פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה ספציפית עם חלבון מטרה נתון בתמריתי תאים המכילים חלבונים מסיסים וחלבוני ממברנה. ראשית, יש לבצע סימון מטבולי מלא של תאי chlamydomonas באמצעות חנקן 14 וחנקן 15 ולהכין ליזאטים של תאים המכילים או חסרים TP. שלב אופציונלי של קשירה צולבת (cross-linking) מסייע בייצוב אינטראקציות חולפות בין חלבונים. לאחר מכן, הפרד את ליזאטי התאים לפרקציות, המועשרות בחלבונים בלתי מסיסים ובחלבוני ממברנה, מהם יבודדו חלבון המטרה ושותפיו הספציפיים לאינטראקציה.

חלבון בקרה וחלבונים מזיהמים עוברים שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) ואלוציה. כעת, ערבבו את החלבונים ששוקעו חיסונית, בצעו עיכול משולש והנתחו אותם באמצעות LCMS טנדמי. התוצאות הבחינו בין שותפי אינטראקציה אמיתיים למדוייים על ידי הצגת יחסי פפטידים שונים של חנקן 14 וחנקן 15 עבור חלבונים המקימים אינטראקציה ספציפית עם חלבון המטרה, לעומת יחסי חנקן שווים.

יחסי חנקן 14 לחנקן 15 של הפפטידים עבור חלבון המטרה, חלבון הבקרה וחלבונים מזוהמים. שיטת הבחירה לניתוח אינטראקציות בין חלבונים היא ביצוע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של החלבון הנבחר ישירות עם שותפי האינטראקציה שלו מתוך תמריתי תאים, שבהם שניהם נמצאים במבנה ובריכוזים הטבעיים שלהם.

עם זאת, בעת ביצוע פעולה זו, משקיעים גם חלבונים מזוהמים, בעיקר בשל האינטראקציה שלהם עם הנוגדנים שנעשה בהם שימוש, שכן ספקטרומטרים של מסות מודרניים הם רגישים ביותר. הם יזהו באופן חד-משמעי גם את החלבונים המזוהמים, ולכן לא ניתן להבחין בין טעות לבין שותפים לאינטראקציה אמיתית. בעיה זו נפתרת באמצעות הטכניקה המוצגת כאן, המבוססת על immunoprecipitation affinity modulation באמצעות סימון מטבולי של 15 N, המתווך כאן על ידי מצב ATP, וספקטרומטריית מסות כמותית.

הטכניקה תוצג על ידי Stefan SCH Malinger, דוקטורנט בכיר במעבדתי. לאחר סימון התאים למשך 10 דורות, העבירו שתי מנות (aliquots) של תאי chlamydomonas מסומנים בחנקן 14 ובחנקן 15 לתוך מבחנות 4G SA, קצרו באמצעות צנטריפוגציה, השעו את המשקעים בשני מיליליטר של חוצץ ליזיס (lysis buffer) קר בקרח, והעבירו את התרחיפים למבחנות פלקון (Falcon) בנפח 15 מיליליטר; אספו את התאים הנותרים בעזרת מיליליטר נוסף של חוצץ ליזיס לכל מנה. הוסיפו 50 מיקרוליטר של מעכב פרוטאז (protease inhibitor) בריכוז 25x ו-12.5 מיקרוליטר של מגנזיום כלוריד בריכוז 1 מולארי; בצעו סוניקציה לדגימות ארבע פעמים למשך 20 שניות על קרח כדי להשיג ליזיס מלא של התאים, עם הפסקות של 20 שניות בין הפעולות לצורך קירור.

הכינו ארבע כריות סוכרוז של 6 mL בתוך מבחנות דופן דקה מסוג SW 41 TI. העבירו בזהירות את כל נפח הליזטים של התאים על גבי כריות הסוכרוז. איזנו עם באפר ליזיס וסובבו בצנטריפוגה כדי להפריד קומפלקסים של חלבונים מסיסים מהממברנות.

העבירו את קומפלקסי החלבונים המסיחים מחלקו העליון של הגרדיאנט לארבעה מבחנות פלקון בנפח 15 מיליליטר. יש לוודא שחלקים מכרית הסוכרוז אינם מועברים. לאחר מכן, הוסיפו לכל דגימה 10% Triton X 100 עד לריכוז סופי של 0.5%. ערבבו בזהירות והוסיפו באפר ליזיס עד לנפח כולל של שבעה מיליליטרים.

עבור ניתוחי SDS page ואימונו-בדיקות של דם. העבירו 70 µL מכל תמצית תאים מסיסה למבחנה קונית נקייה בנפח 1.5 mL והוסיפו 70 µL של בופר דגימה 2X SDS. לאחר מכן, השליכו את כריות הסוכרוז ממבחנות ה-SW 41 TI בעלות הדופן הדקה והוסיפו שלושה מיליליטרים של בופר ליזיס לכל משקע.

