Name: יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על ג elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: למד כיצד ליצור תא היפוקסיה בשיטת זרימה רציפה לחקר השפעות חמצן נמוך על C. elegans. שיטה זו מאפשרת בקרה מדויקת על ריכוזי גזים לניסויים ביולוגיים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לחברי המעבדה מילר לדיון קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי בפרס החוקר חדש מהמרכז הלם נתן למצוינות הביולוגיה הבסיסית של הזדקנות ל DLM לבין המכון הלאומי לבריאות הפרס R00 AG030550 כדי DLM.

1. בניית לשכות הסביבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את נפח סביר של החדר הקטן ביותר הדרוש היקף הפרוייקט. לשכת חייבת להתבצע על גז (O 2) חומר בלתי חדיר. מנות פיירקס התגבשות, קופסאות Anaeropack או גדולים יצוק אקריליק תיבות (מכשור Ellard), ניתן להשתמש. מצאנו כי 9 50 צלחות מ&quot;מ יכול להתאים מנה 100 x 50 Kimex התגבשות. לוחות זכוכית יכול לשמש מכסים של צלחות פיירקס התגבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חור בתא הנבחר ולהשתלב עם זכר פלסטיק Luer ל הולם צינור בארב (קול בן הזוג). אביזרי יכול להיות מאובטח על ידי מתאם צינור או עם אפוקסי. התקן מתאים דומה בצד השני של המיכל כדי לאפשר לגז לזרום פנימה והחוצה של החדר. אם אפשר, לקזז חורים להגדיל ערבוב סוערת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג בלוני גז דחוס עם המוגדרים O 2 בריכוזים (מאוזנת עם N 2) אשר מאושר על תקן CO 2 Ontent או התנאים anoxic, טהור N 2 (&lt;10 עמודים לדקה פלט 2). השתמש אוטומטית לעבור על הרגולטורים, על מחקרים ארוכי טווח כדי שלא לשבש את רמות החמצן החדרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתגובה האורגניזם כדי היפוקסיה הוכח להיות תלויה בטמפרטורה 15. על ידי הצבת חדר באינקובטור, טמפרטורות שונות יכול להישמר. הטמפרטורה בתוך חממה עלול להיות לא אחיד, וככזה, זה נבון לעשות שימוש לוגר הטמפרטורה נתונים כל הזמן למדוד את הטמפרטורה בתוך החדר. </li></ol> 2. חיבור הגז לשכת הסביבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיבורים כל, להשתמש שמינית אינץ&#39; חיצוני בקוטר צינורות מחוברים משני מחברי הצמד או אביזרי דחיסה. צינורות צריך להיות בלתי חדיר ו unreactive עם 2 O, כגון אתילן פרופילן fluorinated (FEP) או ניילון (קול בן הזוג). עבור סכמטי של ההתקנה הושלמה, ראה איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור COMגז טנקים צמודות מכשיר בקרת זרימה, כגון בקר מסת הזרימה (סיירה מכשירים) או rotameter (אלבורג). ודאו כי לחץ הזרם מטנק נמצא בטווח של המכשיר זרימה אביזרי צינור עקיצה. שני שלבים הרגולטורים משמשים בדרך כלל, כאשר בשלב השני מוגדר הלחץ הרצוי [ראה סעיף 3 לבחירת קצב הזרימה המתאים] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גז מימה ידי מבעבע במים מזוקקים באמצעות שטיפת גז בקבוק עם גליל fritted, ישירות לתוך אחד על אביזרי חדר הסביבה, עוזב מתאים 2 פתוח פליטה גז (ראה איור 1). על מחקרים קצרי טווח, לחות הגז מגן מפני dessication צלחת, אבל ניטור לחות עשוי להיות נחוץ עבור מחקרים ארוכי טווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dow Corning גריז אבק יכול לשמש כדי לאטום את החדר. משקולות מקום על מכסה תא כדי להבטיח חותם אטום. כדי לאשר חותם חזק וזרימה נאותה, לקיים בריכה קטנה של מים בכף y<html> יד עטוית כפפה שלנו מתאים על החדר ולבדוק בועות. </li></ol> 3. בחירת קצב הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהנחה ערבוב מושלם, יש חילוף הגזים של האטמוספירה 90% גזי בכל פעם את עוצמת הקול של החדר מוחלף (חוק Fick). כך, למשל, בחדר 100 סמ&quot;ק עם קצב זרימה של 100 סמ&quot;ק / דקה, לאוורר את הבית המקורי בחדר יוחלפו 90% גז הרצוי אחרי דקה 1, ויהיה asymptotically להתקרב בתמורה מלאה על ידי 90% מכל רגע לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספיקה גבוהה יותר, מיכלים קטנים יותר יגיע ריכוז החמצן הרצויה מהר יותר. עבור 100 x 50 Kimex מכולות (400 סמ&quot;ק), קצב הזרימה של 120 סמ&quot;ק / דקה יגיע תמורת 99.9% ב 10 דקות (3 חילופי). זה קצב הזרימה מתאים לתנאי חמצן מרבית. למיטב ידיעתנו לא היתה חקירה שיטתית של איך את שיעור השינוי של ריכוז 2 O משפיע על התגובה ב C. elegans. </li></ol>התחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. הכנת דוגמאות עבור assay ליכולת הקיום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים שנחשפו לתנאי חוסר חמצן בדרך כלל לברוח את פני השטח של צלחות אגר. כדי למנוע זאת, במקום טבעת של חומצה פלמיטית (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של אתנול) מסביב לקצה של הצלחות. חומצה פלמיטית ייצא פתרון כמו מתאדה אתנול, להקים מכשול פיזי. מחסומים חומצה פלמיטית אינם משפיעים על שיעור הטלת ביצים, פוריות או תוחלת החיים ב C. elegans 16,17. מתחפרת אינה מתרחשת בתדירות גבוהה יותר בתנאי חוסר חמצן, אמצעי המניעה נוספות, כך אינם נדרשים בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור אוכלוסיות מסונכרנים על ידי הלבנת מבוגרים הרה להולדת בטיפה קטנה של תמיסת אקונומיקה בסיסי על unseeded הצמיחה נמטודות מדיה (NGM) 18 צלחות. בניגוד אצווה גדול פרוטוקולים סטנדרטיים hypochlorite הלבנה, לאסוף 1-100 חיות בטיפת פתרון אקונומיקה על פני השטח של צלחת NGM, ולאחר מכן לאפשר פתרון אקונומיקה לספוג לתוך הצלחת <sup&gt; 18. לאחר לפחות 12 שעות, להעביר את הזחלים L1 מסונכרן צלחות שנזרעו עם OP50 חיידקים חיים. לחלופין, ניתן לאפשר למבוגרים הרה להולדת להטיל ביצים בצלחת 2-3 שעות כדי ליצור קבוצה של תולעים שתתפתח באופן סינכרוני או לבחור L4 הזחלים מן האוכלוסייה מעורבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע חשיפת עוברי מולבן היפוקסיה, כמו זה יכול להפחית את הכדאיות 13. לאסוף עוברים צעירים (2-4 תאים), מבוגרים הרה להולדת ניתן קצוץ בנפח קטן של מים עם סכין גילוח לבין עוברי עברה צלחות ידי pipet הפה לחשיפה לאחר היפוקסיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום צלחות בחדר הסביבה. חיות בקרת יש לשמור normoxia (בית אוויר) באותה טמפרטורה כמו תולעים שטופלו. אין הבדל הנצפה בין דגימות שנשארו בבית אוויר ואלה שמרו בתא זהה בבית האוויר זורם עליהם. ליזום זרימת הגז ולשמור על חשיפה לזמן הרצוי. כדי להבטיח אחידות הרמפה, כדי להיות