Name: פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך 15 תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת אפנון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: למד לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון אמיתיות באמצעות תיוג מטבולי 15N, immunoprecipitation וספקטרומטריית מסה כמותית ב-Chlamydomonas. שיטה זו מבדילה בין שותפי אינטראקציה אמיתיים לזיהומים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לאוליבייה Vallon antiserum נגד CF1β. עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק ומענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה (Schr 617/5-1) וBundesministerium für Bildung und Forschung (FORSYS הביולוגיה המערכתית יוזמה, GoFORSYS פרויקט).

<ol><li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+a+macromolecular+complex%3A+the+toolkit+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li>
<li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction%3A+mass+spectrometry-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li>
<li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitations+revisited%3A+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li>
<li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+%28QUICK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+%28SILAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li>
<li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li>
<li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones%3A+cellular+functions+and+molecular+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li>
<li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas%3A+two+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li>
<li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li>
<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+EH+%22The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%22">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use</a>. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).</li>
<li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSQuant%2C+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li>
<li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li>
<li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

יש לנו הצגנו לאחרונה שני שיפורים לגישה המהירה: צעד crosslinking ללכידת אינטראקציות בין חלבונים חולפות (QUICK-X), ומשקעי שליטה לנרמל ליעילות משקעים שווה 6. כאן אנו מציגים פרוטוקול המכיל עוד שני שיפורים של מהיר: ראשון, אנחנו להחליף SILAC 5 עבור 15 N תיוג מטבולית. היתרונות הם כי 15 N תיוג מטבולית הם הרבה יותר זול מאשר SILAC, אם 15 N מסופק כמלח אורגני פשוט. יתר על כן, עם 15 N מטבולית תיוג מהיר יכול להיות מיושם על prototrophic אורגניזמים לכל החומצות האמינו, כמו רוב הצמחים, פטריות וחיידקים. ולבסוף, interconversion הטבוע SILAC 5,6 ארגינין לפרולין אינו מהווה בעיה לכימות של 15 N מתויג פפטידים. דוגמאות לכלים מתאימים להערכה כמותית של 15 נתוני N proteomics הן 12 MSQUANT אוOMIQS 13. שנית, אנחנו מציגים את זיקת אפנון כאמצעי להפחתת כמות החלבונים באינטראקציה עם חלבון המטרה הניתן בדגימה אחת לעומת אחרת במפורש. היתרונות של גישה זו הם שהוא עוקף את הבנייה של מוטציות, שמציאה עבור כמה מערכות מודל קשה לייצר או לא יכול להיות שנוצרו בכל במקרה של חלבוני היעד חיוניים. יתר על כן, הוא נמנע מפרשנויות מוטעות הנגרמות על ידי ביטוי חלבון הפרש פוטנציאלי המתרחש כתגובה של התא לדפיקות למטה חלבון מטרה: אם חלבונים אחרים הם מוסדר כלפי מטה, כמו גם ולחצות-מגיבים עם antiserum משמש לimmunoprecipitation, הם יתפרשו כשותפים אמיתיים של אינטראקציה של חלבון המטרה. לבסוף, זיקת אפנון מבטל את הצורך של מציאת יחס נכון נוגדן לאנטיגן. למרות שאנחנו מיישמים הפרוטוקול שלנו לreinhardtii Chlamydomonas כאורגניזם מודל, זה יכול בקלות להיות מותאם לכל אורגניזם אחר שניתן לגדל בתרבית תאים, והוא מסוגל להשתמש באמוניום חנק או כמקור חנקן. אפנון זיקה של קומפלקסי חלבונים על ידי ATP / ADP ישירות עשוי להיות מיושם למלווים אחרים שאינטראקציה עם מצעים וחלבוני עוקבה תלויה במצב ATP, כמו GroEL/HSP60/Cpn60 או Hsp90 מערכות מלווה 14,15, או לכל מערכת אחרת שבי זיקות מחייבות הם מווסתים על ידי ATP. זיקת אפנון צריך גם לעבוד למקרים בם זיקות בין אינטראקציות חלבון שונו על ידי תרופות מסוימות, כגון radicicol או geldanamycin במקרה של Hsp90 מערכות 15. מגבלה ברורה של הפרוטוקול שלנו היא שזה דורש זיקה-מטוהרי נוגדנים נגד חלבון המטרה הידועה להיות רגיש לטיפול / תרופה שמודולציה זיקתו לחלבוני שותפים ספציפיים. לכן, אין זה שיטת תפוקה גבוהה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (דימתיל pimelimidate) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D8388 </td><td> אחסן מיובש ב -20 ° C, לפזר ישירות לפני השימוש </td></tr><tr><td> פרוטאז מעכב (מלא, ללא EDTA) </td><td> רוש יישומי מדע </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> קרל רוט </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> קריאטין פוספאט </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> phosphokinase קריאטין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [succinimidyl propionate] </td><td> Thermo Sientific </td><td> 22585 </td><td> אחסן מיובש ב 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> קיימברידג&#39; איזוטופ מעבדות, אנדובר, מסצ&#39;וסטס </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteinase Lys-C) </td><td> רוש יישומי מדע </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי טריפסין (Poroszyme ללא יכולת לזוז, טריפסין) </td><td> אפלייד Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> מערבב נמרצות ישירות לפני השימוש </td></tr><tr><td> דיסק Empore 18 C 47 מ&quot;מ </td><td> ריאן </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג n מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

