Name: Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סהכ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למד מיפוי ננוטופולוגי של הידבקות תאים על משטחים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם זווית משתנה. השיטה מאפשרת מדידת מרחקי תא-משטח ברמת דיוק של ננומטרים בודדים ומאפשרת השוואה בין קווי תאים שונים כולל תאי סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים הארץ באדן וירטמברג וEuropäische האיחוד יורופאישר Fonds für die Regionale Entwicklung - למימון ZAFH פוטון n, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) למימון מחקר מענק לא. 1792C08 כמו גם באדן וירטמברג-Stiftung GmbH למימון הפרויקט &quot;Aurami&quot;.

1. זריעה ודגירה של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בודד, למשל U373-MG או תאי glioblastoma U-251-MG בצפיפות אופיינית של 100 תאים / מ&quot;מ 2 בשקופית זכוכית ולגדל אותם לשעת 4872 במדיום התרבות (למשל RPMI 1640 בתוספת 10% עגל בסרום עוברי ואנטיביוטיקה) באמצעות חממה ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם סמן קרום, למשל 6-dodecanoyl-2-dimethylamino הנפטלין (laurdan) הגיש בקשה ל60 דקות בריכוז של 8 מיקרומטר (בתרבות בינונית) 4, או סמן ציטופלסמה, למשל calcein acetomethlyester בקש 40 דקות ב ריכוז של 5 מיקרומטר 3, או קרום הקשור פוטוסנסיטייזר, למשל protoporphyrin תשיעי מושרה על 4 שעתי דגירה למבשרה חומצה 5-aminolevulinic (5-ALA; 1 מ&quot;מ) 4,5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם מדיום תרבות או נאגר מלוח פוספט (PBS) לפני מיקרוסקופ פלואורסצנטי. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ זקוף, למשל Zeiss Axioplan, ולהחליף את קבלו על ידי מכשיר תאורה, כמתואר במס. 3 עם hemi-כדורי או הפריזמה זכוכית חמה גלילים יחד אופטי לשקופית האובייקט (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקרן ליזר collimated מקבילה הלאחר הדמיה על ידי פריזמה הזכוכית ורכיבים אופטיים נוספים (למשל קעור מראה) שוב תוצאות בקורה מקביל על פני השטח של המדגם (ריי התלמיד telecentric). תשמרו על עצמך שוקטור השדה החשמלי הוא מאונך למישור קיטוב של שכיחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במראת מתכוונן ממוקמת בתוך הקבל שצלם במטוס המדגם ומאיר את המדגם תחת זווית משתנה של שכיחות (קרן אובייקט). המראה מתכווננת עשוי להיות מונע על ידי מנוע צעד, כאשר כל תנוחה מתאימה לזווית מוגדרת היטב של מקרים, כפי שנקבע על ידי מדידות goniometric 3 </sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את העמדה זוויתי של המראה מתכווננת באמצעות זווית הקריטית Θ c = 61.3 ° למעבר זכוכית במים כערך קבוע. Θ ג ניתן דמיין על וריאציה של Θ כאשר צבע פלואורסצנטי (1 mononucleotide למשל mM פלבין, FMN) מומס במים. עמדתו של הראי בΘ = Θ ג מאוחסן בתכנית מיצוב המראה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים של המצלמה (מואר בחזרה תידור iXon EMCCD, DV887DC, יידור טכנולוגיה, בלפסט, 6 בבריטניה), כולל טמפרטורה, רווח, זמן הקלטה ומהירות משמרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעדשת מטרת ההגדלה המתאימה וצמצם מספרי מעדיף מתון (למשל 40 × / 0.75 או 63 × / 0.90 טבילה במים) ולמקם את האובייקט בשקופית מיקרוסקופ. השתמש בשמן טבילה כדי להבטיח מגע אופטי של המדגם עם פריזמה הזכוכית. להקליט תמונות פלואורסצנציה של דגימות זהות על וריאציה שלזווית של תאורה (Θ ≥ Θ Θ עם ג ג המקביל ל64.5 ° לממשק תא זכוכית). טווח זוויתי של 66 ° -74 ° בצעדים של 0.5 מעלות או ° 1 מומלץ. השתמש מסירה ארוך מתאים או מסנן מעביר פס לגילוי קרינה. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את התמונות (למשל בפורמט ASCII) נרשמו בזוויות שונות Θ, כמו גם את הגדרות המצלמה (לאפלית רקע), אורך גל העירור והמדדים השבירים לזכוכית (1 n = 1.52) ותאים (n 2 = 1.37) לתכנית ההערכה (LabVIEW; NanoCell). עבור כל קבוצה של פרמטרים החדירים לעומק ד (Θ) והעברת הגורם T (Θ) מחושבת באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תמונות המשמשות להערכת מרחקי תא מצע Δ פי משוואה 5 (סמן קרום) או משוואה 4 (סמן ציטופלסמה), תמונות בודדות עם הומוגניותתאורה (ה החושפנית, g. פסים) יכולה להיות שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תמונות של טופולוגיה תאי מצע ובחירת קוד צבע מתאים לתצוגה. במהלך פרופילי הערכה של פיקסלים בודדים יכול להיות מוצג, כמתואר באיור 2. פרופילים אלה יכולים לשמש כמדד לאיכות המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את פרוטוקול ההערכה. </li></ol> 4. נציג תוצאות ניסויים יציגים מבוצעים עם תאי U251-MG glioblastoma מהונדס גנטי שסופקו באדיבות על ידי פרופ &#39;Mollenhauer ינואר, מחלקה לאונקולוגיה המולקולרית, אוניברסיטת הדרום דנמרק, אודנסה. בשתי subclones של U251 תאים אלה גני מדכאי סרטן TP53 או PTEN נמצאים ביטוי יתר באמצעות ט במערכת ביטוי מושרה, כך שתאים אלה מפגינים פוטנציאל סרטני מופחת ויכולים להיחשב כפחות ממאיר. תאי U251-MG מאוד ממאירים ללא גן מדכא משמשים כקבוצת ביקורת, וU251-תאים מסוג בר MG לשמש להשוואה נוספת. דיודת ליזר פולטת סדרה רצופה של מעין פולסים picosecond (LDH400 עם הנהג PDL 800-B, Picoquant, ברלין, גרמניה; גל: 391 ננומטר; דופק אנרגיה: 12 PJ; שיעור החזרה: 40 מגה רץ) משמשת כמקור עירור. באיור 3 תמונות TIRFM של U251-MG תאי glioblastoma עם גני מדכאי גידול TP53 פעילים ודגר עם laurdan (8 מיקרומטר; 60 דקות) מתוארות על זוויות של שכיחות של 66.0 מעלות, 69.0 ° 73.0 ° ומתאימות לעומק חדירה של שדה חלוף האלקטרומגנטי של כ 140 ננומטר, 75 ננומטר, 60 ננומטר, בהתאמה. עם ירידת פלואורסצנטי עומק החדירה יורד בעצמה (ראה קשקשים) ומקורו באתרים שטחיים יותר של התאים (אנשי קשר מוקד למשל בקצותיהם). מרחקי תאי מצע (דמיין ב3d איור על ידי קוד צבע החל 0-600 ננומטר) בחריפות משתנים על פני התאים בין עלly ננומטרים ספורים (לבן, צהוב) ו250-300 ננומטר (אדום כהה), אנשי קשר כלומר מוקד ומרחקים גדולים יותר תאי מצע הם באזור קרוב. והוא הדין לU251-MG תאי glioblastoma עם מדכאי גן PTEN פעיל (האיור 4D), ואילו מרחקי תא מצע הם די קבועים לבקרת U251-MG ותאים מסוג פראי עם ערכים אופייניים של 80-100 ננומטר (צהוב; האיור 4b ) ו150-200 ננומטר (כתום אדום; איור 4 א). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> איור 1. מכשיר תאורה לVA-TIRFM במיקרוסקופ זקוף. מראה מתכווננת מונע על ידי מנוע צעד מאפשר רזולוציה הזוויתית של ± 0.25 °. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> איור 2. פרופיל הערכה לאחד pix<html> אל (סכמטי). כאשר ln [אני F / T (Θ)] זמם כפונקציה של 1 / ד (Θ), השיפוע מייצג את תאי מצע מרחק Δ. מדרון זה נקבע בדרך כלל עם דיוק של כ 10% ±. ערך אחד - כתוצאה מתאורה לא הומוגנית - סומן ולא נכלל בהערכה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> איור 3 תמונות TIRFM של U251-MG תאי glioblastoma עם גן מדכא פעיל TP53 על דגירה עם laurdan (8 מיקרומטר; 60 דקות). נרשם בזוויות שונות של תאורה (AC); מרחקי תא מצע בטווח של 0-600 ננומטר הראה לפי קוד צבע (ד); אורך גל עירור: 391 ננומטר, זיהוי: ≥ 420 ננומטר, גודל תמונה: 210 מיקרומטר מיקרומטר. × 210 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> ogether.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig4.jpg" /> איור 4 מרחקי Cell-מצע של U251-MG תאי glioblatoma בטווח של 0-600 ננומטר מוצג על ידי קוד צבע;. (א) סוג פרוע (ב) פקדים: (ג) תאים עם גן מדכא פעיל TP53, (ד) תאים עם PTEN גן המדכא הופעל; גל עירור: 391 ננומטר, גילוי: ≥ 420 ננומטר, גודל תמונה: 210 מיקרומטר מיקרומטר. × 210 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol><li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+reflection+microscopy%3A+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li>
<li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+%28I%29+Modelling+cell+contact+region+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li>
<li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%3A+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Opt.+Technol%22%5BJournal%5D)">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317(2008).</li>
<li>Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Pathol.+Toxicol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li>
<li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device%3A+enhanced+sensitivity%2C+speed+and+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+with+continuous+wave+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li>
<li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li>
<li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitizers%3A+therapy+and+detection+of+malignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+microscopy%3A+technical+innovations+and+novel+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטה מתוארת למדידת מרחקי תא מצע בדייקנות ננומטר. נכון להיום, שיטות של מיקרוסקופיה רזולוצית סופר, המבוססות למשל על תאורה מובנית 7 או במולקולה בודדה 8-10 זיהוי, כמו גם ירידה בכמות פליטה מאולצת (STED) מיקרוסקופיה 11 הן בעלות עניין רב. אף אחת מהשיטות הללו, עם זאת, מאפשר רזולוציה צירית להלן 50 ננומטר. בנוסף, קרינה גבוהה למדי של 50100 W / 2 סנטימטר נחוץ לשיטות מולקולה בודדות ויותר מ 3000 W / 2 סנטימטר למיקרוסקופיה STED. זה ...

