כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית
10 באוגוסט 2012
שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה ב ג elegans, המאפשר מאות סינפסות להתאפיין במהירות ללא עיוותים הציג תחזית Z-המטוס בתוך מדגם אחד.
מטרת פרוצדורה זו היא לכמת ביעילות את הממדים והבהירות של אותים פלואורסצנטיים נקודתיים בגרנונים. כך ניתן לנתח אוכלוסיות גדולות של עצמים. מבחינה סטטיסטית, מדובר בדימוג של חלבונים סינפטיים.
בהדגמה זו, השלב הראשון של הפרוצדורה הוא יצירת תרביות מסונכרנות בצפיפות גבוהה של ה-ELEGANS הרלוונטיים. לאחר מכן, השג תמונות קונפוקאליות של הסינפסות המסומנות תוך מזעור השונות האישית בין התמונות. נקודות סינפטיות מזוהות באופן אוטומטי ומופרדות מהפלואורסצנציית הרקע.
השלב הסופי הוא טבלאי וארגון הנתונים לצורך ניתוח יעיל בהמשך. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות במדויק כיצד תנאים ניסיוניים משפיעים על התהלוכות של חלבונים סינפטיים או כל חלבון אחר הממוקם בנקודות בעלות ניגודיות גבוהה (high contrast puncture). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח של היטל זק (Zack projections), הוא שכל הנתונים נשמרים, כולל נפחי הסינפסות, וזיהוי אוטומטי מאפשר איסוף מהיר של מאות דגימות לכל תנאי שנבדק.
פרוטוקול זה דורש תרביות בצפיפות גבוהה של תולעי C. elegans בוגרות, שגודלו בצלחות אגר NGM עם פפטיד גבוה בעומק של 10 סנטימטרים על חיידקי E. coli NA 22. הכינו בדיוק צלחת אחת עבור כל צביעה אימונולוגית מתוכננת. התחילו באיסוף התולעים בעזרת מספר מיליליטרים של מים. העבירו אותן לשפופרת קונית של 15 מיליליטר וחזרו על תהליך זה עד שרוב התולעים נאספו.
שקעו את התולעים באמצעות צנטריפוגה ושטפו את המשקע במים עד שלוש פעמים, עד שהנוזל העליון יהיה צלול. פעולה זו מסירה שאריות של בטריום. העבירו תמיד תמיסות העשויות להכיל תולעים או ביצים באמצעות פיפטות פלסטיק, שכן הן עלולות להידבק לזכוכית. בשלב זה, קריטי לפעול במהירות בשלבי ההמשך כדי למנוע פגיעה בחיוניות הביצים.
שחררו את ביצי התולעים על ידי השריה של חמישה מיליליטר של תמיסת היפוכ לוריט בסיסית. נערו את המבחנות בעדינות ובדקו אותן תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בערך פעם בדקה. לאחר חמש דקות, או ברגע שכשמעד מחצית מהתולעים במבחנה נראות כשוות או שבורות.
מלאו את המבחנה עד למעלה בבופר ביצים (egg buffer) והפכו אותה מספר פעמים. לאחר שיקוע התולעים, שאבו והשליכו את העל-נוזל (supernatant). לאחר מכן, שטפו את המשקע שלוש פעמים עם בופר ביצים.
לאחר השטיפות, ריס תלה את המשקע בחמישה מיליליטר של מים, ולאחר מכן הוסיף חמישה מיליליטר של תמיסת סוכרוז סטרילית בריכוז 60% במים וערבב היטב. לאחר סבב הצנטריפוגה של התמיסה, הביצים יימצאו בקו המניסקוס וייראו עכורות.
העבירו כל אוסף ביצים לפלטת NGM Agar נקייה (ללא זריעה) בקוטר 10 סנטימטרים. ניתן להשתמש במים כדי לשטוף את ה-X אל הפלטה, אך השתדלו למזער את כמות הנוזלים המועברת. דגרו את הפלטות למשך לילה בטמפרטורה של 20 °C במהלך השעות הראשונות. מאווררו את הפלטות על ידי השארת המכסים פתוחים מעט, אך הקפידו לכסות אותן במהלך הלילה.
לאחר הבקיעה, העבירו את הלרוות משלב L1 למבחנה קונית של 15 מיליליטר הממולאת ב-S basil. השקיעו את ה-L1 והשעיו אותם מחדש בנפח מינימלי של S basil. לאחר מכן, חלקו כל אוסף של L1 לשתי צלחות אגר NGM בקוטר 10 סנטימטרים הזרועות בחיידקי NA 22.