אינטראקציות בין חלבונים הן בסיסיות לתהליכים ביולוגיים רבים בתא. לכן, האפיון שלהם ממלא תפקיד חשוב במחקר נוכחי ושפע של שיטות לחקירה שלהם זמינה 1. אינטראקציות בין חלבונים לעתים קרובות הן מאוד דינמיות ויכולות להיות תלויות בלוקליזציה subcellular, שינויים שלאחר translational וסביבת החלבון המקומית 2. לכן, הם צריכים להיחקר בסביבה הטבעית שלהם, שלגישות שיתוף immunoprecipitation הן שיטת הבחירה 3. שותפי אינטראקצית שיתוף זרזו מזוהים או על ידי immunoblotting בגישה ממוקדת, או על ידי ספקטרומטריית מסה (LC-MS/MS) באופן לא ממוקד. האסטרטגיה האחרונה לעתים קרובות מושפעת לרעה על ידי מספר גדול של תגליות חיוביות כוזבות, נבע בעיקר מהרגישות הגבוהה של ספקטרומטרים המונים מודרניים שבביטחון לזהות עקבות של חלבונים מזרזים unspecifically. Recenגישה לא להתגבר על בעיה זו מבוססת על הרעיון שסכומים מופחתים של שותפי אינטראקציה ספציפיים יהיו שותף במשקע עם חלבון המטרה נתונה שריכוז סלולרי הוא מופחת על ידי RNAi, ואילו הסכומים של חלבונים מזרזים unspecifically צריכים להיות מושפעים. גישה זו, המכונית מהירה לimmunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה 4, מעסיקה תיוג יציב האיזוטופי של חומצות אמינו בתרבית תאים (SILAC) 5 ו-MS לכמת את הכמויות של חלבוני immunoprecipitated מזנים פראיי סוג ועקום למטה. חלבונים הנמצאים בליחס של 1:1 יכולים להיחשב כמזהמים, אלה מועשרים במשקעים מהסוג הפראי כשותפי אינטראקציה ספציפיות של חלבון המטרה. אמנם חדשני, מהיר נושא מספר מגבלות: ראשית, SILAC הוא העלות אינטנסיבית ומוגבל לאורגניזמים שהם אידיאליים לauxotrophic ארגינין ו / או ליזין. תוצאות interconversion יתר על כן, כאשר ארגינין כבד נזון, ארגינין ל-פרולין בadditמסת ional המשמרות עבור כל פרולין בפפטיד ומעט מדללת כבד עם ארגינין אור, מה שהופך את הכימות יותר משעמם ופחות מדויק 5,6. שנית, מהיר דורש כי נוגדני טיטרציה כך שהם אינם הופכים רוויים בחלבון המטרה בתמציות מעקומות למטה מוטציות. כאן אנו מציגים פרוטוקול מהיר שונה המתגבר על המגבלות האמורות לעיל מהיר על ידי החלפת SILAC תיוג 15 N חילוף חומרים ועל ידי החלפת RNAi בתיווך עקום למטה לאפנון זיקה של אינטראקציות בין חלבונים. אנחנו מדגימים את הישימות של פרוטוקול זה באמצעות Chlamydomonas האצה הירוק unicellular reinhardtii כאורגניזם מודל ומלווה HSP70B הכלורופלסט כחלבון המטרה 7 (איור 1). HSP70s ידוע לאינטראקציה עם עמיתים למלווי מצעים רק במדינת ADP 8 ספציפיים. אנו מנצלים נכס זה כאמצעי לאימות ספציפיתאינטראקציה של HSP70B עם גורם חילופי נוקלאוטיד 9 CGE1.

