NADH Fluorescence הדמיה של Biventricular מבודדת עבודה לבבות ארנב
24 ביולי 2012
המטרה היא לפקח על המדינה חמזור המיטוכונדריה של לבבות בודדים בהקשר של preload פיזיולוגי ולחצים afterload. הלב biventricular לעבוד במודל ארנבת מוצג. רזולוציה גבוהה spatiotemporal הקרינה הדמיה של NADH משמש כדי לפקח על מצב חמזור המיטוכונדריה של הרקמה epicardial.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את חילוף החומרים. באמצעות הדמיית NADH בתכשיר לב עובד, זה מושג על ידי בידוד לב הארנב תחילה. השלב השני של ההליך הוא לשרוף בהצלחה את כל ארבעת חדרי הלב כדי להשיג מודל לב עובד.
השלב האחרון הוא הקמת ציוד הדמיה ואיסוף נתוני NADH בקצבי קצב שונים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שינויים מטבוליים של הלב באמצעות הדמיה של NADH פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שפע רטרו לנור, הוא שהלב פועל במצבו הפיזיולוגי עם זרימה בכיוון הרגיל וכאשר הלב מספק לחץ משלו לזלוף כלילי.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באלקטרופיזיולוגיה ובמנגנונים של הפרעות קצב קטלניות. זה נעשה על ידי מתן מודל פיזיולוגי לחקר הקשר בין חילוף חומרים של זרימה כלילית לפעילות חשמלית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הקנולציה של כלי הדם וחדרי הלב.
טכניקה לא נכונה עלולה לפגוע בלב ולסכן את שאר הניסוי. לפני ביצוע ניסוי, שטפו את כל הצינורות בתאים של מערכת הלב העובדת במים מטוהרים, ולאחר מכן טהרו את המים מהמערכת על ידי הפעלת המשאבות. הוסף מסנני ממברנת תאית בהתאם למשאבת הזלוף LOR, משאבת הזלוף של הלב השמאלי ומשאבת הזלוף של הלב הימני.
לאחר הוספת פרפיוז שמונה למערכת, בצע כיול של שתי נקודות עבור כל חיישן לחץ. הפעל את אמבט המים המסתובב המחומם המחמם את הצינורות המעוטפים במים ואת מחליפי החום הפעל את אמבט המים. משמש לחימום ה-PERFUSE שמונה.
הפעל את המשאבות שמזרימות את ה-PERFUSE 8 בלולאה סגורה, הפעל את מיכל המחזור כדי לחמצן את ה-Perfuse. שמונה, ודא שמחמצן המיקרופייבר או מסנני ההמו מספקים 95% חמצן לשמונה ב-80 קילופסקל. לבסוף, ודא שמחליפי החום שומרים על טמפרטורת החדירה במחזור.
שמונה ב-37 מעלות צלזיוס, התחל את כריתת הלב על ידי הגדרת מערכת הלב הפועלת לפעול בלחץ קבוע. מצב LRF. הגדר את הלחץ של גוש אבי העורקים בין 50 ל -60 לאחר הרדמת ארנב.
הזרקו פנטוברביטל והפרין לווריד האוזן השולי או לווריד הספנוס הצדדי בחלק הפנימי של הגפה האחורית. ברגע שלארנב חסר רפלקס כאב, פתח במהירות את חלל בית החזה. פורסים את קרום הלב, מהדקים את אבי העורקים וכורתים את הלב והריאות.
הריאות נשמרות מחוברות כדי להקל על בידוד ורידי הריאה. לאחר מכן, מלאו מזרק ב -60 מיליליטר לכל F שמונה ו -200 יחידות הפרין. חבר צינורית של חמישה מילימטר וקנה את אבי העורקים.
אבטח את אבי העורקים לצינורית בעזרת תפרי משי בגודל אפס. לאחר מכן לחץ לאט על המזרק כדי לשטוף את הדם דרך הלב. הגדר את מערכת הלב העובדת על ידי חיבור הלב תחילה לחסימת אבי העורקים.
התקרב למחבר בזווית אלכסונית ואפשר ל-Perfuse 8 לטפטף בעדינות מהמחבר לתוך הצינורית בזמן שהוא מחובר. זה מונע כניסת אוויר לאבי העורקים, ובכך מונע תסחיפים כליליים בזמן שהלב מועשר בלחץ מתמיד. מצב L endorf.