הוסיפו מיליליטר אחד של 10% tritton X 100 לריכוז סופי של 2%. לאחר המסה של כל משקע באמצעות סוניקציה, הוסיפו בופר ליזיס לנפח כולל של חמישה מיליליטרים וסובבו בצנטריפוגה. כפי שנעשה קודם לכן, אספו את השכבות העליונות של קומפלקסי חלבוני ממברנה לשפופרות פלקון בנפח 15 מיליליטר. הוסיפו בופר ליזיס המכיל 2% tritton X 100 לנפח סופי של שבעה מיליליטרים.

השתמשו ב-70 µL מדגימות אלו עבור SDS page ואנליזות אימונו-דם. ראשית, בצעו שיווי משקל לחלבון המשויך לנוגדן. שטפו את ה-sero beads פעמיים ב-4 mL של באפר ליזיס, דללו ל-8 mL וחלקו לאליקוויטות.

העבירו מיליליטר אחד של התוךלסמי לכל אחד משמונת מבחני הפלקון בנפח 15 מיליליטר המכילים קומפלקסים של חלבון ממיס או חלבוני ממברנה מתאי TP replete ו-TP depleted המסומנים ב-nitrogen 14 וב-nitrogen 15; הדגירו למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C על גלגל סיבוב למבחנות כדי להשקיע את קומפלקסי החלבון. השקיעו את החרוזיים באמצעות צנטריפוגה והשליכו את העל-משקעים, תוך השארת נפח קטן של נוזל מעל החרוזיים כדי למנוע זיהום מחלבונים הנצמדים לדפנות הפלסטיק. העבירו את הדגימות למבחנות קוניות חדשות בנפח 1.5 מיליליטר כדי לאסוף את כל החרוזיים שנותרו במבחנות הפלקון. הוסיפו 0.8 מיליליטר נוספים של באפר ליזיס המכיל 0.1% tritton לכל מבחנה, ערבבו בוורטקס, צנטריגו בעדינות, והעבירו את הבאפר עם שאריות החרוזיים למבחנות ה-einor. לאחר מספר שלבי שטיפה, צנטריגו את הדגימות למשך 15 שניות ב-16,100 ×g ובטמפרטורה של 4 °C.

ראשית, הסיר את העל-מיתמיים של הדגימות באמצעות פיפטה רגילה. לאחר מכן, הסר לחלוטין כל שארית של על-מיתמיים בעזרת מזרק המילטון של 50 microliter. לכל דגימה, הוסף 100 microliters של תמיסת אלוציה שהוכנה טרי, והדגר במיקסר תרמי במהירות של 800 RPM; סבב את הדגימות בצנטריפוגה למשך 15 שניות ב-16,100 times G ובטמפרטורה של 25 degrees Celsius.

כעת העבירו כל עליית נוזל למבחנה חדשה באמצעות מזרק Hamilton נקי של 50 µL. הוסיפו גם 50 µL של תמיסת אלואציה (elution buffer) לחרוזים, כפי שבוצע עם הדגימות הקודמות, ואחדו את התמציות (elutes) המתאימות. זכרו לשמור 30 µL מכל ה-EITs של הדגימות עבור SDS page ואנליזות אימונו-דם.

כעת שלבו את המשקעים ששוררו מהחלבונים הממיסים ומחלבון הממברנה המסומנים בחנקן 14 וחנקן 15, שעובדו עם ונגד ATP. לאחר מכן, בצעו רדוקציה, אלקילציה ועיכול ראשוני בריכוז Urea גבוה כפי שמתואר בכתב היד הנלווה. המשיכו לעיכול טריפטין על גלגל סיבוב למשך 16 שעות לפחות.

בטמפרטורה של 37 °C. השקיעו את חרוזי ה-trypsin על ידי סנטריפוגציה למשך חמש דקות ב-16,100 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. העבירו את העלייה (supernatants) למבחנות Eppendorf נקיות בנפח של 2 mL.

שטפו את המבחנות הישנות עם 50 µL של ammonium bicarbonate בריכוז 20 mM, 0.5% acetic acid ואגדו אותן עם העל-נוזלים הראשונים. כדי להכין טיפים מסוג C 18 ביתיים להסבת המלחים מהדגימות, גזרו שתי דיסקיות מחומר emcor C 18 באמצעות מחט של מזרק והכניסו אותן לתוך טיפ של פיפט ל-200 µL. לאחר מכן, נקבו חורים במכסים של ארבע מבחנות einor בנפח 2 mL והכניסו לתוכן את הטיפים. הכינו את טיפי ה-C 18 בעזרת 50 µL של תמיסה B וסבבו בצנטריפוגה למשך שלוש דקות במהירות 800 G ובטמפרטורה של 25 °C.