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת על<sup&gt; 15N</sup&gt; תיוג מטבולית, האפנון של זיקות של אינטראקציות בין חלבונים על ידי הנוכחות / היעדרות של ה-ATP, immunoprecipitation, וספקטרומטריית מסה כמותית.

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

אינטראקציות בין חלבונים הן חיוניות לתהליכים ביולוגיים רבים בתא. לפיכך, לאפיון שלהן תפקיד חשוב ב...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה ספציפית עם חלבון מטרה נתון בתמריתי תאים המכילים חלבונים מסיסים וחלבוני ממברנה. ראשית, יש לבצע סימון מטבולי מלא של תאי chlamydomonas באמצעות חנקן 14 וחנקן 15 ולהכין ליזאטים של תאים המכילים או חסרים TP. שלב אופציונלי של קשירה צולבת (cross-linking) מסייע בייצוב אינטראקציות חולפות בין חלבונים. לאחר מכן, הפרד את ליזאטי התאים לפרקציות, המועשרות בחלבונים בלתי מסיסים ובחלבוני ממברנה, מהם יבודדו חלבון המטרה ושותפיו הספציפיים לאינטראקציה.חלבון בקרה וחלבונים מזיהמים עוברים שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) ואלוציה. כעת, ערבבו את החלבונים ששוקעו חיסונית, בצעו עיכול משולש והנתחו אותם באמצעות LCMS טנדמי. התוצאות הבחינו בין שותפי אינטראקציה אמיתיים למדוייים על ידי הצגת יחסי פפטידים שונים של חנקן 14 וחנקן 15 עבור חלבונים המקימים אינטראקציה ספציפית עם חלבון המטרה, לעומת יחסי חנקן שווים.יחסי חנקן 14 לחנקן 15 של הפפטידים עבור חלבון המטרה, חלבון הבקרה וחלבונים מזוהמים. שיטת הבחירה לניתוח אינטראקציות בין חלבונים היא ביצוע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של החלבון הנבחר ישירות עם שותפי האינטראקציה שלו מתוך תמריתי תאים, שבהם שניהם נמצאים במבנה ובריכוזים הטבעיים שלהם.עם זאת, בעת ביצוע פעולה זו, משקיעים גם חלבונים מזוהמים, בעיקר בשל האינטראקציה שלהם עם הנוגדנים שנעשה בהם שימוש, שכן ספקטרומטרים של מסות מודרניים הם רגישים ביותר. הם יזהו באופן חד-משמעי גם את החלבונים המזוהמים, ולכן לא ניתן להבחין בין טעות לבין שותפים לאינטראקציה אמיתית. בעיה זו נפתרת באמצעות הטכניקה המוצגת כאן, המבוססת על immunoprecipitation affinity modulation באמצעות סימון מטבולי של 15 N, המתווך כאן על ידי מצב ATP, וספקטרומטריית מסות כמותית.הטכניקה תוצג על ידי Stefan SCH Malinger, דוקטורנט בכיר במעבדתי. לאחר סימון התאים למשך 10 דורות, העבירו שתי מנות (aliquots) של תאי chlamydomonas מסומנים בחנקן 14 ובחנקן 15 לתוך מבחנות 4G SA, קצרו באמצעות צנטריפוגציה, השעו את המשקעים בשני מיליליטר של חוצץ ליזיס (lysis buffer) קר בקרח, והעבירו את התרחיפים למבחנות פלקון (Falcon) בנפח 15 מיליליטר; אספו את התאים הנותרים בעזרת מיליליטר נוסף של חוצץ ליזיס לכל מנה. הוסיפו 50 מיקרוליטר של מעכב פרוטאז (protease inhibitor) בריכוז 25x ו-12.5 מיקרוליטר של מגנזיום כלוריד בריכוז 1 מולארי; בצעו סוניקציה לדגימות ארבע פעמים למשך 20 שניות על קרח כדי להשיג ליזיס מלא של התאים, עם הפסקות של 20 שניות בין הפעולות לצורך קירור.