Name: ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:29:01.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: למדו אלקטרופורציה in ovo בעוברי עוף בשלב HH 10 לחקר ביטוי גנים ופיתוח מערכת העצבים המרכזית. שיטה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מהירה ויעילה בעוברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ביצה טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים יכול להיות שמר על 13 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני הדגירה ללא אובדן משמעותי של הכדאיות (א מקרר יין קטן הוא אידיאלי למטרה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדגירה, לאפשר ביצים לחמם לטמפרטורת החדר, ואז מקום תרנגולת humidified חממה מוגדר 37.8 ° C (100 ° F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל אנחנו עוברים electroporate כ 48 שעות מתחילת הדגירה, כאשר העובר הגיע לשלב המבורגר המילטון 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן הדגירה של עשויים להשתנות בהתאם המבורגר הרצוי בשלב המילטון. טמפרטורה היא ביקורתית חריגה בטמפרטורת הדגירה אופטימלי ישנו זמן דגירה העובר ואת הכדאיות ירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, ביצים יש לשמור על צדם כך העובר תהיה ממוצבת כהלכה electroporation. העובר יצוף על גבי החלמון ואת כדאי לסמן את החלק העליון של הביצה בעיפרון לפני חלונאית, כך שאתה יודע איפה לקצץ. </li></ol> הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם ליבוביץ L-15 מדיה 37 ° C. משוך זכוכית לתוך הנימים מחטים. מיקום אלקטרודות micromanipulator ולהתחבר אלקטרודות מחולל את הדופק. </li></ol> Windowing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מזרק עם מחט נשא גדול, לחדור את הקליפה בקצה הקטן של הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצבעה המחט כלפי מטה בזהירות, כדי למנוע שיבוש של החלמון, להסיר כ 5 מ&quot;ל של אלבומין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את החור עם חתיכה קטנה של נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את החלק העליון של הביצה עם חתיכה נוספת של סרט (כ 4x4 ס&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים מעוקל, והקפידו שלא לשבש את העובר, לחתוך חור גדול מספיק כדי לספק חלון שבו לעבוד. </li></ol> אופציונלי: כדי להמחיש את בצינור העצבי, להזריק פתרון דיו עם מחט מד 26 מתחת העובר (להכניס מחט תחת העובר מבחוץ הטבעת דם). דיו בהודו יש לדלל 1:05 עם פתרון הנקס או דומה שנאגרו סטרילית. הזרקת electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוברים את קצה נימי לקוטר הרצוי באמצעות פינצטה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה בפה, לטעון את נימי עם צבע ירוק פלסמיד / מהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר עם הראש כלפי לך להכניס את המחט לתוך הצינור העצבי בזווית רדוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון הפלסמיד לתוך לומן של הצינור העצבי עד לצבוע ממלא את החלל כולו. </li></ol> הערה: היזהר לא לקבל טיפ גדול ואז בצינור העצבי קוטר. באופן כללי, תוכל לדעת אם הגודל האופטימלי קצה הושגה על ידי כמה קל או קשה למשוך נוזל לתוך הנימים. אם יש התנגדות קיצוניים, פתיחת הוא כנראה קטן מדי קצה צריך להיות שבור שוב גבוה יותר. אם יש התנגדות קטנה או לא, פתיחת גדול מדי מחט חדשה יש להשתמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1-2 טיפות של L-15 מדיה סטרילי על העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד למקום אלקטרודות משני צידי העובר, במקביל הצינור העצבי, והדופק 5 פעמים ב 10-24 וולט עבור 50 mseconds ב 1 במרווחים השני. אתה תראה בועות ליד האלקטרודות אם זה עבד כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות אלקטרודות, לשים 5 טיפות של L-15 על גבי העוברים ואת החותם את הביצה עם הקלטת. ודא ביצה אטום היטב, כמו ייבוש הוא התורם העיקרי לאובדן העובר הבאים electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ביצים לתוך האינקובטור, בצד החלון למעלה, לדגור עד שהם מגיעים הרצוי H &amp; H הבמה. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד מדריך כדי electroporation בצינור העצבי של HH10 עוברי אפרוח. בנוסף מראה את הטכניקה, הנחיות לאחסון וטיפול ביצים הוא גם סיפק. טכניקה זו יש מגוון רחב של יישומים עבור ניתוח גנטי ואת עלות נמוכה וקלות של ניסויים גורם להם ריאלי עבור מעבדות רבות.

