בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להרכיב קומפלקס איתות מקרו-מולקולרי של ה regulator של הולכה ממברנלית בפיברוסיס קיסטית, או CFTR, התלוי ב-PDZ. כדי לבצע זאת in vitro, חלבוני היתוך רקומביננטיים מסומנים מובעים בחיידקים ומטוהרים. לאחר מכן, מתקבלים ליזטים של תאים מתרביות המבטאות CFTR או חלבונים נקשרי CFTR.

לאחר מכן, ה-CFTR והחלבונים המקשרים משולבים in vitro להרכבת הקומפלקס הסיגנלי המקרו-מולקולרי המכיל CFTR. לאחר מכן מבוצע Western blotting, המדגים היווצרות של קומפלקסים מקרו-מולקולריים של CFTR, ואשר מוערך באמצעות Western blotting. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא היכולת לזהות ולהדמיא באופן ישיר את ההיווצרות של קומפלקס מקרו-מולקולרי בודד עתיר חלבון המכיל CFTR.

לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי היווצרות של קומפלקס מקרו-מולקולרי המכיל CT R. ניתן להשתמש בה גם להרכבה של קומפלקסים שאינם חלבוניים שאינם מעורבים ב-CFTR, כגון קומפלקס סיגנלינג מקרו-מולקולרי של sex C two. לאחרונה, באמצעות אותה שיטה, הדגמנו כי הקולטן הכימי CXCR two יצרה פיזית קומפלקס חלבונים עם האפקטור במורד המסלול.

ביצוע PCR כדי לבדוק אם PRC beta 3 מתווך את wild nerve 1 בנייטרופילים. הגבירו את ה-DNA המקודד עבור 50 עד 100 החומצות האמינו האחרונות המכילות את מוטיבי ה-PDZ בקצה ה-C. עבור נשא ה-CAMP, MRP 4 והדומיין PDZ 1 של גורם הבקרה של מחליף נתרן-מימן, או N-H-E-R-F.

בשלב הבא, שבטו את תוצרי ה-PCR של RP4 לתוך pGEX-4T1 ליצירת חלבוניהם של GST fusion, ואת דומיין PDZ1 של NHERF לתוך pET-30. כדי לייצר חלבוני His-tag fusion, בצעו טרנספורמציה של החיידקים באמצעות הלם תרמי. גדלו את התרבית במצע SOC, בבטן של שבט E. coli חסר פרוטאז, למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C בתוך אינקובטור שוקשוק, ב-50 milliliters של מצע LB המכיל אנטיביוטיקה המתאימה לווקטור.

ביום למחרת, דללו את התרבית ביחס של 1:10 ב-500 מיליליטר של מצע Luria berti, ולאחר מכן דגרו את התרבית שוב בניעור בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שעתיים, השרה את השעתוק של החלבון הרקומיננטי באמצעות 0.5 עד 1 מילימולר IPTG למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 30 °C.

לאחר הדגירה, העבירו את התרביות למבחנות צנטריפוגה של 250 milliliter ושקעו את התאים באמצעות צנטריפוגציה ב-8,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. לאחר הסבוב, השליכו את הנוזל העליון והוסיפו 20 milliliters של בופר סוכרוז המכיל ליזוזים בריכוז מיליגרם אחד למיליליטר, 0.2% Triton X 100 ומעכבי פרוטאז כדי ל lysed את התאים, והעבירו את התרחיף הבקטריאלי למבחנת צנטריפוגה נקייה של 50 milliliter.

ערבבו במערבל סיבובי (rotary shaker) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הצנטריפוגה, הנוזל העליון (supernatant) יהיה צלול ומשקע (pellet) בלתי ממיס של app ייווצר בתחתית המבחנה.

אספו את העל-נוזל (supernatant) הצלול לשפופרת קונית חדשה של 50 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו לעל-נוזל מיליליטר אחד של שרף מתאים. Aero beads תלוייים כסלרי (slurry) של 50% בבופר סוכרוז גלוטתיון.

יש להשתמש בخرזי Aero עבור חלבוני GST fusion ובخرזי talon עבור חלבוני His S fusion. ערבבו במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 4 °C על שייקר סיבובי. לאחר מכן, סובבו את החרזים ב-800 ×g למשך שתי דקות.

לאחר מכן, שטפו אותם על ידי ריסוס, על ידי תליה ב-15 milliliters של PBS וערבוב ברוטטור למשך שתי דקות. לבסוף, השליכו את העלייה. חזרו על השלב שש פעמים לאחר השטיפה השישית.

כדי לאלוט את החלבון מהחרוזים, יש להוסיף שני מיליליטר של בופר אלוציה מתאים לכל מיליליטר אחד של חרוזים ולערבב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שפכו את כל החלבון שנאלוט יחד עם החרוזים לתוך עמודה ואספו את השבב (flow through) כחלבון שנאלוט. לאחר מכן, העבירו את חלבון ה-UD לשקית דיאליזה.

בצעו דיאליזה לחלבונים שנסחפו מול שני ליטרים של PBS תוך כדי ערבוב בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. החליפו את ה-PBS בכל ארבע שעות, ארבע פעמים לאחר תחילת הדיאליזה. רכזו את החלבון לנפח של 0.5 עד מיליליטר אחד.