הסר את השומן ורקמת החיבור ואתר את הכלים הבאים. וריד נבוב תחתון ועליון, וריד aose, עורק ריאתי וורידי ריאה. לאחר מכן, קשר את הווריד הנבוב העליון.
חותכים את עורק הריאה ממש מתחת למקום בו הוא מסתעף לעורקי הריאה הימניים והשמאליים. כלי הדם הנותרים הם ורידי הריאה. קבצו אותם בין הלב לריאות וקשרו את כולם באמצעות תפר אחד.
זה קריטי משתי סיבות. ראשית, קשירת כלי הדם המחוברים לריאות תבטיח שלא תהיה דליפה לאחר השלמת הקנולציה. ושנית, חשוב לבודד את שני קאווה ה-VNA שמתפרשים מאוחר יותר.
כעת הסר את הריאות. חותכים חור בגודל מתאים בפינת התוספתן הפרוזדורי השמאלי ומוודאים שהוא מלא בשפע שמונה. לאחר מכן, קנול את התוספתן בזמן שהצינורית מלאה לחלוטין ב-perfuse eight.
לאחר מכן, תוך כדי החזקת הרקמה, תפר את הצינורית לתוספתן. רקמת התוספתן הפרוזדורי השמאלי עדינה ביותר והיא עלולה להיקרע בקלות. לכן חשוב לשרוף את הפרוזדור השמאלי בניסיון הראשון, אחרת זה עלול להיות בלתי אפשרי.
הפעל את המשאבה מספר שתיים כדי לספק זרימה לאטריום השמאלי. הגדר את העומס המקדים בין שניים לשישה טורים לאורך הניסוי. ייתכן שיהיה צורך להתאים את הלחץ.
שמור אותו בטווח של שני מילימטרים מלחץ המטרה. כעת העבר את הלב למצב לב עובד על ידי כיבוי משאבה מספר אחת, משאבת הלנגור לרגע. הפחת את לחץ אבי העורקים כדי לנטות ל-tor ולאחר מכן הגדל אותו לאט לטווח של 80 עד 100 tor.
זה מאפשר למסתם אבי העורקים להיפתח ולתפקד כפי שהיה בתנאים פיזיולוגיים רגילים. הגדר את לחץ העומס הסופי לערך שהוא כ-20. קרע פחות משיא לחץ ה-LV באמצעות צינורית המחוברת ישירות למערכת.
יש לזרוק את הפרוזדור הימני דרך הווריד הנבוב התחתון CVA ולתפור את הצינורית לווריד. הימנע מהכנסת בועות אוויר. הפעל את המשאבה מספר שלוש, המשאבה הימנית כדי לספק זרימה לאטריום הימני.
הגדר את הלחץ לכשלושה טור. לבסוף, קנול החדר הימני מבלי לאפשר לאוויר להיכנס ולתפור את הצינורית לעורק הריאה. זה משלים את הקנולציה הדו-חדרית.
כעת המשך לרכישת אותות. הכנס בזהירות את צנתר מתמר הלחץ לתוך אבי העורקים דרך צינורית אבי העורקים. נווט אותו בעדינות מעבר לשסתום אבי העורקים ולתוך ה-lv.
אות לחץ ה-LV יופיע כצפוי כאשר קצה הצנתר ממוקם כהלכה. לאחר מכן, לחץ בעדינות על האלקטרודה הפוטנציאלית לפעולה מונופאזית כנגד האפיקרדיום החדר. חפץ תנועה קל באות האלקטרודה הוא נורמלי.
לאחר מכן, הניחו אלקטרודת גירוי דו קוטבית על האטריום הימני כדי לקצב את הלב בהתאם למיקום התכנון הניסיוני. ולמקד את מצלמת ה-CCD באזור העניין של הלב. צריך להיות מסנן פליטה מחובר למצלמה.
כדי לעבור את הקרינה של NADH כבה את אורות הסביבה כדי להאיר באופן אחיד את האפיקרדיום עם מקור אור UV בתחנת העבודה, אליו מחוברת המצלמה. להגדיר את התוכנה לרכוש תמונות בשני פריימים לשנייה. לאחר מכן בחר במצב עדכון חי כדי לנטר את עוצמת הפיקסלים הממוצעת באזור העניין.