לאחר מכן, יש להשוות את טיפים של שלב ה-C 18 עם 100 microliters של תמיסה, ולסבב בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-800 G ובטמפרטורה של 25 degrees Celsius. חזור על שלב ההשוואה זה פעם אחת נוספת. המשך להעמיס 100 microliters של תעלול הדגימות (supernatants) מהעיכולים המשולשים (triptych digestions) על טיפים של שלב ה-C 18 וסבב בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-800 G ובטמפרטורה של 25 degrees Celsius.

חזור על טעינת העמודה עד להעברה מלאה של עליון הדגימות. לאחר שטיפת קצות ה-C 18, בצע אלוציה של הפפטידים הטריפטיים למבחנת einor נקייה של 1.5 milliliter באמצעות 50 µL של תמיסה B; סבב בצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב-800 G ובטמפרטורה של 25 °C. חזור על שלב האלוציה פעם אחת, ולאחר מכן ייבש את הפפטידים לחלוטין במכשיר speed VAC.

השעו את הפפטידים המיובשים ב-20 µL של תמיסה A והדגרימו למשך שעה אחת לפחות על קרח, עם שתי הפסקות של 15 דקות של דגרימציה באמבט סוניקציה בצנטריפוגה למשך 20 דקות ב-16,100 ×g ובטמפרטורה של 4 °C, והחילו את Senna ל-nano C-M-S-M-S HSP 70. ידוע כי חלבוני הלם חום (Heat shock proteins) מגיבים עם קו-שפרונים (cos chaperones) וסובסטראטים ספציפיים רק בהיעדרו של ATP; בתמריתי תאים אלה המסומנים בחנקן 14, hs P 70 B ו-CGE one ממוקמים כמעט באופן בלעדי בחלק המומס, ללא קשר למצב ה-ATP. בניגוד לכך, CF one beta ממוקם הן בחלק המומס והן בחלקים העשירים בממברנה.

מכיוון שסוניקציה גוזזת חלק מ-CF one beta מהממברנה הממוקמת ב-A TP Synthes, היא משמשת כבקרת העמסה עבור שני השברים. כמויות דומות של H HSP 70 B שקעו בעזרת הנוגדנים ל-HSP 70 B מתמריות מסיסות המסומנות בחנקן 14 ובחנקן 15, ללא תלות במצב ה-A TP. לעומת זאת, רמות נמוכות של חלבון HS P 70 B שקעו משברי ממברנה, כאשר כמויות מעט גדולות יותר מקורן משברי ממברנה דלים ב-a TP בהשוואה לשברים עשירים ב-a TP, כפי שניתן היה לצפות מהזיקה של CGE E one ל-hs.

P 70 B תלוי בהקשר. לא שכב CGE one יחד עם HS P 70 B בתנאי TP replete במקטעים מסיסים או במקטעי ממברנה. הכמויות של חלבון CGE one ששכב יחד עם HS P 70 B ממקטעים מסיסים בתנאי TP depleted וממקטעי ממברנה בתנאי TP depleted נמצאות במתאם כמותי עם כמות HSP 70 B ששכב. האינטראקציה של CGE one עם HS P 70 B רק במצב A DP נצפתה גם בניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסות.

בניסוי זה, הוכנו משקעים עבור תערובות של תמציות המסומנות בחנקן 14 שאינן כוללות TP, ותמציות המסומנות בחנקן 15 הכוללות A TP. בעוד שהצורות המסומנות ככבדות וכקלות של הפפטיד HS P 70 B זוהו בעוצמות שוות, זוהתה רק הצורה המסומנת כקלה של הפפטיד CGE one מהתמציות המדוללות ב-A TP. כאן מוצגים אותם פפטידים מהמשקע anti HS P 70 D DB שהופק מתערובות של תמציות תאים ממיסות המסומנות באופן הדדי. בהתאם לכך, זוהתה רק הצורה המסומנת ככבדה של הפפטיד CGE one בתמציות המדוללות ב-TP, כמו גם שני הפפטידים HSP 70 B, המסומנים כקלים וככבדים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיווצר אצלכם תמונה ברורה של אופן ביצוע ניסוי שיקוע חלבונים הכולל הכנת דגימות לניתוח בספקטרומטריית מסות. זכרו כי זיהומים בחלבונים אנושיים, ובמיוחד קראטין, יעכילו את מדידות הפרוטיאומיקה בספקטרומטר המסות, ולכן נקיטת אמצעי בטיחות כגון שימוש בכפפות, סביבת עבודה נקייה ושימוש ברכיבים ברמה של LCMS היא קריטית בעת ביצוע הליך זה.