יש לעקוב אחר התרביות פעם או פעמיים ביום. אם הן נמצאות בסכנת הרעבה, העבירו אותן לצלחות NA 22 טריות לפני תחילת ההרעבה, שכן בשלב זה הן נוטות להיווצר כשתי קווי איסוף מסוג N ולהתקדם יחדיו כגל הרחק מאזורים דלים במזון בצלחות אלו; המזון ידולל לחלוטין בתוך מספר שעות.
כאשר התולעים מגיעות לגיל הרצוי, הן מוכנות לצביעה אימונו-היסטוכימית או לדימיג חי לצורך קיבוע התולעים. עבור דימיג קונפוקאלי, השתמשו במדיום קיבוע Antifa כדי להתאים את צפיפותן למאות בודדות של תולעים למיקרוליטר.
עם הניסיון, ניתן יהיה לזהות צפיפות זו על פי עכירות התמיהה. באופן אידיאלי, התולעים יהיו דחוסות על זכוכית המיקרוסקופ, אך לא בחפיפה מרובה. על גבי הזכוכית, הכינו רפידה של 2%aros ב-ESP basil המוקפת בטבעת דקה של וסלין.
כדי למנוע אידוי במהלך הדמיה, יש למרוח את הוזלין באמצעות מזרק של שלושה מיליליטרים המצויד במחט 25 gauge קטועה. כעת, העבירו באמצעות פיפטה מספר מיקרוליטרים של תרחיף התולעים על לביד כיסוי, תוך שימוש בקצה פיפטה קטוע כדי למנוע גזירה של התולעים, והניחו את פדית האגרוז על לביד הכיסוי, תוך פיזור אחיד של התולעים על פני הפדיה תחת המיקרוסקופ. יש להכווין את הסינפסים הרלוונטיים כך שיפנו ישירות לעדשה או בטווח של עד 45 מעלות ממנה בלבד.
הקדישו לכך מספר שניות כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching). התרבית והתנאים אמורים לספק מספיק תולעים כדי לעמוד בקריטריון מחמיר זה, המוצג כאן כמיקום אידיאלי שבו השרוך הבטני (ventral cord) מופנה ישירות לעבר עדשת העדשה. הדגימה הבאה תידחה כיוון שהשרוך הבטני מופנה ישירות הרחק מעדשת העדשה.
שימו לב כי בפרט זה, שבו השרוך הגבי (dorsal cord) מכוון לעבר העדשה, מתקבלת תמונה ממוקדת וחדה יותר. הנה דוגמה נוספת שנדחית, מכיוון שהשרוכים הגבי והבטני מכוונים לקצוות התולעת. במקרה זה, אור העירור והפליטה חייבים לעבור דרך יותר רקמת תולעת ועל כן יעוותו.
האתגר המרכזי הוא למזער את השונות בתוך קבוצות הטיפול; סנכרון הגילים ובחירת תולעים שבהן המבנה המבוקש מכוון ישירות לעבר העדשה האובייקטיבית יכולים לסייע רבות. התחלה עם תרביות גדולות מגדילה את אפשרויות הבחירה בתולעים לצורך השגת עקביות מרבית. לקבלת תוצאות הדמיה מיטביות, יש לבחור דגימות שטוחות יחסית שניתן להכתיבן בתוך ערימה של 14 תמונות או פחות.
חתכים בעובי 0.4 micron. תמונות במהירות גבוהה וברזולוציה נמוכה מספיקות לאיסוף נתונים מהיר ומדויק. הימנעו מרוויית הגלאה עם עוצמות אות גבוהות מדי, שכן הדבר יוביל להערכה חסרה של אותות הפלואורסצנציה.
הדגמה זו משתמשת בחבילת התוכנה המסחרית velocity, שחובה שגרסתה תהיה לפחות 4.0. אפשרויות תוכנה חלופיות רבות מאבדות מידע תלת-ממדי. לאחר פתיחת קבצי הפלט מסוג multi tiff מהמיקרוסקופ הקונפוקאלי, בחרו ב-image, לאחר מכן ב-extended focus, ואז ב-freehand.
כעת הגדירו ROI (אזור עניין) כדי לחתוך חלקים מהתמונה שאינם מכילים את המבנה המבוקש. באמצעות הכלי הפעיל, אפשרות המיקוד המורחב (extended focus) מספקת השלכה של מישור Z כדי להקל על בחירת ה-ROI. פעולה זו אינה משפיעה על הנתונים הבסיסיים.
באופן דומה, התאמות של בהירות וניגודיות אינן משפיעות על הנתונים הבסיסיים. השלימו את החיתוך על ידי בחירה ב-actions ולאחר מכן ב-crop to selection. לאחר מכן, מדדו את אורך האזור שנותח.