השתמשו במסנן Cent Con עם סף חיתוך של 10,000 megawatt. חלקו את הדגימה למכסאות של 200 µL כל אחת. שמרו מכסה אחת לצורך ניתוח והניחו את השאר בטמפרטורה של 80°C- לאחסון.

קבע את ריכוז החלבון בשיטת בראדפורד (Bradford Method). העरक את איכות החלבון באמצעות SDS-PAGE תוך שימוש בסטנדרטים של BSAS. אם תקינות החלבון אינה מספקת, ניתן להשתמש בהליכי טהרה משניים כגון סינון ג'ל או חילוף יונים.

יש לגדל תאי HEK 2 93 המבטאים flag CFTR מסוג בר (wild type) כפי שמתואר במסמך המצורף. יש להסיר את המצע מהתאים ולשטוף ב-PBS. לאחר מכן, כדי לליית את התאיים, יש להוסיף 500 microliters של lysis buffer לכל צלחת תרבית של 60 millimeter ולנער את ליסאטי התאים במשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.

העבירו את הליזאטים למבחנות מיקרו-צנטריפוזה חדשות. לאחר מכן, כדי להסיר חלבונים בלתי מסיסים, צנטריפוגו ב-16,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C ואספו את הסופרנטנטים. קבעו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת Bradford כדי להרכיב במבחנה (in vitro) קומפלקסים מקרו-מולקולריים המכילים CFTR.

התחילו בשילוב של 20 µg של חלבון חילוץ (fusion protein) מופלט של G-S-T-M-R-P four C terminal המכיל 50 חומצות אמינו, וכמויות עולות שנעות בין 0 ל-40 µg של חלבון חילוץ מופלט של hiss S PD zk one, בתוך 200 µL של באפר ליזיס (lysis buffer) במבחורת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL. ערבבו את שני החלבונים במיקסר סיבובי בטמפרטורה של 22 °C למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של תרחף (slurry) בריכוז של 50% של חרוזי גלוטתיון לתערובת החלבונים והמשיכו לערבב למשך שעה נוספת.

שלב זה מכונה גם קישור בזוגות (pairwise binding), שבו G-S-T-M-R-P four CT 50 נקשר ל-SPD zk one. במהלך זמן זה, הכין את ליזאטים של תאי HEK 2 93 המבטאים באופן יתר (over express) את flag CFTR מסוג wild type, כפי שמתואר בחלק הקודם של הסרטון, לאחר שלב הקישור בזוגות. שטוף את הקומפלקס פעמיים עם lysis buffer בתספיגציה של 800 ×g למשך דקה אחת בכל שטיפה, ושאב בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) לאחר כל שטיפה.

היזהרו לא לשאוב את החרוזיים מהתחתית. הוסיפו את ליסאטי התאים של HT K 2 93 לחרוזיים וערבבו בעדינות במערבל סיבובי בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות או למשך הלילה לאחר האינקובציה. שטפו את החרוזיים שלוש פעמים עם בופר ליזיס, תוך ביצוע סנטריפוגה לאחר כל שטיפה כפי שנעשה קודם, וגם לאחר השטיפה האחרונה.

כדי להפיל (elute) את החלבונים, הוסיפו 30 µL של sample buffer בריכוז פי חמישה והדגירו במקבץ מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, סבבו ב-5,000 ×g למשך דקה אחת כדי להשקיע את החרוזים. בשלב הבא, העמיסו את כל התסננת (eluate) על ג'ל SDS-PAGE בריכוז של 4 עד 15% והריצו במתח של 200 V עד לסוף הג'ל. עם סיום ההרצה, העבירו את פסי החלבון לממברנת PVDF למשך 1.5 שעות במתח של 60 V באמצעות מכשיר העברה של BioRad.

לאחר השלמת ההעברה, חסמו את הממברנה ב-TBS tween המכיל 5% חלב דל שומן למשך שעה אחת. המשיכו בביצוע western blotting כפי שמתואר במסמך המצורף כדי להמחיש חלבונים המקשרים ל-CFTR. קומפלקס איתות מקרו-מולקולרי המכיל A-C-F-T-R הורכב in vitro כפי שמתואר בסרטון זה וכפי שמוצג בייצוג הגרפי זה.

קומפלקס מקרו-מולקולרי שנוצר בין 50 חומצות האמינו בקצה ה-C של Mr.RRP four PD zk one לבין CFTR באורך מלא, כדי לקבוע את התלות במינון של היווצרות הקומפלקס המקרו-מולקולרי. הוספו כמויות גדלות של החלבון המתווך PD ZK one כפי שמוצג כאן. הקומפלקס גדל בצורה תלוית-מינון, מה שמעיד על כך שהחלבון המתווך PD ZK one תיווך את האינטראקציה בין CCF TR לבין Mr.Rrp four.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לא להרתיח את דגימות קומפלקס המולקולות המיקרוסקופיות של FTR שהוכנו ל-western blotting, שכן אגרגציה של FTR היא בעיה נפוצה. במקום זאת, יש לחמם את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 15 דקות לפני העמסתן לג'ל לפי פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון co-immunoprecipitation, כדי להעריך את קומפלקסי CFTR האנדוגניים בתאים כגון תאי אפיתל של דרכי הנשימה ותאי אפיתל של המעי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ההרכבה in vitro של קומפלקס איתות מקרו-מולקולרי CFDR התלוי ב-PTC.