השרשה ותוך גולגולת Stereotactic בחי הדמית bioluminescent של xenografts גידול במערכת מודל עכבר של multiforme glioblastoma

אנו מתארים שיטה משולבת להשתלה המדויקת, stereotactic של תאי multiforme glioblastoma אדם לתוך המוח של עכברים בעירום וסידורי עוקבים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בהשתלה סטריאוטקטית מדויקת של תאי סרטן גליובלסטומה מולטיפורמה הניתנים להדמיה ביולוגית במוחם של עכברים עירומים כדי ליצור קסנוגרפלים לגידול המסכמים את המאפיינים הקליניים העיקריים של גליובלסטומה מולטיפורמה. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של תאי גידול גליובלסטומה מולטיפורמה כדי לבטא ביציבות לוציפראז להדמיה ביולוגית סדרתית לא פולשנית. השלב השני הוא להרדים את העכבר ולהניח אותו בריסון הסטריאוטקטי.

לאחר מכן, מבצעים חתך בעור וקודחים חור בור בקואורדינטות המדויקות מ-B bgma. השלב האחרון הוא השתלה איטית של תאי גידול במוח באמצעות טכניקות סטריאוטקטיות ואחריה הסרת המחט וסגירת החתך. בסופו של דבר, הדמיה ביולוגית והדמיית תהודה מגנטית משמשות לביצוע הדמיה סדרתית לא פולשנית כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול ותגובה לטיפולים מחקריים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות כמו השתלה ידנית לא סטריאוטקטית של תאים סרטניים הוא שהשיטה של השתלה בין-גולגולתית סטריאוטקטית של תאי גידול ועכברים המתוארת כאן מייצרת גידולים הניתנים לשחזור יותר המסכמים באופן סביר את דפוס הצמיחה החודרני והמהיר של גליובלסטומה קלינית מולטיפורמה. התחלואה והתמותה סביב הניתוח נמוכים מאוד, ושיעור נטילת הגידול גבוה מאוד. טכניקה זו מתאימה במיוחד לניסויים בריבוד עכברים באופן שווה לקבוצות טיפול שונות בהן רצוי שיהיו גידולים הניתנים לשחזור בעלי תכונות ביולוגיות בגודל דומה במיקום אנטומי כדי להתחיל בהליך זה.

לאחר הרדמת העכבר בתערובת קטמין קסילזין, מקם אותו ב-Stulting Digital רק עבור פלטפורמה סטריאוטקטית של עכבר על ידי חיבור השיניים החותכות שלו במוט הנשיכה של מרסן החוטם. לאחר מכן הדק את האף clamp מעל החוטם. בינתיים, ודא שראש העכבר נמצא במישור ישר.

לאחר מכן, העבר את העכבר המאופק לפלטפורמה הסטריאוטקטית. התאם את מיקום החיה כך שקצות מוטות האוזניים יהיו בקצה הכפוף של תעלת האוזן. לאחר מכן אבטח את מוט הנשיכה למסגרת הסטריאוטקטית.

העכבר צריך להיות מונח על פלטת חימום מפלסטיק יציבה המאובטחת עם סרט לפלטפורמה כדי לספק ויסות טמפרטורה מבוקר משוב במהלך הניתוח. לאחר מכן, קדם את מוטות האוזניים לחלק המפונק של תעלת האוזן. אבטח אותם כך שראש העכבר יהיה במישור ישר ומשותק.

לאחר מכן, הכנס את הקצה המשומן של בדיקת טמפרטורת פי הטבעת כדי לנטר את טמפרטורת החיה ולספק בקרת משוב לצלחת החימום על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה על 36 מעלות צלזיוס במהלך הניתוח. לאחר מכן מרחו משחה עיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, יש למרוח תמיסת Betadine על החלק העליון של ראש העכבר.

לאחר שווידאתם שהעכבר מחוסר הכרה על ידי צביטה בבוהן, השתמשו באזמל סטרילי כדי לבצע חתך של 0.75 סנטימטר לאורך הקרקפת האמצעית המשתרע מגובה העיניים. ודא שה-BMA גלוי. לאחר מכן חבר את מחזיק המקדחה לפלטפורמת ההתגנבות.

לאחר מכן הנח מקדחה עם מקדח קוצים של 0.5 מילימטר במחזיק המקדחה ואבטח אותו במקומו. כעת הניחו את המקדחה בדיוק מעל הרמה. השתמש במקלון צמר גפן סטרילי כדי למשוך בעדינות את שולי החתך כדי להקל על הדמיית הגולגולת, הזיזו את קצה המקדחה למצב שני מילימטרים אחוריים ו-1.5 מילימטרים לרוחב ה-bgma בחצי המוח הימני, וקדחו לתוך גולגולת החיה כשמקדחת פורדהם חודרת רק את העצם.

לאחר מכן הסר את המקדחה מהפלטפורמה הסטריאוטקטית. לאחר מכן, חבר את משאבת מזרק מזרק הקרדית לפלטפורמה הסטריאוטקטית. הסר את התאים מהקרח ומערבל בעדינות את הבקבוקון המכיל את תאי הגידול בפולסים קצרים או העביר בעדינות את הבקבוקון כדי להשעות מחדש את התאים.

לאחר מכן משוך שבעה מיקרוליטר של מתלה התא דרך מחט משופעת שטוחה בגודל 30 אינץ' המחוברת למזרק של 10 מיקרוליטר. הימנע מבועות אוויר גדולות במזרק וודא שאין בועות אוויר בששת המיקרוליטרים הראשונים של הנוזל, שיהיו הנפח הכולל המוזרק לעכבר. מקם את המזרק הטעון לתוך מזרק המזרק.