בעזרת כלי הקו, אורך הקו יחושב ויתווסף לטבלת הנתונים. כעת, זהו אובייקטים באמצעות מסנן אובייקטים לפי עוצמה (objects by intensity filter) במצב מדידות. הכללה של סמן סינפטי עצמאי המסומן בצבע ייחודי עשויה לסייע בזיהוי חד-משמעי של סינפסות; הגדירו סף כך שצבירים סינפטיים יודגשו, בעוד שרקע שאינו סינפטי לא יודגש.
בצעו זאת פעם אחת בלבד באמצעות דגימת בקרה והשתמשו בה עבור כל הדגימות הבאות; ביצוע סף (thresholding) לכל דגימה בנפרד אינו מקובל כיוון שהוא יוצר פוטנציאל להטיה של הנסיין. האובייקטים נבחרים ומטבלים באופן אוטומטי. סינפסות טיפוסיות נעות בין מספר בודד לכמה מאות voxels. לפני ייצוא הנתונים, מיינו את הנתונים לפי גודל האובייקט.
פעולה זו מקלה על הסרה מאוחרת של אובייקטים המורכבים משני ווקסלים או פחות, אשר בדרך כלל הם רק נקודות רקע. כעת, ייצאו את הנתונים בפורמט CSV, שניתן לפתוח בכל תוכנת גיליון אלקטרוני. כל תמונה מייצרת קובץ פלט אחד לצורך מיון וייצוא של מיקרוגרפים של חבל העצבים הגבי של CL gans, המראים כי 49 קולטני GABA הופקו באמצעות הפרוטוקול המתואר.
כל בעלי החיים נראו דומים מאוד בגודלם ובבשלותם. ערכי הפלואורסצנציה הסינפטית הכוללים עבור חמישה תולעים נורמלו לפי אורך חבל העצבים שנותח. נתונים אלה הראו ערכי טעות סטנדרטית של כ-10% מהממוצע.
התמונה משמאל היא תמונה גולמית ללא סף (threshold) וללא הסרת רעשי רקע. הסינפסות טופלו ב-mus carmal, אגוניסט של קולטני GABA הגורם לוואד-רגולציה (downregulation) של הקולטנים לאחר חשיפה ממושכת. הפלואורסצנציה הכוללת נמדדה וכוונתה להיסתברות מצטברת של אורך חוט העצבים.
חושבו היסטוגרמות של תכולת הפלואורסצנציה של סינפסות בודדות. באופן דומה חושב נפח הסינפסה. מדידות אלו מראות כי חשיפה לאגוניסט מפחיתה באופן משמעותי את התוכן והנפח הסינפטי.
באופן כללי, תוצאות כמותיות צריכות תמיד לשקף את מה שניתן להעריך באופן חזותי. אם לא, בדיקה של התמונות והאובייקטים שזוהו על פי המהירות צריכה לחשוף היכן התרחאה השגיאה ולהציע פעולה מתקנת, כגון קביעת סף (thresholding) או הסרה של ארטיפקטים במהלך ביצוע הליך זה. קריטי לבחור תולעים לצילום בהתבסס על האוריינטציה הגאומטרית שלהן ולא על סמך הערכה סובייקטיבית של איכות התמונה; במידת האפשר, מומלץ מאוד לבצע דירוג עיוור (blind scoring).
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטה זו מכמתת קולטנים של מוליכים עצביים המסומנים פלואורסצנטית בתלת-ממד ברזולוציית סינפסה בודדת ב-C. elegans. היא מאפשרת אפיון מהיר של מאות סינפסות בתוך דגימה אחת, תוך מזעור עיוותים הנובעים מהקרנת מישור z.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- קולטני מוליכים עצביים ממלאים תפקיד מכריע בעוצמה הסינפטית.
- הבנה של התפלגות הקולטנים יכולה לספק תובנות לגבי התפקוד הסינפטי.
- סימון פלואורסצנטי מאפשר דימות מפורט של סינפסות.
- C. elegans משמש כאורגניזם מודל לחקר מנגנונים סינפטיים.
מטרת המחקר
- לכימות יעילה של הממדים והבהירות של אותות פלואורסצנציה בסינפסות.
- לניתוח של אוכלוסיות גדולות של חלבונים סינפטיים.
- למזעור השונות בתוצאות הדימוי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפקת תרביות מסונכרנות בצפיפות גבוהה של C. elegans.
- קבלת תמונות קונפוקאליות של סינפסים מסומנים.
- זיהוי אוטומטי של נקודות סינפטיות (puncta) מתוך פלואורסצנציית רקע.
- כימות שפע הרצפטורים בסינפסים בודדים.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של חלבוני סינפסה עם שונות מינימלית.
- כימות של מקבצי קולטני מוליכים עצביים בסינפסות.
- אפיון של מאות סינפסות בדגימה בודדת.
- תובנות לגבי הקשר בין שפע הקולטנים לבין חוזק סינפטי.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה הסינפטית.
