יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על ג elegans

מטרת הניסוי הבא היא להקים ולתחזק תא היפוקסיה בשיטת זרימה רציפה. זה מושג על ידי השגה וייצור של הצינורות, הצלוחיות והתאים הדרושים להליך. כשלב שני, חבר את מיכל החמצן ובחר את קצב הזרימה כדי ליצור את רמת ההיפוקסיה הרצויה.

הרטיבו את הגז על ידי העברתו דרך בקבוק בועות מלא במים נטולי יונים. חבר את הגז המיובש לתא ההיפוקסיה והנח את דגימות הבדיקה בתא כדי לחשוף אותן לתנאים היפוקסיים. מתקבלות תוצאות המראות קטלניות עוברית תלויה ב-Hi F1 בהיפוקסיה על סמך התבוננות בכדאיות לבגרות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קופסאות כפפות, הוא שהיא קלה וזולה לייצור במעבדה ומספקת ריכוז מדויק וניתן לשחזור של גזים בתא הסביבתי. בעוד ששיטה זו מספקת תובנה לגבי התגובה ההיפוקסית באלגנטיות הנמטודה C, ניתן להתאים אותה גם למערכות אחרות, כולל אורגניזמים מודלים גדולים יותר ותרבית תאים. בנוסף, ניתן להשתמש בו לחקר גזים אחרים, כולל פחמן דו חמצני ומימן גופרתי.

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבנות תא היפוקסיה. הגז מאוחסן במיכלי גז דחוס עם ריכוזי חמצן מוגדרים, ומחובר ווסת דו-שלבי. גז נכנס לתחתית צינור הזרימה, ויוצא מהחלק העליון בקצב הזרימה הנכון.

לאחר מכן זורם גז לתוך בקבוק הבועה ומרטיב את הגז. לאחר מכן, גז הידרו עובר לתא ההיפוקסיה בשסתום הזרימה, וחושף את הדגימות להיפוקסיה. הגז יוצא לבסוף לחדר דרך חור פליטה שנקדח בתא.

צלחת התגבשות פיירקס או בקופסת חץ יכולה לשמש כגוף החדר הסביבתי. יש לשמור על נפח המכולה למינימום והחומר חייב להיות אטום לגז. קדחו חור בצד אחד של המיכל עם קצה פחמן או יהלום, קדחו והתאימו עם התאמת דוקרנים לצינור פלסטיק.

מערבבים את האפוקסי לפני המריחה על הקופסה וההתאמה. לאחר מכן חזור על אותו הליך בצד הנגדי של המיכל כאשר החור השני מקוזז מהראשון. כדי להגביר את הערבוב הסוער, השתמש בצינורות קוטר חיצוני של שמונה אינץ', FEP או ניילון כדי לחבר את מיכלי הגז הדחוס להתקן בקרת זרימה, כגון בקר זרימת מסה או מד רוטור.

מיכלי הגז צריכים להיות בעלי ריכוזי חמצן מוגדרים מאוזנים עם חנקן שהם תקן מוסמך לתכולת חמצן או למצבים אנוקסיים. חנקן טהור השתמש בווסת דו-שלבי כאשר השלב השני מוגדר ללחץ הרצוי. עיין בהוראות בפרוטוקול הכתוב לבחירת קצב זרימה מתאים.

לאחר מכן חבר את הצינור מהווסת הדו-שלבי לצינור הזרימה השולט בקצב זרימת הגז הנכנס לתא. שקעי צינור הזרימה מחוברים לבקבוק שטיפת גז עם גליל פריטן המכיל מים מזוקקים. לאחר מכן חבר את הצינור בצד השני של בקבוק הכביסה לאחד האביזרים בתא הסביבתי.

זה ירטיב את הגז הנכנס לתא הסביבתי. השתמש בשומן ואקום כדי לאטום את החדר. לאחר מכן הניחו משקולות על מכסה החדר כדי להבטיח אטימה אטומה.

בדוק את האיטום על ידי החזקת כמות קטנה של מים בכף יד עטויה כפפה לחיבור פליטת הגז בתא ובדיקת בועות. ראשית, ליצור אוכלוסיות מסונכרנות של אלגן הימי. הניחו 1 עד 100 GR בוגרים בטיפה של תמיסת אקונומיקה אלקליין על פני צלחת מדיה לגידול נמטודות לא זרועות.

אפשר לתמיסת האקונומיקה להיספג בצלחת לאחר תקופת דגירה של שמונה שעות לפחות. העבירו את זחלי ה-L המסונכרן לצלחת עם זרעי חיידקי OP 50 חיים. לחלופין, אפשר ל-GRA בוגר להטיל ביצים על הצלחת במשך שעתיים-שלוש כדי ליצור קבוצת תולעים שתתפתח באופן סינכרוני או לקטוף L ארבעה זחלים מאוכלוסייה מעורבת כדי לאסוף עוברים צעירים.