אם השפע היה מספק, רמות ה-NADH המיוצגות על ידי הקרינה צריכות להיות נמוכות ויציבות על פני השטח האפיקרדיאלי. כעת, הפעל את הניסוי כשהוא יושלם. הסר את הלב.
רוקנו את ה-PERFUSE 8 ואת צינורות המערכת והתאים במים מטוהרים. שטפו מעת לעת את המערכת בתמיסת TM רירית או בתמיסת מי חמצן מדוללת באמצעות הפרוטוקול המתואר. הלבבות הודבקו באורכי מחזור בין 200 ל-400 פעימות לדקה.
LVP דיאסטולי היה בדרך כלל בין אפס ל-10 טור, לחץ אבי העורקים הדיאסטולי המינימלי היה כ-60 שיא Tor LVP סיסטולי תלוי בלחץ מילוי והתכווצות ובאופן אופטימלי צריך להיות בין 60 ל-80. הלחץ המרבי של אבי העורקים וה-LVP המקסימלי צריכים להתאים באופן הדוק לפעולה מונופאזית לפוטנציאלים האופייניים ללב של ארנב יש שלב דפולריזציה מהיר ושלב רפולריזציה אופייני. פוטנציאל הפעולה נרשם בקלות מההכנות, אך בדרך כלל היה לו חפץ תנועה קטן במהלך הדיאסטולה.
ערכי NADH פלואורסצנטיים ממוצעים מאזור עניין בתיבה האדומה נמדדו כדי לנטר שינויים במצב חמצון חיזור מיטוכונדריאלי במהלך שלושה מחזורי קצב באורכים פסיכולוגיים של 300, 200 ו-150 מילישניות כאשר קצב הקצב היה קרוב לקצב הסינוס. רמת ה-NADH הבסיסית הייתה קבועה יחסית ככל שאורך המחזור התקצר. מתחת ל-300 מילישניות רמות ה-NADH הבסיסיות עלו עם העלייה הגדולה ביותר ב-150 אלפיות השנייה, האות מתנודד עם התכווצות ותדירות התנודה תואמת את קצב הלב.
המשרעת של תנודות אלה הייתה תמיד קטנה מכל מגמות ארוכות יותר בקנה מידה שנגרמו על ידי איסכמיה או היפוקסיה. הדמיית NADH פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה של המשטח הקדמי המלא ב-200 פעימות לדקה הייתה קבועה והומוגנית מרחבית ב-400 פעימות לדקה. רמות NADH עלו באופן משמעותי לאורך האפיקרדיום.
הטרוגניות מרחבית משמעותית נצפתה כאשר העליות הגדולות ביותר התרחשו באזורי המחיצה של ה-RV וה-LV לאחר השליטה. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך פחות מ-45 דקות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור למנוע כניסת בועות אוויר לאבי העורקים או לאטריום השמאלי לאחר הליך זה.
ניתן להשתמש בשיטות נוספות כמו העמסת הלב בצבע רגיש למתח כדי לענות על שאלות נוספות כמו קישור הפעילות החשמלית והמטבולית על פני הלב במהלך תרחישים פתולוגיים כגון איסכמיה מקומית לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בפיזיולוגיה של הלב לחקור את חילוף החומרים של הלב והפרעות הולכה במהלך מצבים פתולוגיים באמצעות מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לניטור מצב החמצון-חיזור (redox) המיטוכונדריאלי בלבבי ארנב מבודדים תחת לחצי preload ו-afterload פיזיולוגיים. באמצעות דימוי פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה של NADH, חוקרים יכולים להבחין בשינויים מטבוליים בלב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פיזיולוגיה קרדיווסקולרית
- דימות מטבולי
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- המחקר מתמקד במטבוליזם של הלב.
- דימות NADH מספק תובנות לגבי תפקוד מיטוכונדריאלי.
- מודל לב פועל מאפשר תנאים פיזיולוגיים במהלך הניסוי.
- הטכניקה שואפת לתת מענה לשאלות הקשורות לזרימה כלילית ולפעילות חשמלית.