- ניתוח כמותי יכול להעמיק את ההבנה של מנגנונים סינפטיים.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בגישה זו למגוון של בדיקות סינפטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות שפע של רצפטורים סינפטיים ב-C. elegans מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות בתהליך גילוי תרופות למדעי העצב, על ידי אספקת נתונים בעלי תוכן גבוה וביסוס סטטיסטי על מיקום חלבונים פוסט-סינפטיים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מובילים (leads) באמצעות קישור דינמיקת הרצפטורים לחוזק סינפטי תפקודי, ובכך מסייעת בתעדוף תיקי פיתוח של תרופות המכוונות למערכת העצבים המרכזית (CNS). יכולת ההרחבה והשחזור של השיטה מקלה על שימוש חוזר ברמה הארגונית על פני תהליכי ביולוגיה של גילוי ועבודה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של קיבץ קולטנים (receptor clustering) בסינפסים, מה שמבהיר את מעורבות המסלול ומסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות ניתוח אוטומטי ובעובי רב של נקודות סינפטיות (synaptic puncta), ובכך מפחית שונות במבחנים מכניסטיים.
- ערך ניבוי: מייצר נתונים כמותיים של פלואורסצנציה ונפח לכל סינפסה, דבר המשפר את ביטחון הניבוי במודולציה של המטרה ובתיעדוף של פורטפוליו הפיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקות המשך על ידי סטנדרטיזציה של כימות חלבונים סינפטיים באוכלוסיות סינפסות גדולות.
- שחזוריות: מבטיחה סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות זיהוי תלת-ממדי אוטומטי של סינפסות, תוך מזעור ארטיפקטים של z-projection ומאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות.
- יכולת הרחבה: מעבד מאות עד אלפי סינפסות לדגימה, ובכך תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה ובמסעות סריקה בעלי תוכן גבוה (high-content screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על התאמה למערכות רלוונטיות למחלה על ידי כימות חלבונים סינפטיים הממוקמים באופן טבעי ב-C. elegans שלם, ובכך תומכת בהתאמה של סמנים ביולוגיים.
- הפחתת סיכונים פרה-קלינית: מקשרת בין דינמיקת קולטנים בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני, באמצעות אפיון שינויים בתוכן ובנפח הסינפטי המושרים על ידי אגוניסטים.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת תמיכה להחלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) באמצעות נתונים בעלי עוצמה סטטיסטית על התפלגות חלבונים סינפטיים תחת תנאים ניסיוניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משלבת שלבים לאורך רצף הגילוי, ותומכת בבדיקת היפותזות בשלבי הגילוי המוקדמים, במוכנות של בדיקות (assays) בשלבי הסריקה, ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבים הפרה-קליניים, וזאת באמצעות אספקת נתונים סינפטיים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כימות שכיחות ומיקום של רצפטורים ברזולוציה של סינפסה בודדת.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות באמצעות זיהוי אוטומטי ו可שחזור של נקודות סינפטיות (puncta), מה שמבטיח פלטים כמותיים עבור סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות של עוצמת פלואורסצנציה, נפח וסך הפלואורסצנציה לכל סינפסה, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית של תנאים וסטנדרטיזציה של התוצאות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי אפיון שינויים סינפטיים באורגניזמים שלמים, ובכך תומך בהתאמה של סממנים ביולוגים (biomarkers) ובתיקוף מערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת הניתנת לשימוש חוזר לכימות של כל אות פלואורסצנציה נקודתי, הניתנת להתאמה למערכות מודל ולסוגי מטרות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות ניתוח כמותי של חלבוני סינפסה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות זיהוי אוטומטי של סינפסות בתלת-ממד וטבלאי נתונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go), יעילות הון ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לתעדוף מטרות מבוסס נתונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות מערכי נתונים סינפטיים רחבי היקף וחסונים סטטיסטית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתוח תמונות וטיפול ב-C. elegans להכנת תרביות מסונכרנות.
- תלוי בציוד המסוגל לביצוע הדמיה קונפוקלית רב-מישורית ובתוכנה התומכת בזיהוי אובייקטים בתלת-ממד (למשל, Velocity ≥4.0).
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי אוריינטציית התולעים, סנכרון גיל ופרמטרי הדמיה, כדי למזער שונות בין בעלי חיים.
- נדרש לשקול התאמות בעת יישום על מערכות שאינן C. elegans או על נקודות (puncta) שאינן סינפטיות, במיוחד בנוגע לקביעת סף (thresholding) ובחירת אזורי עניין (ROI).
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך להימנע מרוויה של הגלאים ולהבטיח אוריינטציה נכונה של התולעים לשמירה על נאמנות האות, כפי שמוסבר בחומרי המקור.