בשלב שניים עד ארבעה תאים, השתמש בסכין גילוח כדי לקצוץ GR בוגרים בנפח קטן של מים ולאחר מכן להעביר את העוברים באמצעות פיפטה מהפה לפני העברת התולעים לצלחת לחשיפה לתנאים היפוקסיים. מניחים טבעת של 10 מיליגרם למיליליטר חומצה פלמיטית באתנול סביב קצה הצלחות. כדי למנוע מהתולעים לברוח מפני השטח של צלחת האגר.

החומצה הפלמיטית תצא תמיסה. כאשר האתנול מתאדה ויוצר מחסום פיזי להבטחת אחידות, הקפד להחליף את המים בבקבוק שטיפת הגז לפני החשיפה בתא הסביבתי. לאחר העברת התולעים לצלחות, אטמו את הלוחות בתא הסביבתי, התחילו את זרימת הגז ושמרו על חשיפה לזמן הרצוי לבדיקה.

לצורך כדאיות העוברים לבגרות, אפשר לתולעים להתפתח 48 שעות לאחר החזרה לאוויר החדר, ובשלב זה הן צריכות להיות. זחלי שלב רביעי או בוגרים ביום אחד מקבלים ציון לכדאיות לבגרות. כדי לדמיין את התולעים מהוות חשיפה היפוקסית, העבירו את התולעים לטיפה של M 9 על החלקת כיסוי מרובעת של 22 מילימטר והפכו על כרית של 2% ב-M 9 במידת הצורך.

25 מילימולר של אמול או 10 מילי-מולרי נתרן אזיד יכולים לשמש כחומר הרדמה. לחלופין, לאחר חשיפה להיפוקסיה, ניתן למקם את החדר הסביבתי השקוף ישירות על במת היקף הניתוח. מוצגות שתי תצוגות, אחת, כולל כל מערך זרימת הגז.

השני רק עם החדר על במת המיקרוסקופ. גדל בריסטול N שתי תולעים על ארבע לוחות גדילה בגובה 10 סנטימטרים עד שרוב התולעים הן GR בוגרות. שטפו את התולעים לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר עם תמיסת אקונומיקה אלקליין אחת עד חמש ודגרו בסיבוב עד שהתולעים מתחילות להתמוסס.

לא יותר מחמש דקות. שטפו את התולעים שלוש פעמים כאשר M 9 מסתובב כלפי מטה ב-1, 500 פעמים G בין כל שטיפה ללא צלחת שבירה. העוברים המולבנים על 8 לוחות NGM של 150 מילימטר ומאפשרים לעוברים להתפתח לארבעה זחלים למשך כ-48 שעות.

בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, העבירו את הלוחות לתא הסביבתי ונחשפו לתנאים היפוקסיים ואנוקסיים למשך ארבע שעות או למשך הזמן שצוין בתכנון הניסוי. כדי לקצור דגימות הסר במהירות את המכסה לתא ההיפוקסי. קח צלחת דגימה אחת ואטום מחדש את זמן החדר ורשום את השלבים.

לאחר הוצאת התולעים מהיפוקסיה, כל התהליך הזה אמור להימשך פחות משתי דקות. השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף את התולעים על מסנן ניילון ולאחר מכן שפך לתוך צינור חרוטי מסומן של 15 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר של צנטריפוגה 1% SDS. התולעים ב-SDS בצנטריפוגה שולחנית הן 1,500 פעמים G למשך 15 עד 20 שניות.

עם הפסקה, השתמש בוואקום כדי להסיר את רוב הספינאט מהצינור, והשאיר את כדור התולעת ללא מגע. בעזרת פיפטה העבירו את כדור התולעת עם נפח נוזל קבוע מראש לצינור אשפה 1.5 מיקרו מסומן. אם הדגימה אמורה לשמש לדף SDS, צינור זה יכול להכיל נפח שווה של פי שניים טעינת חלבון צבע לאטום את הצינור ולטבול בחנקן נוזלי.

חזור על הפעולה עד שכל הדגימות יבודדו. עקוב אחר נהלים אלה עבור דגימות בקרת אוויר ביתיות לעקביות ניתן לאחסן דגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס. נתון זה מראה את הכדאיות של עוברים שנחשפו ל-1000 חלקים למיליון חמצן, 5,000 חלקים למיליון חמצן ונורמוקסיה בסביבות 210,000 חלקים למיליון חמצן.

העוברים נחשפים לכל מצב במשך 24 שעות בתאי חמצן בזרימה רציפה. תולעים הועברו לתנאים נורמוקסיים שהורשו להתפתח לבגרות למשך 48 שעות, ולאחר מכן קיבלו ציון על כדאיות לבגרות. לאחר הליך זה, ניתן לאסוף דגימות לניתוח עוקב על ידי QPCR של כתם מערבי או בדיקות פיזיולוגיות כגון תוחלת חיים או ייצור צאצאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד להקים תא היפוקסיה בזרימה רציפה במעבדה שלך.