בטוחלהחליף את המים בבקבוק גז לשטוף לפני החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להישרדות assay של עוברים, לאפשר התולעים לפתח עבור ה 48 לאחר החזרה לאוויר החדר, ובשלב זה הם צריכים להיות 4 שלבים זחלים / יום אחד למבוגרים. ציון על הישרדות, לצנזר את כל התולעים שלא ניתן להסביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש חיות שנחשפו היפוקסיה, להעביר תולעים ירידה של M9 על coverslip 22 מ&quot;מ 2, להפוך על משטח של agarose 2% M9 18. אם levamisole הצורך, (25 מ&quot;מ) או נתרן אזיד (10 mM) יכול לשמש חומר הרדמה. אזיד הנתרן levamisole עשוי לבלבל כמה תצפיות בשל רעילות ויש להשתמש בהם בתבונה 19. </li></ol> 5. קציר מהירה של היפוקסיה חשופים תולעים (דוגמה: הכנת דוגמאות לאנליזה HIF-1 במערב) רבים היפוקסיה המושרה תופעות מתהפכים במהירות עם שובו לאוויר החדר, כולל חידוש של ייצור ביצים 12, זירחון של אפיטופים mitoticב 13 embryogenesis והשפלה של החלבון HIF-1 9,20. בידוד מהיר של בעלי חיים שנחשפו היפוקסיה נדרש כדי להשיג אפקטים לשחזור בתנאים אלה. עם ההגדרה הזאת, בעלי חיים ניתן לקצור ו קפוא חנקן נוזלי תוך פחות משתי דקות. למרות חוסר חמצן לתאי כפפה תיבת לאפשר מניפולציה של דגימות בתנאים anoxic, העלות שלהם ומעשיות תנאים אחרים מאשר anoxia להגביל את התועלת שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בריסטול N2 תולעים על 4 10 ס&quot;מ צמיחה גבוהה (כספית) צלחות עד רוב התולעים הם מבוגרים הרה להולדת 18. לשטוף את התולעים אל צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל פתרון אקונומיקה אלקליין 01:05 ו דגירה עם סיבוב עד תולעים מתחילים להתמוסס, לא יותר מ 5 דקות 9. לשטוף את התולעים שלוש פעמים עם M9, מסתובב ליד XG 1500 בין כל שטיפה ללא בלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת עוברים מולבן על גבי 8 לוחות NGM 150 מ&quot;מ המאפשרים לפתח את הזחלים L4 (~~~HEAD=NNS 48 שעות עבור בריסטול N2 ב 22 מעלות צלזיוס).העבר צלחות לתאי סביבתיים ולחשוף את חוסר חמצן (1,000 עמודים לדקה, 5,000 עמודים לדקה) ו anoxic (N2) תנאי למשך 4 שעות. פעמים חשיפה ישתנה בהתאם עיצוב ניסיוני. בעוד החשיפה היפוקסיה יש השפעה מיידית על קצב ההטלה, שני עוברי תאים מתים לאחר 16-18 שעות של חשיפה 12. עם תוכנית התקנה זו קאמרית היפוקסיה, הגבול התחתון של חשיפה מוגבלת על ידי שער החליפין האווירה צורך להגיע לשיווי משקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 לייבל 1.5 microfuge מ&quot;ל צינור ואחד צינור חרוטי 15 מ&quot;ל למדגם כל ניסיוני. תולעים שנחשפו היפוקסיה נוטים יותר להיצמד צידי הצינור במהלך הקטיף. כדי למנוע זאת, במקום 100 μL של 1% נתרן סולפט dodecyl (SDS) בצינור כל קוני 15 מ&quot;ל. אם SDS מעכב יישומים במורד הזרם, שור סרום אלבומין (BSA) ניתן להשתמש כדי למנוע הידבקות. השימוש השגרתי של SDS או BSA לא נראה שיש הבדל ניכר. הוסף 50 μl של 2x טוען חלבון צבע (4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol וזכר כחול bromphenol ב גליצרול 30% (w / v)) צינור מ&quot;ל 1.5 microfuge. יש דיואר של חנקן נוזלי מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמן את הצעדים לאחר הסרת תולעים מ היפוקסיה ולהקליט. הסר את המכסה לתא hypoxic, קח 1 צלחת המדגם, לאטום את החדר. להשתמש במים מזוקקים לשטוף את התולעים אל מסנן ניילון ואז לשפוך לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. לסובב את התולעים למטה צנטריפוגה שולחנית XG ב 1500 על 15-20 שניות עם הבלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשואב אבק כדי להסיר את רוב supernatant מהצינור, עוזב את התולעת גלולה ללא שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, העבר את התולעת גלולה ב 50 μL לצינור מ&quot;ל 1.5 microfuge. לאטום צינור לטבול את בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עד שכל הדגימות היו מבודדים. בצע את ההליכים עבור דגימות בית אוויר בקרה עקביות. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li></ol> 6. נציג תוצאות תופעות האורגניזם של היפוקסיה ניתן לראותעל ידי בחינת הכדאיות לבגרות של C. elegans (איור 2). עוברים שנקבעו על ידי wild-type בריסטול (N2) ו HIF-1 (ia04) מוטציות מחיקה כולם שורדים בבית אוויר O 2 בריכוזים (210,000 עמודים לדקה פלט 2). N 2 תולעים מסוגלים להסתגל ולשרוד לבגרות בשנת 5000 ppm O 2, ואילו HIF-1 עוברים לא בת קיימא. זה מראה כי HIF-1 הוא חיוני להתאים את רמות משתנות של חמצן זמין בסביבה 10. לא N2 ולא HIF-1 בעלי חיים יכולים לשרוד חשיפה עמודים לדקה 1000 O 2. לדמיין התולעת ישירות היפוקסיה אפשרית עם השימוש של היקף הניתוח, מיכל ברורה (איור 3). ישירות על ידי הצבת חדר היפוקסיה על היקף הניתוחים, אין צורך להסיר את התולעים מ היפוקסיה לראות תגובות האורגניזם. היקף יכול להיות מצויד עם illumation הקרינה (כמו באיור 3 </stronז&gt;), להוסיף ולהרחיב את סוגי התצפיות היפוקסיה כי הם אפשריים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> באיור 1. דוגמה כיוון קאמרית. היפוקסיה של זרימת הגז מצוין באמצעות החצים. הגז המאוחסן במיכלים דחוסים גז עם המוגדרים O 2 בריכוזים (1) ו הרגולטור 2 בשלב מצורף (2). הגז נכנס התחתון של הצינור זרימה (3), היציאה העליונה בקצב הזרימה הנכונה. הגז זורם לתוך הבקבוק ואז הבועה (4), לחות הגז (להבטיח חיבור נכון של הבקבוק בועות על ידי התבוננות בועות). גז התייבשות לאחר מכן הוא עובר לחדר היפוקסיה על שסתום יבוא (5), חושפת את דגימות היפוקסיה. גז ולבסוף פתחי אל תוך החדר דרך חור פליטה קדח בתא. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> איור 2. הכדאיות של עוברים חשופים 1,000 עמודים לדקה O 2, 5000 עמודים לדקה O <sub&gt; 2 ו normoxia (~ 210,000 עמודים לדקה פלט 2). עוברים נחשפו כל התנאים כמו חמצן עוברים למשך 24 שעות בתאי חמצן רציפה הזרימה. תולעים הועברו תנאי normoxic, מותר לפתח לבגרות למשך 48 שעות ולאחר מכן הבקיע את הכדאיות לבגרות. n&gt; 50, N = 5. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> איור 3. ויזואליזציה של C. elegans ב היפוקסיה עם מיקרוסקופ. תולעים נחשפים היפוקסיה באמצעות השיטות המתוארות. החדר הסביבה שקוף (שנבנה עם צלחת התגבשות פיירקס ואת צלחת זכוכית) ממוקם ישירות על במת היקף הניתוחים. שתי השקפות מוצגות, כולל 1 זרימת הגז כל להגדיר, והשני עם חדר רק על הבמה מיקרוסקופ.