הכינו ארבע כריות סוכרוז של 6 mL בתוך מבחנות דופן דקה מסוג SW 41 TI. העבירו בזהירות את כל נפח הליזטים של התאים על גבי כריות הסוכרוז. איזנו עם באפר ליזיס וסובבו בצנטריפוגה כדי להפריד קומפלקסים של חלבונים מסיסים מהממברנות.העבירו את קומפלקסי החלבונים המסיחים מחלקו העליון של הגרדיאנט לארבעה מבחנות פלקון בנפח 15 מיליליטר. יש לוודא שחלקים מכרית הסוכרוז אינם מועברים. לאחר מכן, הוסיפו לכל דגימה 10% Triton X 100 עד לריכוז סופי של 0.5%. ערבבו בזהירות והוסיפו באפר ליזיס עד לנפח כולל של שבעה מיליליטרים.עבור ניתוחי SDS page ואימונו-בדיקות של דם. העבירו 70 µL מכל תמצית תאים מסיסה למבחנה קונית נקייה בנפח 1.5 mL והוסיפו 70 µL של בופר דגימה 2X SDS. לאחר מכן, השליכו את כריות הסוכרוז ממבחנות ה-SW 41 TI בעלות הדופן הדקה והוסיפו שלושה מיליליטרים של בופר ליזיס לכל משקע.הוסיפו מיליליטר אחד של 10% tritton X 100 לריכוז סופי של 2%. לאחר המסה של כל משקע באמצעות סוניקציה, הוסיפו בופר ליזיס לנפח כולל של חמישה מיליליטרים וסובבו בצנטריפוגה. כפי שנעשה קודם לכן, אספו את השכבות העליונות של קומפלקסי חלבוני ממברנה לשפופרות פלקון בנפח 15 מיליליטר. הוסיפו בופר ליזיס המכיל 2% tritton X 100 לנפח סופי של שבעה מיליליטרים.השתמשו ב-70 µL מדגימות אלו עבור SDS page ואנליזות אימונו-דם. ראשית, בצעו שיווי משקל לחלבון המשויך לנוגדן. שטפו את ה-sero beads פעמיים ב-4 mL של באפר ליזיס, דללו ל-8 mL וחלקו לאליקוויטות.העבירו מיליליטר אחד של התוךלסמי לכל אחד משמונת מבחני הפלקון בנפח 15 מיליליטר המכילים קומפלקסים של חלבון ממיס או חלבוני ממברנה מתאי TP replete ו-TP depleted המסומנים ב-nitrogen 14 וב-nitrogen 15; הדגירו למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C על גלגל סיבוב למבחנות כדי להשקיע את קומפלקסי החלבון. השקיעו את החרוזיים באמצעות צנטריפוגה והשליכו את העל-משקעים, תוך השארת נפח קטן של נוזל מעל החרוזיים כדי למנוע זיהום מחלבונים הנצמדים לדפנות הפלסטיק. העבירו את הדגימות למבחנות קוניות חדשות בנפח 1.5 מיליליטר כדי לאסוף את כל החרוזיים שנותרו במבחנות הפלקון. הוסיפו 0.8 מיליליטר נוספים של באפר ליזיס המכיל 0.1% tritton לכל מבחנה, ערבבו בוורטקס, צנטריגו בעדינות, והעבירו את הבאפר עם שאריות החרוזיים למבחנות ה-einor. לאחר מספר שלבי שטיפה, צנטריגו את הדגימות למשך 15 שניות ב-16,100 ×g ובטמפרטורה של 4 °C.ראשית, הסיר את העל-מיתמיים של הדגימות באמצעות פיפטה רגילה. לאחר מכן, הסר לחלוטין כל שארית של על-מיתמיים בעזרת מזרק המילטון של 50 microliter. לכל דגימה, הוסף 100 microliters של תמיסת אלוציה שהוכנה טרי, והדגר במיקסר תרמי במהירות של 800 RPM; סבב את הדגימות בצנטריפוגה למשך 15 שניות ב-16,100 times G ובטמפרטורה של 25 degrees Celsius.