השתמש בפד אלכוהול כדי להסיר כל נוזל השעיית התאים המופיע בקצה המחט על מנת למנוע זיהום של אתר החתך בתאים סרטניים, מה שעלול לגרום לגידול בחלל הגולגולת הנוסף. כעת הגדר את משאבת המזרק לספק 6.0 מיקרוליטר בקצב של 0.5 מיקרוליטר לדקה. המיקרוליטר היחיד של תרחיף התאים שנותר במזרק לאחר ההשתלה מבטיח שבועות האוויר שנאספות לעתים קרובות במזרק לא יוזרקו לתוך הזרקת בועות האוויר של בעלי החיים עלולה לגרום לתסחיף אוויר קטלני.

לאחר מכן, קדם את מחט המזרק לתוך חור הבור תוך שמירה על המחט בניצב לגולגולת. לאחר שהמחט חצתה את הגולגולת, אפס את הקואורדינטות בתצוגה הדיגיטלית הסטריאוטקטית. לאחר מכן מקדמים לאט את קצה המחט לאורך תקופה של ארבע דקות עד שהיא מגיעה לעומק של 2.5 מילימטרים.

עצרו שתי דקות ואז התחילו את השתלת התאים לאחר השלמת ההזרקה, השאירו את המחט במוח למשך כשתי דקות. לאחר מכן משוך לאט את המחט במשך תקופה של שלוש עד ארבע דקות. שחרר את מוטות האוזניים ואת ריסון החוטם.

לאחר מכן, הסר את העכבר מהמנגנון הסטריאוטקטי. סגור את חור הגולגולת בשעוות עצם סטרילית על ידי שפשוף קדימה ואחורה על פני חור הבור. המשיכו למרוח את שעוות העצם עד שהחור אטום לחלוטין וחור הבור האטום צמוד לגולגולת הסמוכה.

לאחר מכן, יש למרוח דבק רקמות וטרינרי כדי לאטום את הפצע ולהעריך מחדש את שולי החתך בעזרת צמר גפן סטרילי ולוודא שעיני החיה אינן חשופות לדבק כלשהו. לבסוף, הניחו את העכבר על כרית חימום המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס עד שהחיה תחזור להכרה. העבירו את החיה בחזרה לכלוב המקורי שלה.

ברגע שהעכבר ערני ומגיב בזמן שהעכבר מורדם, מוזרק תת עורי או תוך צפקי 60 מיקרוליטר של מלח אשלגן D לוציפר, שדולל ב-PBS לריכוז של 50 מיליגרם למיליליטר. הפעל את זרימת ההרדמה לקונוסים של האף בסורק ההדמיה הביו-לומינסנצינטי, והעבר במהירות את העכברים לסורק. מניחים את חוטמם בקונוסים של האף.

מקם את המפרידים השחורים בין העכברים כדי להגביל את יכולתו של גידול גדול עם עוצמת אות גבוהה להגדיל באופן מלאכותי את עוצמת האות הנמדדת של גידול סמוך עם אות נמוך בהרבה. לבסוף, באמצעות תוכנת התמונה החיה, צלם חשיפות סדרתיות תכופות כל אחת מתחת לחמש דקות למשך זמן כולל של עד 30 דקות לאחר זמן הזרקת לוציפר. מוצגת כאן תוצאה של השתלה סטריאוטקטית מוצלחת של תאי גליובלסטומה מולטיפורמה במוח העכבר.

סריקת MRI מוח משוקללת T שבוצעה עם מגנט 9.4 21 יום לאחר ההשתלה מגלה מוקד יחיד של גידול בהמיספרה הימנית בגודל 19 מילימטר מעוקב המתמקם בקואורדינטות המדויקות של אתר ההשתלה. המוח הנורמלי שמסביב מעוצב כאן באפור, 10 עכברים עם גידולי גליובלסטומה מולטיפורמה שהושתלו באופן סטריאוטקטי טופלו בטיפול בקרינה חיצונית ל-16 אפורים בארבעה שברים או ללא טיפול. הדמיה ביו-לומינסנציה מראה כי טיפול בקרינה מעכב את התפשטות הגידולים המושתלים, וכתוצאה מכך אין עלייה באות הביו-לומינסנציה שזוהה, בעוד שהאות גדל באופן משמעותי בגידולי בקרה מדומים עקב התפשטות בלתי מבוקרת של תאי הסרטן לאחר השליטה.

ניתן להשלים טכניקה זו תוך כ-25 דקות לכל עכבר באמצעות אותה אצווה של תאים תוך כדי ניסיון הליך זה. חשוב לוודא שבעלי החיים מורדמים כראוי ללא תגובה לצביטה חזקה בבוהן לפני תחילת הניתוח. יחד עם זאת, יש להקפיד לא להרדים יתר על המידה את בעלי החיים.

כמו מניסיוננו, נראה כי רוב מקרי המוות סביב הניתוח קשורים לדיכוי נשימתי הנגרם על ידי הרדמה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע השתלה סטריאוטקטית מדויקת של תאים סרטניים במוחם של עכברים עירומים, וכיצד לבצע הדמיה ביולוגית סדרתית in vivo כדי לנטר את הצמיחה בתגובה לטיפול בגידול התוך גולגולתי שנוצר. קסנוגרפטים.