<ol><li>Danovaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+metazoa+living+in+permanently+anoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The first metazoa living in permanently anoxic conditions.</a> BMC Biology. 8, 30(2010).</li>
<li>Birner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Hypoxia-inducible+Factor+1+alpha+Is+a+Marker+for+an+Unfavorable+Prognosis+in+Early-Stage+Invasive+Cervical+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer.</a> Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+-+a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).</li>
<li>Ramirez-Bergeron, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+affects+mesoderm+and+enhances+hemangioblast+specification+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development.</a> Development. 131, 4623-4634 (2004).</li>
<li>Staff, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheel-well+Stowaways+Risk+Lethal+Levels+of+Hypoxia+and+Hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Factors+and+Aviation%22%5BJournal%5D)">Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia.</a> Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).</li>
<li>Shen, C., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Analysis+of+Hypoxia+Signaling+and+Response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).</li>
<li>Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+HIF-1+Hypoxia-inducible+Factor+during+Hypoxia+Response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).</li>
<li>Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1+is+a+basic-helix-loop-helix-PAS+heterodimer+regulated+by+cellular+O2+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).</li>
<li>Epstein, A. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+EGL-9+and+Mammalian+Homologs+Define+a+Family+of+Dioxygenases+that+Regulate+HIF+by+Prolyl+Hydroxylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation.</a> Cell. 107, 43-54 (2001).</li>
<li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+Animation+in+C.+elegans+Requires+the+Spindle+Checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li>
<li>Gray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430, 317-322 (2004).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+Elegans+Are+Protected+from+Lethal+Hypoxia+by+an+Embryonic+Diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause.</a> Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li>
<li>Hu, C. -J., Wang, L. -Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Roles+of+Hypoxia-Inducible+Factor+1%7Balpha%7D+%28HIF-1%7Balpha%7D%29+and+HIF-2%7Balpha%7D+in+Hypoxic+Gene+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).</li>
<li>Treinin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+is+required+for+heat+acclimation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+increases+thermotolerance+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 104, 20618-20622 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Salceda, S., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+Factor+1%CE%B1+%28HIF-1%CE%B1%29+Protein+Is+Rapidly+Degraded+by+the+Ubiquitin-Proteasome+System+under+Normoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).</li>
<li>Theilacker, J. C., White, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Gases+in+Air+and+Its+Affect+on+Oxygen+Deficiency+Hazard+Abatement%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement.</a> AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).</li>
<li>Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+degradation+by+anoxia+and+ischemia+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts.</a> Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).</li>
<li>Probst, G., Riedinger, H. Jr, Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Control+of+DNA+Replication+in+Response+to+Hypoxia+and+to+Inhibited+Protein+Synthesis+in+CCRF-CEM+and+HeLa+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells.</a> Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).</li>
<li>Semenza, G. L., Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSemenza%2C+GL+%22Oxygen+Sensing%22">Oxygen Sensing</a>. 381, Academic Press. (2004).</li>
<li>Chan, K., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia-Induced+Suspended+Animation+in+Budding+Yeast+as+an+Experimental+Paradigm+for+Studying+Oxygen-Regulated+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression.</a> Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).</li>
<li>Nystul, T. G., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide-induced+suspended+animation+protects+against+hypoxic+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 101, 9133-9136 (2004).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