<table><tbody><tr><td>מדגרה לביצי תרנגולות</td><td></td><td></td><td>מולחח, מכוון ל-37.80&amp;#x00B0;C (100F). </td></tr><tr><td>מחולל פולסים </td><td>גנוטרוניקה</td><td>BTX T820</td><td>מחולל גלי ריבוע או מקבילו</td></tr><tr><td>אלקטרודות</td><td></td><td></td><td>האלקטרודות שלנו יוצרו מחוט פלטינה בקוטר 0.25 מ"מ, באורך של 5 מ"מ ובמרווח של 1 מ"מ זו מזו.</td></tr><tr><td>כבלי חיבור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה </td><td></td><td></td><td>עם מרחק עבודה גדול</td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית </td><td></td><td></td><td>ומכשיר למשיכת קפילרות (capillary puller) או מחטים מזכוכית מסחריות</td></tr><tr><td>לייבוביץ&amp;rsquo;מדיום L-15</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביצי תרנגולת</td><td></td><td></td><td>הורדדו</td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחט רחבת קוטר </td><td></td><td></td><td>16-18G</td></tr><tr><td>פיפטה רכיבה (Mouth pipette)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיו הודו </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין/מזרק </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA פלסמידי </td><td></td><td></td><td>&amp;#8805; 1&amp;#x03BC;ג'/&amp;#x03BC;ב-TE סטרילי או ב-PBS 1X המכיל 0.05% צבע Fast Green</td></tr></tbody></table>

ב electroporations אובו של hh 10 עוברים שלב עוף

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

גודל גדול והתפתחות חיצונית של העובר עוף הפכו זמן זה כלי חשוב בחקר הביולוגיה ההתפתחותית. עם כניסתו של שיטות ביולוגיות מולקולריות, האפרוח הפך שימושי מערכת שבה ללמוד ויסות הגנים ותפקוד. עד electroporating בונה DNA או RNA לתוך העובר המתפתח עוף, גנים יכול לבוא לידי ביטוי או הפילו על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo. כמו כן, בונה הכתב יכול לשמש למיפוי גורל או לבחון אלמנטים גנים המשוערת הרגולציה. לעומת ניסויים דומים העכבר, electroporation חומוס יש את היתרונות של להיות מהירה, קלה וזולה. וידאו זה מדגים הראשונה איך לעשות חלון קליפת כדי לתפעל את העובר. בשלב הבא, העובר הוא מדמיין בתמיסה מדוללת של דיו הודו מוזרק מתחת העובר. מחט זכוכית פיפטה משמשים להזריק דנ&quot;א צבען הירוק מהיר לתוך הצינור העצבי המתפתח, אז אלקטרודות פלטינה ממוקמים במקביל העובר ואת פולסים חשמליים קצרים מנוהלים עם גנרטור הדופק. לבסוף, הביצה היא חתומה עם סרט והניח בחזרה באינקובטור להמשך פיתוח. בנוסף, הוידאו מראה אחסון ביצה טיפול נאות ודן גורמים אפשריים electroporation אובדן העובר הבא.

צ&#39;יק ב electroporation אובו היא טכניקה המאפשרת מניפולציה גנטית של העובר העופות. יישומים נפוצים של טכניקה זו כוללות אנליזה פונקציונלית של גנים המשוערת אלמנטים משפר. וידאו זה מדגים electroporation neural tube אצל ה&quot;ה 10 עוברי אפרוח. טכניקת הזרקת וטיפול נאות ביצה הם דנו.

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

הגודל הרב וההתפתחות החיצונית של עובר התרנגולת הפכו אותו כבר מזמן לכלי בעל ערך בחקר הביולוגיה ההתפתחותית. עם הופעתם של...

