פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך ¹⁵ תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה ספציפית עם חלבון מטרה נתון בתמציות תאים המכילות חלבונים מסיסים וממברנים. ראשית, השג תיוג מטבולי מלא של תאי כלמידומונס עם חנקן 14 וחנקן 15 וצור ליזטים של תאים המכילים וחסרי TP. שלב צולב אופציונלי עוזר לייצב אינטראקציות חלבון חולפות. לאחר מכן, הפרד את הליזטים של התא לשברים, חלבונים מועשרים בלתי מסיסים וממברנה שמהם חלבון המטרה, שותפיו הספציפיים לאינטראקציה.

חלבון בקרה וחלבונים מזהמים הם משקעים חיסוניים ונרמזים. כעת, ערבבו את החלבונים המשקעים החיסוניים והתעכלו שלוש פעמים ונתחו אותם על ידי LCMS טנדם. התוצאות הבחינו בין שותפים לאינטראקציה אמיתית ולא נכונה על ידי הצגת יחסי חנקן שונים, 14 חנקן 15 פפטידים עבור חלבונים המקיימים אינטראקציה ספציפית עם חלבון המטרה וחנקן שווה.

14 יחסי חנקן 15 פפטידים לחלבון המטרה, חלבון הבקרה וחלבונים מזהמים. שיטת הבחירה לניתוח אינטראקציות חלבון חלבון היא לזרז את החלבון הנבחר ישירות עם האינטראקציה שלו. שותפים מתמציות תאים שבהם שניהם מתרחשים באישור ובריכוזים המקוריים שלהם.

עם זאת, כאשר עושים זאת, גם חלבונים מזהמים משקעים בעיקר מכיוון שהם מקיימים אינטראקציה עם הנוגדנים המשמשים כספקטרומטרי מסה מודרניים רגישים ביותר. הם יזהו באופן חד משמעי גם את החלבונים המזהמים ולכן אי אפשר להבחין בין אשמה לשותפים אמיתיים לאינטראקציה. בעיה זו מתגברת על ידי הטכניקה המוצגת כאן, המבוססת על תיוג מטבולי של 15 N אפנון זיקה חיסונית משקעים כאן בתיווך מצב A TP וספקטרומטריית מסה כמותית.

הטכניקה תוצג על ידי Stefan SCH Malinger, שהוא דוקטורנט בכיר במעבדה שלי. לאחר תיוג התאים במשך 10 דורות, העבירו שני תאי כלמידומונס מסומנים בחנקן 14 וחנקן 15 לצינורות SA 4G קוצרים על ידי צנטריפוגה Resus, משעים את הכדורים בשני מיליליטר של מאגר ליזה קר כקרח ומעבירים את התרחיפים לצינורות פלקון של 15 מיליליטר, אוספים את התאים הנותרים עם מיליליטר נוסף של מאגר ליזה כל אחד לכל Eloqua. הוסף 50 מיקרוליטר של מעכב פרוטאז 25 x ו-12.5 מיקרוליטר של דגימות מגנזיום כלוריד סוניקט טוחנת אחת ארבע פעמים 20 שניות על קרח לקבלת תא שלם עם הפסקות 22 ביניהם לקירור.

הכן ארבע כריות סוכרוז של שישה מיליליטר בצינורות דופן דקים SW 41 TI. הניחו בזהירות את כל נפח התא על כריות הסוכרוז. איזון עם ליזה, חיץ וצנטריפוגה להפרדת מתחמי חלבון מסיסים מהממברנות.

העבירו את קומפלקסי החלבון המסיסים מהחלק העליון של השיפוע לארבעה צינורות בז של 15 מיליליטר. הקפידו להימנע מהעברת חלקים מכרית הסוכרוז. לאחר מכן לכל דגימה הוסף 10% טריטון X 100 לריכוז סופי של 0.5% מערבבים בזהירות ומוסיפים מאגר ליזה לנפח כולל של שבעה מיליליטר.

לדף SDS וניתוחי דם חיסוניים. הניחו בצד 70 מיקרוליטר מכל תמצית תאים מסיסים לצינור חרוטי טרי של 1.5 מיליליטר והוסיפו 70 מיקרוליטר של שני מאגרי דגימת XSDS. לאחר מכן, השליכו את כריות הסוכרוז מצינורות הדופן הדקים SW 41 TI והוסיפו שלושה מיליליטר של מאגר ליזה לכל גלולה.