שיטה זו מהווה אסטרטגיה לבניית סביבה hypoxic המאפשר לסביבות עם ריכוזים מדויקים של חמצן להישמר במעבדה. לשכות אלה מספקים שיטה פשוטה חשיפת אורגניזמים בריכוזים נמוכים ספציפיים של O 2 וניטור התפוקות מולקולריות ופיזיולוגיות. החדר הסביבה תיאר מורכב על ידי המעבדה במקום לרכוש מסחרית ולכן יכול להיות שונה כדי להתאים את הצרכים של הניסוי. אחת יתרון בולט של שיטה זו הוא עיצוב זרימה רציפה. זו מבטלת את הקשיים שבהם נתקלו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> צינורות (FEP ו PTFE) </td><td> קול בן הזוג Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE)&quot; R-3603 </td></tr><tr><td> אביזרי דחיסה </td><td> סיאטל נוזל מערכות </td><td> 06363-58 (מצמד מ 1/16 &quot;) 06363-62 (פ מצמד 1/16 &quot;) 06363-60 (מ &#39;מצמד 1/8 &quot;) 06363-61 (פ מצמד 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> תזרים צינורית </td><td> אלבורג </td><td> PMR3-010073 (3 פלט) PMR1-013520 (1 פלט) </td></tr><tr><td> זרימת מסה בקר </td><td> סיירה מכשירים </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (מסה Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Trak חכם 2) </td></tr><tr><td> דחוס מיכל הדלק </td><td> Airgas </td><td> לפי הזמנה &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> זכר Luer פלסטיק אביזרי ברביטורטים צינור </td><td> קול בן הזוג </td><td> 45505-41 (500 סדרה 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> עופרת תיבות אקריליק </td><td> Ellard מכשור </td><td> עשוי להורות </td></tr><tr><td> אביזרי צנרת (פליז או נירוסטה) </td><td> סיאטל נוזל מערכות </td><td> B-402-1 (1/4 &quot;אגוז) B-200-3 (1/8 &quot;טי איחוד) B-400-set (1/4 &quot;מתנוצץ בחישוקי המתכת) B-QM2-B1-200 (QC QM גוף) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;conn זכר) </td></tr><tr><td> Dow Corning גריז אבק </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> תיבת AnaeroPack </td><td> Misubishi גז כימיקלים </td><td> R684004 (0.4 ליטר) R685025 (2.5 ליטר) R685070 (7.0 ליטר) </td></tr><tr><td> פיירקס גז בקבוק כביסה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 מ&quot;ל) CLS31770250C (250 מ&quot;ל) CLS31770125C (125 מ&quot;ל) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> חומצה פלמיטית </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> נגד העכבר עיזים IgG-חזרת peroxidase </td><td> דרום ביוטכנולוגיה Associates </td><td> 1032-1005 </td></tr><tr><td> SuperSignal Chemiluminsecent מערב פיקו תשתית </td><td> פירס כימית </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 התגבשות זכוכית מנות </td><td> Kimax קימבל </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em&gt; ג elegans</em