האפרוח הוא מערכת מודל טובה כיוון שהעוברים ניתנים למניפולציה בקלות רבה, וגודלם הרב הופך את העבודה איתם לפשוטה בהרבה מאשר עם עוברים אחרים. ניסויי אלקטרופורציה באפרוחים מאפשרים בנוסף סריקה של מספר רב של גנים בפרק זמן קצר. שלום, אני מריסה בלאנק.אני סטודנטית לתארים מתקדמים במעבדה של Kathy Millon במחלקה לגנטיקה אנושית באוניברסיטת שיקגו. היום אדגים לכם כיצד לבצע אלקטרופורציה של עוברים בביצת אפרוח (in ovo electroporation), ונבצע אלקטרופורציה לעוברים של תרנגולות בשלב 10 של התפתחות המילר-המילטון (Hamilton stage 10), המקבילה לכשיומיים של התפתחות עוברית באפרוח. הפרוצדורה מבוצעת במעבדה שלנו באופן שגרתי, ובדרך כלל אנו בוחנים את ההשפעה של ביטוי יתר (overexpression) או השתקה (knock down) של גנים בחוט השדרה, מכיוון שאנו מתעניינים בגנים המעורבים בהתפתחות של מערכת העצבים המרכזית.הטכניקה שאדגים לכם היום, אלקטרופורציה in ovo, כוללת מספר שלבים. השלב הראשון הוא פתיחת חלון בביצה. השלב השני הוא הזרקה של DNA לתוך הלומן של צינור העצבים.והשלב השלישי יהיה שימוש בשדה חשמלי כדי לדחוף את ה-DNA לצד אחד של צינור העצבים. לאחר מכן אראה לכם כיצד לסגור את הביצים ונחזיר אותן לדגירה. אוקיי, לפני שנתחיל, ארצה לספר לכם מעט על טיפול נכון בביצים.הביצים יירכשו ממגדל תרנגולות והן יגיעו מופרות. מכיוון שביצים אלו מכילות עוברים,

in-ovo-electroporations-of-hh-stage-10-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים כיצד לדמיין מסלולי axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים בחוט השדרה ניצול חומוס...

פענוח מסלולים axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים התחתית צ&#39;יק עצבית ניצול ב אובו Electroporation

המטרה הכללית של סרט זה היא להראות כיצד לבצע הזרקת רשתית...

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה...

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

השיטה של ​​העברת גנים לעוברי עוף בשלבי דגירה מאוחר יותר (מעל גיל המבורגר המילטון הבמה (ה"ה) 22) מתואר. שיטה זו מתגברת על החסרונות...

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי<em&gt; לג&#39;ימי לשעבר</em&gt; Electroporation

שיטה שבאמצעותה ביטוי גנים בצינור העצבי יכול להיות downregulated באופן ספציפי לסוג תא, מעקב מתוארת. אנחנו מדגימים...

בelectroporation אובו של פלסמידים מירנה מבוססים ברכבת התחתית הפיתוח העצבי והערכת פנוטיפים ידי הזרקת DiI בהכנות-ספר פתוח

איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

איבר השמיעה מתווך את השמיעה. כאן אנו מציגים שיטת מיקרו-אלקטרופורציה שונה בביצית המותאמת לחקר התפשטות והתמיינות של תאי אב שמיעתיים באיבר השמיעה המתפתח.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

אנו מדווחים על שליח RNA (mrna) אלקטרופורציה כשיטה המאפשרת ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים במערכת דגם העובר שליו. שיטה זו ניתן להשתמש כדי לתייג תאים במהירות ולהקליט את התנועות שלהם vivo על ידי הזמן לשגות המיקרוסקופיה זמן קצר לאחר electroporation.

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

וידאו זה מדגים את הכנת תרבויות עצבי ראשוני midgastrula עוברים שלב תסיסנית. צפיות של תרבויות לחיות להראות תאים 1 שעה לאחר ציפוי הנוירונים הבדיל אחרי 2 ימים של גידול בינוני ביקרבונט מבוססי מוגדר. הנוירונים הם להתרגש חשמלית וליצור קשרים סינפטיים.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

למדו אלקטרופורציה in ovo בעוברי עוף בשלב HH 10 לחקר ביטוי גנים ופיתוח מערכת העצבים המרכזית. שיטה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מהירה ויעילה בעוברים.

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

גלה סרטונים נוספים