מטרת המחקר
- לניטור מצב החימצון-חיזור (redox) המיטוכונדריאלי של לבבות מבודדים.
- לביסוס מודל פיזיולוגי לחקר מטבוליזם של הלב.
- לבחינת הקשר בין זרימה כלילית לבין הפרעות קצב לב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד לב ארנב וקנולציה של חלליו.
- הקמת ציוד דימות לאיסוף נתוני NADH.
- שמירה על תנאים פיזיולוגיים במהלך פרפוזיה של הלב.
- שימוש בדימוי פלואורסצנציה להערכת שינויים מטבוליים.
תוצאות עיקריות
- ניטור מוצלח של מצב החמצון-חיזור המיטוכונדריאלי בזמן אמת.
- הדגמה של שינויים מטבוליים בקצבי קצב שונים.
- תיקוף של מודל הלב הפועל למחקרים פיזיולוגיים.
- תובנות לגבי הקשר בין המטבוליזם לפעילות חשמלית.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה אמינה לחקר חילוף החומרים בלב.
- היא משפרת את ההבנה של המצב הפיזיולוגי של הלב.
- הטכניקה יכולה לסייע בחקירת הפרעות קצב קטלניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
דימות פלואורסצנציה של NADH ברזולוציה גבוהה בלבבי ארנב פועלים דו-חדריים מאפשר הערכה כמותית וישירה של מצב החמצון-חיזור (redox) המיטוכונדריאלי תחת תנאי preload ו-afterload רלוונטיים פיזיולוגית. גישה זו מספקת ביטחון חזוי למחקרים מטבוליים ואלקטרופיזיולוגיים, ותומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בממשק שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני. השיטה משפרת את הרצף התרגומי עבור מסלולי מחקר של מטבוליזם לבבי והפרעות קצב.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה של מסלולים מטבוליים ותפקוד מיטוכונדריאלי במודל לב עם עומס פיזיולוגי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור המצב המטבולי לפלטים אלקטרופיזיולוגיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים עבור יעדים של מטבוליזם לבבי והפרעות קצב.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת מומחצת וניתנת לשחזור עבור דימוי כמותי של שינויים מטבוליים בתגובה לקצבי קוצביות מבוקרים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה למדידות רדוקס מיטוכונדריאליות.
- תומך בסריקת התערבויות המשפיעות על מטבוליזם לבבי בתנאים קרובים לפיזיולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פלטי דימות מטבולית לפתולוגיות לבביות רלוונטיות למחלה, כגון איסכמיה והיפוקסיה.
- שומרת על תפקוד לבבי פיזיולוגי, ובכך תומכת בפיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשרת קבלת החלטות על קידום מטרות מטבוליות ואלקטרופיזיולוגיות בהתאם לסיכון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני על ידי אספקת פלטפורמה חזקה לבדיקת השערות ולקבלת מדדים מטבוליים כמותיים במערכת לבבית רלוונטית פיזיולוגית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בחקירה מונחית-היפותזה של דינמיקה של חמצון-חיזור מיטוכונדריאלי במהלך עקה מטבולית או היפוקסית.
- סריקה: מספק פלטי פלואורסצנציה כמותיים וניתנים לשחזור של NADH לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה בזמן אמת של המצב המטבולי וההטרוגניות המרחבית ברקמת לב.
- מחקר תרגומי: מסייע בהמשכיות מגילוי in vitro ועד לאישור פרה-קליני במודלים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרי מטבוליזם ואלקטרופיזיולוגיה של הלב לאורך תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי בתיקוף יעדים מטבוליים ואלקטרופיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה בדימות מטבולי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי מטבוליזם של הלב.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תוכניות למטבוליזם של הלב והפרעות קצב.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפיזיולוגיה של הלב, קניולציה כירורגית ודימות פלואורסצנציה.
- נדרש מיכשור ייעודי הכולל מערכות פרפוזיה, חיישני לחץ ומצלמות CCD ברגישות גבוהה.
- נדרש סטנדרטור בין-צוותי קפדני של פרוטוקולי הפרפוזיה והדימות.
- התאמה למינים אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר חיוני למניעת תסביכי אמבולת אוויר ונזק לרקמות במהלך הקניולציה.