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

חמצן חיוני metazoans כל לשרוד, עם חריג אחד ידוע 1. ירידה O 2 זמינות (היפוקסיה) יכולים להיווצר במהלך מצבים של התפתחות המחלה, רגיל או שינויים בתנאי הסביבה 2-5. הבנת מסלולי איתות תאיים המעורבים בתגובה ל היפוקסיה יכול לספק תובנה חדשה אסטרטגיות טיפול של מחלות אנושיות שונות, משבץ לסרטן. מטרה זו כבר הקשתה, לפחות בחלקה, בשל קשיים טכניים הקשורים עם חשיפה מבוקרת hypoxic באורגניזמים מודל מקובל מבחינה גנטית. Caenorhabditis elegans את נמטודות הוא אידיאלי כאורגניזם מודל לחקר בתגובה חוסר חמצן, כפי שהוא קל תרבות גנטית לתפעל. יתר על כן, ניתן ללמוד התגובות הסלולר ספציפיים חוסר חמצן O 2 בריכוזים ללא תופעות מבלבלים מאז ג elegans להשיג O 2 (ו גזים אחרים) על ידי דיפוזיה, בניגוד למערכת הנשימה הקל 6. גורמים הידועים כמעורבים בתגובה ל היפוקסיה שמורים ב C. elegans. תגובה ממשית היפוקסיה תלויה בריכוז מסוים של O 2 הזמין. ב C. elegans, חשיפה מתונה היפוקסיה מעורר תגובה תעתיק מתווכת במידה רבה על ידי HIF-1, את הפערים המשתמרים היפוקסיה, גורם שעתוק מושרה 6-9. ג. עוברים elegans דורשים HIF-1 לשרוד עמודים לדקה 5,000-20,000 O 2 7,10 . היפוקסיה היא מונח כללי של &quot;פחות מ רגיל 2&quot;. Normoxia (רגיל O 2) יכול להיות גם קשה להגדיר. בדרך כלל אנחנו רואים האוויר בחדר, שהיא 210,000 עמודים לדקה O 2 להיות normoxia. עם זאת, הוכח כי ג elegans יש העדפה התנהגותי עבור O 2 בריכוזים של 5-12% (50,000-120,000 עמודים לדקה O 2) 11. ב Larvae ומבוגרים, HIF-1 פעולות כדי למנוע היפוקסיה-Induced diapause בשנת 5000 ppm O 2 12. עם זאת, HIF-1 אינו משחק תפקיד בתגובה לריכוזים נמוכים יותר של O 2 (anoxia, הגדרה תפעולית &lt;10 עמודים לדקה O 2) 13. ב anoxia, C. elegans נכנס למצב של חיות מושהית הפיך שבו כל פעילות הנצפה במיקרוסקופ מפסיק 10. העובדה כי התגובות הפיזיולוגיות השונות להתרחש בתנאים שונים מדגיש את החשיבות של בעל השליטה ניסיוני על ריכוז של חוסר חמצן O 2. כאן, אנו מציגים שיטה לבנייה ויישום של תאים המייצרים תנאים סביבתיים hypoxic אמין לשחזור עם ריכוזים מוגדרים של O 2. שיטת הזרימה המתמשכת מבטיחה איזון מהיר של החדר ומגביר את היציבות של המערכת. בנוסף, שקיפותהנגישות של החדרים לאפשר ראיה ישירה של בעלי חיים שנחשפו היפוקסיה. בנוסף, אנו מדגימים שיטה יעילה של קצירת ג elegans דגימות במהירות לאחר חשיפה היפוקסיה, אשר יש צורך לבחון רבים במהירות, מהופכים השינויים המתרחשים 10,14 היפוקסיה. שיטה זו מספקת תשתית בסיסית כי ניתן לשנות בקלות עבור הצרכים מעבדה נפרדים, כולל מערכות מודל שונות ועוד מגוון של גזים.

נייר עמדה זה מפרט כיצד להשתמש רציפה הזרימה לתאי חוסר חמצן כדי ליצור אווירה עם ריכוזים מוגדרים של O<sub&gt; 2</sub&gt; להבין תגובות ביולוגיות לירידה O<sub&gt; 2</sub&gt;. מערכת זו קל להתקנה ולתחזוקה, גמישים מספיק כדי להתאים מגוון רחב של O<sub&gt; 2</sub&gt; ריכוז ומערכות מודל

חמצן חיוני להישרדותם של כל המטזואים (בעלי חיים רב-תאיים), למעט חריג אחד ידוע1. זמינות מופחתת של O2 (היפוקסיה) עלולה להתרחש במצבי מחלה, ...

מטרת הניסוי הבא היא להקים ולתחזק תא היפוקסיה באמצעות שיטת זרימה רציפה. דבר זה מושג על ידי השגה וייצור של הפקתים, הבקבוקים והתאים הדרושים לפרוצדורה. כשלב שני, חברו את מיכל החמצן ובחרו את קצב הזרימה כדי ליצור את רמת ההיפוקסיה הרצויה.הרט את הגז על ידי העברתו דרך בקבוק בועות מלא במים דה-יוניים. חבר את הגז המהורט לתא ההיפוקסיה והנח את דגימות הבדיקה בתא כדי לחשוף אותן לתנאי היפוקסיה. התוצאות המתקבלות מראות תמותה עוברית תלויה ב-Hi F1 בתנאי היפוקסיה, בהתבסס על תצפית על ההישרדות עד לבגרות.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאי כפפות (glove boxes), הוא שהיא קלה וזולה ליישום במעבדה ומספקת ריכוז מדויק וניתן לשחזור של גזים בתא הסביבתי. בעוד ששיטה זו מספקת תובנות לגבי התגובה להיפוקסיה בנמטודה *C. elegans*, ניתן להתאימה גם למערכות אחריות, כולל אורגניזמי מודל גדולים יותר ותרביות תאים. בנוסף, ניתן להשתמש בה למחקר של גזים אחרים, כולל פחמן דו-חמצני ומימן גופרתי.פרוטוקול זה מדגים כיצד להקים תא היפוקסיה. גז מאוחסן במכלי גז דחוסים עם ריכוזי חמצן מוגדרים, ואליהם מחובר וסת רב-שלבי (two stage regulator). הגז נכנס לתחתית צינור הזרימה ויוצא מהחלק העליון בקצב הזרימה המתאים.הגז זורם לאחר מכן אל בקבוק הבעבוע, שם הוא עובר הידרציה. גז המימן עובר לאחר מכן אל תא ההיפוקסיה דרך שסתום הכניסה, ובכך הו