כעת העבירו כל עליית נוזל למבחנה חדשה באמצעות מזרק Hamilton נקי של 50 µL. הוסיפו גם 50 µL של תמיסת אלואציה (elution buffer) לחרוזים, כפי שבוצע עם הדגימות הקודמות, ואחדו את התמציות (elutes) המתאימות. זכרו לשמור 30 µL מכל ה-EITs של הדגימות עבור SDS page ואנליזות אימונו-דם.כעת שלבו את המשקעים ששוררו מהחלבונים הממיסים ומחלבון הממברנה המסומנים בחנקן 14 וחנקן 15, שעובדו עם ונגד ATP. לאחר מכן, בצעו רדוקציה, אלקילציה ועיכול ראשוני בריכוז Urea גבוה כפי שמתואר בכתב היד הנלווה. המשיכו לעיכול טריפטין על גלגל סיבוב למשך 16 שעות לפחות.בטמפרטורה של 37 °C. השקיעו את חרוזי ה-trypsin על ידי סנטריפוגציה למשך חמש דקות ב-16,100 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. העבירו את העלייה (supernatants) למבחנות Eppendorf נקיות בנפח של 2 mL.שטפו את המבחנות הישנות עם 50 µL של ammonium bicarbonate בריכוז 20 mM, 0.5% acetic acid ואגדו אותן עם העל-נוזלים הראשונים. כדי להכין טיפים מסוג C 18 ביתיים להסבת המלחים מהדגימות, גזרו שתי דיסקיות מחומר emcor C 18 באמצעות מחט של מזרק והכניסו אותן לתוך טיפ של פיפט ל-200 µL. לאחר מכן, נקבו חורים במכסים של ארבע מבחנות einor בנפח 2 mL והכניסו לתוכן את הטיפים. הכינו את טיפי ה-C 18 בעזרת 50 µL של תמיסה B וסבבו בצנטריפוגה למשך שלוש דקות במהירות 800 G ובטמפרטורה של 25 °C.לאחר מכן, יש להשוות את טיפים של שלב ה-C 18 עם 100 microliters של תמיסה, ולסבב בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-800 G ובטמפרטורה של 25 degrees Celsius. חזור על שלב ההשוואה זה פעם אחת נוספת. המשך להעמיס 100 microliters של תעלול הדגימות (supernatants) מהעיכולים המשולשים (triptych digestions) על טיפים של שלב ה-C 18 וסבב בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-800 G ובטמפרטורה של 25 degrees Celsius.חזור על טעינת העמודה עד להעברה מלאה של עליון הדגימות. לאחר שטיפת קצות ה-C 18, בצע אלוציה של הפפטידים הטריפטיים למבחנת einor נקייה של 1.5 milliliter באמצעות 50 µL של תמיסה B; סבב בצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב-800 G ובטמפרטורה של 25 °C. חזור על שלב האלוציה פעם אחת, ולאחר מכן ייבש את הפפטידים לחלוטין במכשיר speed VAC.השעו את הפפטידים המיובשים ב-20 µL של תמיסה A והדגרימו למשך שעה אחת לפחות על קרח, עם שתי הפסקות של 15 דקות של דגרימציה באמבט סוניקציה בצנטריפוגה למשך 20 דקות ב-16,100 ×g ובטמפרטורה של 4 °C, והחילו את Senna ל-nano C-M-S-M-S HSP 70. ידוע כי חלבוני הלם חום (Heat shock proteins) מגיבים עם קו-שפרונים (cos chaperones) וסובסטראטים ספציפיים רק בהיעדרו של ATP; בתמריתי תאים אלה המסומנים בחנקן 14, hs P 70 B ו-CGE one ממוקמים כמעט באופן בלעדי בחלק המומס, ללא קשר למצב ה-ATP. בניגוד לכך, CF one beta ממוקם הן בחלק המומס והן בחלקים העשירים בממברנה.