הוסף מיליליטר אחד של 10% טריטון X 100 לריכוז סופי של 2%לאחר המסת כל כדור על ידי סוניקציה, הוסף מאגר ליזה לנפח כולל של חמישה מיליליטר וצנטריפוגה. כמו קודם, קצרו את השברים העליונים של קומפלקסי חלבון הממברנה לצינורות בז של 15 מיליליטר. הוסף מאגר ליזה המכיל 2% טריטון X 100 לנפח סופי של שבעה מיליליטר.

השתמש ב-70 מיקרוליטר מדגימות אלה עבור דף SDS וניתוחי דם חיסוניים. ראשית יש לאזן את החלבון המצמד לנוגדנים. חרוזי סרו עם שתי שטיפות של ארבעה מיליליטר של מאגר ליזה מדוללים לשמונה מיליליטר ואליקווט.

מיליליטר אחד של התרחיף לכל אחד משמונה צינורות הבז של 15 מיליליטר המכילים קומפלקסים של חלבון מסיס או ממברנה ממלא TP ותאים מסומנים בחנקן 14 וחנקן 15 מדולל TP דוגרים במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס על גלגלת צינור כדי לזרז קומפלקסים חלבונים כדורי החרוזים על ידי צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנטים, והשאירו נפח קטן של נוזל על גבי החרוזים כדי למנוע זיהום מחלבונים שנדבקים לדפנות הפלסטיק. העבירו דגימות לצינורות חרוטיים טריים של 1.5 מיליליטר כדי לאסוף את כל החרוזים שנותרו בצינורות הבז. הוסף עוד 0.8 מיליליטר של מאגר ליזה המכיל 0.1% טריטון לכל מערבולת, צנטריפוגה עדינה, וכדי להעביר את המאגר עם חרוזים שיוריים לצינורות ה-einor לאחר מספר שלבי כביסה, דגימות צנטריפוגה למשך 15 שניות ב-16, 100 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

הסר תחילה את חומרי העל-דגימה בעזרת פיפטה רגילה. לאחר מכן הסר לחלוטין את כל הסופרנטנט שנותר עם מזרק המילטון בנפח 50 מיקרוליטר. לכל דגימה, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה טרי שהוכן ודגרו במיקסר תרמו בצנטריפוגה של 800 סל"ד את הדגימות למשך 15 שניות ב-16, 100 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס.

כעת העבירו כל סופרנטנט לצינור טרי באמצעות מזרק המילטון נקי של 50 מיקרוליטר. הוסף גם 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה לתהליך החרוזים כמו עם דגימות לפני ואגד את האלטים המתאימים. זכור לשמור 30 מיקרוליטר מכל דגימות EIT לדף SDS וניתוחי דם חיסוניים.

כעת שלבו את המשקעים החמקמקים מפלוס ומינוס A TP חנקן 14 וחנקן 15 המסומנים כחלבונים מסיסים וממברנה. לאחר מכן בצע אלקילציה להפחתה ועיכול אוריאה גבוה ראשוני כמתואר בכתב היד המצורף. המשך לתקציר טריפטיכון על גלגל סיבוב למשך 16 שעות לפחות.

ב-37 מעלות צלזיוס. גלולה את חרוזי הטריפסין עם צנטריפוגה של חמש דקות ב 16, 100 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנטים לצינורות עינור טריים של שני מיליליטר.

שוטפים את הצינורות הישנים עם 50 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 20 מילי-מולרי, חומצה אצטית 0.5% ובריכה עם הסופרנטנטים הראשונים. על מנת להכין טיפים תוצרת בית C 18 להתפלת הדגימות, גזרו שני דיסקים מחומר emcor C 18 בעזרת מחט מזרק והכניסו אותם לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. לאחר מכן נקב חורים במכסים של ארבעה צינורות עינור של שני מיליליטר והכנס את הקצוות למצב מוקדם של קצות שלב C 18 עם 50 מיקרוליטר של צנטריפוגה B למשך שלוש דקות ב-800 גרם ו-25 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, יש לאזן את קצות שלב C 18 עם 100 מיקרוליטר תמיסה, צנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-800 גרם ו-25 מעלות צלזיוס. חזור על שלב שיווי המשקל הזה פעם נוספת. המשך להעמיס 100 מיקרוליטר של דגימת הסופרנטנטים מעיכול הטריפטיכון על צנטריפוגת קצות שלב C 18 למשך שלוש דקות ב-800 גרם ו-25 מעלות צלזיוס.