creating-defined-gaseous-environments-to-study-effects-hypoxia-on-c

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

סרטון זה מציג שיטה לבדיקת היפוקסיה בזחלי דרוזופילה על ידי הערכת יכולות המחילה והמנהור שלהם. באמצעות טכניקה זו חוקרים יכולים להבחין בין זחלים הסובלים ממחסור בחמצן לבין אלה עם ליקויים התפתחותיים. פרוטוקול הדוגמה מדגים את ההתקנה עבור בדיקה זו.

דרוזופילה בדיקת מחילה ומנהור: שיטה להערכת היפוקסיה של רקמות בזחלי זבובים

פרוטוקול מתואר המשתמש אנוקסיה / רעב בג elegans למודל איסכמיה / reperfusion. תוצאות תפקודיות כוללות תמותה מוגברת, ליקויים גלויים בתהליכים עצביים-GFP שכותרתו, ותגובות התנהגותיות לקויים הדורשות תפקוד עצבי.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

כאן אנו מפרטים פרוטוקולים שתוכננו במיוחד לניטור פגמים מורפוגניים המתרחשים בשלבים מוקדמים ומאוחרים של התארכות עוברית של הנמטודה Caenorhabditis elegans. בסופו של דבר, פרוטוקולים אלה נועדו לזהות גנים המווסתים את השלבים הללו ולאפיין את הדרישות הדיפרנציאליות שלהם לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

אנו מציגים מערכת קאמרית היפוקרטית חדש לשימוש עם אורגניזמים ימיים כגון צפרדע ועופות דג הזברה. המערכת שלנו היא פשוטה, חזקים, חסכונית ומאפשר אינדוקציה וקיימות של היפוקסיה in vivo ועד 48 שעות. אנו מציגים 2 שיטות לשחזור כדי לפקח על היעילות של היפוקסיה.

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

הפרוטוקול מתאר של assay פשוט לזהות את הזחלים דרוזופילה melanogaster חווים היפוקסיה תחת רמות חמצן אטמוספרי רגיל. פרוטוקול זה מאפשר הזחלים שתקבעו יהיה מכובד של מוטאנטים אחרים שמראים פנוטיפים חופפים כגון והאתרי או צמיחה איטית.

וזמינותו נובר/למנהור עבור זיהוי של היפוקסיה ב הזחלים דרוזופילה melanogaster

נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

השפעות טרנס ומרובות הדורות של כימיקלים מתמידים הם חיוניים לשפוט את ההשלכות לטווח הארוך שלהם בסביבה ועל בריאות האדם. אנו מספקים שיטות מפורטות הרומן ללמוד טרנס ואפקטים רב הדורי באמצעות בעלי חיים בחינם ה, האלקאנס.

השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

למד כיצד ליצור תא היפוקסיה בשיטת זרימה רציפה לחקר השפעות חמצן נמוך על C. elegans. שיטה זו מאפשרת בקרה מדויקת על ריכוזי גזים לניסויים ביולוגיים שונים.

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על

גלה סרטונים נוספים