מכיוון שסוניקציה גוזזת חלק מ-CF one beta מהממברנה הממוקמת ב-A TP Synthes, היא משמשת כבקרת העמסה עבור שני השברים. כמויות דומות של H HSP 70 B שקעו בעזרת הנוגדנים ל-HSP 70 B מתמריות מסיסות המסומנות בחנקן 14 ובחנקן 15, ללא תלות במצב ה-A TP. לעומת זאת, רמות נמוכות של חלבון HS P 70 B שקעו משברי ממברנה, כאשר כמויות מעט גדולות יותר מקורן משברי ממברנה דלים ב-a TP בהשוואה לשברים עשירים ב-a TP, כפי שניתן היה לצפות מהזיקה של CGE E one ל-hs.P 70 B תלוי בהקשר. לא שכב CGE one יחד עם HS P 70 B בתנאי TP replete במקטעים מסיסים או במקטעי ממברנה. הכמויות של חלבון CGE one ששכב יחד עם HS P 70 B ממקטעים מסיסים בתנאי TP depleted וממקטעי ממברנה בתנאי TP depleted נמצאות במתאם כמותי עם כמות HSP 70 B ששכב. האינטראקציה של CGE one עם HS P 70 B רק במצב A DP נצפתה גם בניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסות.בניסוי זה, הוכנו משקעים עבור תערובות של תמציות המסומנות בחנקן 14 שאינן כוללות TP, ותמציות המסומנות בחנקן 15 הכוללות A TP. בעוד שהצורות המסומנות ככבדות וכקלות של הפפטיד HS P 70 B זוהו בעוצמות שוות, זוהתה רק הצורה המסומנת כקלה של הפפטיד CGE one מהתמציות המדוללות ב-A TP. כאן מוצגים אותם פפטידים מהמשקע anti HS P 70 D DB שהופק מתערובות של תמציות תאים ממיסות המסומנות באופן הדדי. בהתאם לכך, זוהתה רק הצורה המסומנת ככבדה של הפפטיד CGE one בתמציות המדוללות ב-TP, כמו גם שני הפפטידים HSP 70 B, המסומנים כקלים וככבדים.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיווצר אצלכם תמונה ברורה של אופן ביצוע ניסוי שיקוע חלבונים הכולל הכנת דגימות לניתוח בספקטרומטריית מסות. זכרו כי זיהומים בחלבונים אנושיים, ובמיוחד קראטין, יעכילו את מדידות הפרוטיאומיקה בספקטרומטר המסות, ולכן נקיטת אמצעי בטיחות כגון שימוש בכפפות, סביבת עבודה נקייה ושימוש ברכיבים ברמה של LCMS היא קריטית בעת ביצוע הליך זה.

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור פיצול-BioID, שיטת שברי-קומפלמנטציה מבוסס על טכניקת קרבה-תיוג BioID. מופעל על האינטראקציה של שני חלבונים נתונה, היא מאפשרת ניתוח פרוטאומיקס של חלבונים תלויי-ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית. השיטה היא פשוטה, חסכונית ודורש רק ציוד מעבדה סטנדרטיים.

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

למד לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון אמיתיות באמצעות תיוג מטבולי 15N, immunoprecipitation וספקטרומטריית מסה כמותית ב-Chlamydomonas. שיטה זו מבדילה בין שותפי אינטראקציה אמיתיים לזיהומים.

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך 15 תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון (וידאו) | JoVE Journal

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך

גלה סרטונים נוספים