חזור על טעינת העמודה ליישום מלא של סופרנטנטים לדוגמה. לאחר שטיפת קצות שלב C 18, יש להוציא את הפפטידים הטריפטיים לתוך שפופרת איינור טרייה של 1.5 מיליליטר עם 50 מיקרוליטר של צנטריפוגה B למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 800 גרם ו-25 מעלות צלזיוס. חזור על שלב האלוציאן פעם אחת ולאחר מכן יבש את הפפטידים עד להשלמתם במהירות VAC reus.

השעו את הפפטידים המיובשים ב-20 מיקרוליטר של תמיסה A ודגרו לפחות שעה על קרח, מופרעים על ידי שתי דגירות של 15 דקות בצנטריפוגה של אמבט סוניקט למשך 20 דקות ב-16, 100 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס ומרחו סנה על ננו C-M-S-M-S HSP 70. ידוע כי חלבוני הלם חום מקיימים אינטראקציה עם cos, chaperones ומצעים ספציפיים רק בהיעדר TP בחנקן 14 אלה, תמציות תאים המסומנות hs P, 70 B ו-CGE one, ממוקמות כמעט אך ורק לשבר המסיס ללא תלות במצב A TP. לעומת זאת, CF 1 beta ממוקם הן בשברים המסיסים והן בממברנה.

מכיוון שסוניקציה גוזרת חלק מ- CF בטא אחד מהממברנה הממוקמת A TP Synthes, היא משמשת כבקרת טעינה לשני השברים. כמויות דומות של H HSP 70 B הוזרזו עם נוגדנים נגד HSP 70 B מחנקן 14 וחנקן 15 שסומנו כתמציות מסיסות ללא תלות במצב A TP. לעומת זאת, רמות נמוכות של חלבון HS P 70 B שקעו משברי ממברנה עם כמויות מעט גדולות יותר שמקורן בשברי ממברנה מדוללים TP בהשוואה לשברים מלאים של TP כצפוי זיקה של CGE E אחד עבור hs.

P 70 B תלוי הקשר. אף CGE לא היה מזורז במקביל ל-HS P 70 B.In שברים מסיסים או ממברניים מלאים ב-TP. הכמויות של CGE חלבון אחד ששקעו יחד עם HS P 70 B משברים מסיסים מדוללים TP ושברי ממברנה מדוללים TP מתואמות כמותית עם כמות המשקעים HSP 70 B. האינטראקציה של CGE אחד עם HSP P 70 B רק במצב A DP נצפית גם בניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה.

בניסוי זה הוכנו משקעים לתערובות של חנקן 14 תמציות מסומנות חסרות TP וחנקן, 15 תמציות מסומנות המכילות TP. בעוד שהצורות הכבדות והקלות של פפטיד HS P 70 B זוהו בעוצמות שוות, רק הצורה המסומנת באור של ה-CGE זוהתה פפטיד אחד מהתמציות המדוללות A TP. אותם פפטידים מהמשקעים נגד HS P 70 D DB שמקורם בתערובות של תמציות תאים מסיסים המסומנים הדדית מוצגים כאן. בהתאם לכך, זוהתה רק הצורה הכבדה של פפטיד CGE אחד בתמציות מדוללות TP וכן פפטידים קלים וכבדים המסומנים HSP 70 B.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להתרשם היטב כיצד לבצע ניסוי משקעים עם הכנת דגימה לניתוח ספקטרומטריית מסה. אל תשכח שזיהומים בחלבון אנושי, במיוחד קרטין יפריעו למדידות המניעה שלך בספקטרומטר המסה ולכן אמצעי זהירות כגון כפפות, סביבה נקייה ואזורי דרגת LCMS הם חיוניים בעת ביצוע הליך זה.