את כל תכולתה לצלחת הפטרי הקטנה. כדי להבטיח את איכותו הטובה של העובר, יש לשמור את כל תכולת הביצית בצורה עגולה בדרך כלל במערכת צלחת פטרי ללא כל פגיעה בקרום הווילין.

לאחר העברת תכולת כל ביצה לכלי הקטן, מכסים את המנה הגדולה במכסה. הכניסו את מערכות צלחות הפטרי לאינקובטור אחר לתרבית נוספת בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס עם כ-60% לחות לפני אלקטרופורציה של X ovo. השתמש במיקרו אלקטרודה קוטבית כדי למשוך נימי זכוכית מצינורות זכוכית בקוטר 1.0 מילימטר.

שוברים את קצה נימי הזכוכית לקוטר מתאים. לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים המתאימים לאלקטרופורציה כגון מתחים שונים עבור הרקמה הייחודית וגודל העוברים. חבר את האלקטרודות המתאימות לאלקטרו בהתאם לרקמת המטרה וגודל העוברים.

הכן תמיסת פלסמיד המכילה פלסמידים, המקודדת גן יעד וגן סמן. בהדגמה זו, קדרין שבע או CAD שבע הוא המטרה וחלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP הוא הסמן. הוסף ירוק מהיר לריכוז סופי של 0.1% כדי לסמן את תמיסת הפלסמיד בירוק.

לבסוף, השתמש בפיפטה בפה כדי להעמיס את נימי הזכוכית בתמיסת הפלסמיד. עוברי עוף מתרבית X ovo שהודגרו במשך שישה ימים משמשים לאלקטרופורציה של X ovo. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במלקחיים עדינים כדי לקרוע בזהירות את ממברנות הטיילן ומי השפיר מעל הטקטום האופטי ולהוסיף שלוש טיפות של תמיסת נתרן כלורי סטרילית של 0.9% על פני הטקטום.

בעזרת פיפטה בפה, הזריקו את תמיסת הפלסמיד מנימי הזכוכית לחלל הטקטום. הנח את האלקטרודות עם קתודה של מחט טונגסטן ואנודה של צלחת מלבן ליד הטקטום. השתמש מיד באלקטרו כדי להפעיל פולסים חשמליים על הטקטום.

מכסים את צלחת הפטרי הגדולה במכסה ומחזירים אותה לחממה יומיים-שלושה לאחר אלקטרופורציה של פלסמידים המקודדים GFP ו-CAD שבע לטקטום עוף ב-E שש, הטקטום נאסף ומקובע לצביעה חיסונית. התוצאות מוצגות באיור זה ב-E שמונה. חלבון ה-GFP מתבטא חזק ב-tum כפי שמצוין על ידי תמונות ההר השלמות הללו כאן.

לוח A הוא תמונת שדה בהירה. פאנל B הוא תמונת GFP, ופאנל C מופיע. תמונה יתר על כן, בחלקים של הטקטום ב-E תשעה חלבון GFP המוצג בירוק בפאנל D ו-CAD שבעה חלבונים המומחשים באדום בפאנל E מתבטאים במשותף כפי שהם מיוצגים על ידי הצבע הצהוב בפאנל F. כאשר עושים זאת כהלכה, היעילות של אלקטרופורציה של X ovo היא 60 עד 100% תוצאות אלה מצביעות על כך שאלקטרופורציה של X ovo היא שיטה מוצלחת להעברת גנים לעוברי עוף מבוגרים יותר in vivo.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע העברת גנים לעוברי עוף מבוגרים ובהצלחה בניסוי שלך.