כאשר קרן אור מתפשטת דרך מדיום של המדד N 1 שבירה עונה ממשק למדיום שני של מקדם שבירת n 2 &lt;1 n, ההשתקפות הפנימית מוחלטת מתרחשת בכל הזוויות של השכיחות Θ, שהם גדולים יותר מהזווית הקריטית Θ ג = arcsin (n 2 / n 1). למרות ששקף לחלוטין את אלומת אור התקרית מעוררת שדה האלקטרומגנטי חלוף שחודר לתוך המדיום והדועך אקספוננציאלית עם ניצב מרחק z מהממשק 2 לפי (z) = 0 אני ez / ד (Θ). אני (z) תואם את עוצמת השדה האלקטרומגנטי וד (Θ) לעומק החדירה באורך הגל λ, כפי שנמסר על ידי ד (Θ) = (λ/4π) (1 2 חטא n 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 כפי שדווח בספרות 1,2, אני 0 </sUB&gt; מתאים לעוצמת אור תקרית שהדואר מוכפל בהעברת הגורם T (Θ) והיחס n 2 / n 1. אם וקטור השדה החשמלי של קרן האור מקוטב זה ניצב למישור פגיע (כלומר המטוס מורחב על ידי האירוע והקרן משתקפת), גורם תמסורת זו ניתן על ידי T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n 2 / NL 1) 2] לעוצמת הקרינה התגלתה במדידות TIRFM, ספיגת אור צריכה להיות משולבת על כל השכבות של המדגם והתרבה ​​עם פלואורסצנטי קוונטי התשואה η של הצבע הרלוונטי, כמו גם עם הזווית המוצקה של זיהוי Ω. כפי שדווח בעבר 3, בעצמה זו יכולה להיות מתוארת על ידי אני F (Θ) = AT (Θ) OC (z) דואר z / ד (Θ) dz אם כל הגורמים שהם f עצמאי<html> rom זווית פגיעת Θ והקואורדינטה z כלול בתוך משוואת א המתמדת הניסיונית 3 ניתן לפתור אנליטית, אם הריכוז ג (z) של fluorophores נחשב להיות כמעט קבוע - או בכל הקואורדינטות z ≥ Δ, למשל בתוך הציטופלסמה של תאים בעלי מרחק Δ מהממשק. במקרה זה, יש נפרד, שיחושב מz = Δ לz = ∞ וכתוצאה מכך אני F = ג T (Θ) ד (Θ) דואר Δ / ד (Θ) - או בין z = Δ - t / 2 ו-Z = Δ + t / 2, כלומר בתוך שכבה דקה של t עובי, למשל קרום תא ממוקם במרחק Δ מהממשק. במקרה זה, עוצמת הקרינה יכולה להיות מחושבת כ אני F = ג T (Θ) טה-Δ / ד (Θ), אם לא הוא קטן בהשוואה לΔ. &gt; &quot;אף אוזן גרון ממשוואות (4) ו (5) מרחקי תא מצע Δ ניתן לחשב, אם תמונות של עוצמת קרינה אני F נרשמים לזוויות משתנות Θ, ואם ln (אני F / T ד) (Eq. 4) או ln (אני F / T) (Eq. 5) מוערך כפונקציה של 1 / ד לזוויות אלה. לקרום סמן laurdan השתמש בנייר הזה (סעיף להלן) ההערכה בוצעה על פי משוואה. 5. כפי שדווח בעבר 3, תמונת רכישה וההערכה דורשת - הפצה הומוגני של אור עירור על המדגם, - תוקפו של מודל 2-שכבה (עם מדדי שבירת n 1 ו n 2 למצע וציטופלסמה, בהתאמה). זה מחזיק, אם קרום הפלזמה הוא דק מאוד, ואם השכבה של מדיום החוץ התאי (בין התא והמצע) היא קטנה בהשוואה לאורך הגל של אור אירוע. בנוסף, צמצם מספרי מתון(בדרך כלל ≤ 0.90) של עדשת המיקרוסקופ המטרה הוא יתרון, כדי למנוע סטיות של בהירות בשל אנאיזוטרופיה של קרינה בתחום הקרוב של הממשק דיאלקטרי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> סוג </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מדגרה </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> זרימה למינרית </td><td> הולטן בטוח </td><td> S2010 1.2 EN ג&quot;ג 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> טיפוח בינוני </td></tr><tr><td> שקופיות זכוכית אובייקט </td><td> Marienfeld </td><td> זכוכית לבנה טהורה </td><td> הליך ניקוי מיוחד המשמש </td></tr><tr><td> 6-dodecanoyl-2-dimethylamino נפטלין (laurdan) </td><td> בדיקות מולקולריות </td><td></td><td> סמן פלורסנט (פתרון המלאי: 2 מ&quot;מ באתנול) </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1 Axioplan </tד&gt; <td></td></tr><tr><td> דיודת ליזר </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 עם הנהג PDL 800-B </td><td> אורך גל: 391 ננומטר </td></tr><tr><td> מערכת סיבי מצב יחידה </td><td> מקור פוינט </td><td> kineFlex </td><td> השתמשתי עם אופטיקה collimating </td></tr><tr><td> מצלמת EMCCD </td><td> תידור </td><td> DV887DC </td><td> מצלמה מוארת חזור </td></tr></tbody></table>

nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה&quot;כ השתקפות פלואורסצנטי (va-tirfm)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

טופולוגיה פני שטח, למשל של גידול תאים על מצע, נקבעת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית פנימית סה&quot;כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM). תאי מעובדות בשקופיות שקופות ודגרו במרקר זרחני המופץ הומוגנית בקרום הפלזמה שלהם. הארה מתרחשת על ידי קרן ליזר מקבילה, על פי זוויות משתנות של ההשתקפות הפנימית מוחלטת (TIR) ​​עם מעמקי חדירה שונים של השדה האלקטרומגנטי החולפים. הקלטה של ​​תמונות פלואורסצנציה על קרינה בכ 10 זוויות שונות מאפשרת לחשב מרחקי תא מצע עם דיוק של ננומטרים ספורים. הבדלים של הדבקה בין קווים שונים של תאים, תאים סרטניים ותאים למשל פחות ממאירים, נקבעים כך. בנוסף, שינויים אפשריים של הידבקות תא על כימי או טיפול פוטודינמי יכולים להיבחן. בהשוואה לשיטות אחרות של סופר רזולוצית חשיפה לאור מיקרוסקופיה נשמרהקטן מאוד, ולא נגרם ניזק של תאי חיים צפוי להתרחש.

הטופולוגיה של הידבקות תא על מצע נמדדת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית הפנימית מוחלטת השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM).

Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה&quot;כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

טופולוגיה של פני השטח, למשל של תאים הגדלים על מצע, נקבעת בדיוק ננומטרי באמצעות פלואורסצנציית החזרה פנימית מלאה בזווית משתנה (Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence)...

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד טופולוגיה של היצמדות תאים על תשתית בדיוק ננומטרי. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול תאים על סליידי זכוכית שקופים ודגירה שלהם עם סמן פלואורסצנטי. לאחר מכן, המיקום הזוויתי של המראה המתכווננת של המיקרוסקופ מכויל והמיקום נשמר בתוכנת מיקום המראה.השלב הבא הוא הקלטת תמונות פלואורסצנציה בעת הקרנה בכ-10 זוויות שונות. השלב הסופי הוא חישוב המרחקים בין התאים למצע בדיוק של מספר ננומטרים. בסופו של דבר, תוצאות הטופולוגיה של היצמדות התאים למצע משמשות להדגמת הבדלים בהיצמדות בין קווי תאים שונים, למשל, תאי סרטן ותאים פחות ממאירים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא שרזולוציה בפועל היא בטווח של ננומטרים בודדים בלבד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ממברנות של תאים, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות כגון שלפוחיות קטנות או ננו-חומרים.את הניסוי תדגים הפוסט-דוקטורנטית שלנו פטרה, שתכין את דגימות התאים, והמהנדס שלנו, מייקל ואגנר, שיבצע את הניסוי. כדי להכין תאים עבור מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה ובזווית משתנה, זרעו תאים בודדים בצפיפות של 100 cells per square millimeter על למסחת זכוכית בתוך תמיסת תרבית המועשרת ב-10% fetal calf serum ואנטיביוטיקה. גדלו את התאים במשך 72 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.בשלב הבא, החיל את הממברנה הפלואורסצנטית, marker six D, decano two, dimethyl amino naphthalene, או lorane בריכוז של 8 µM במצע תרבית, והדגר למשך 60 דקות לפני המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית. שטוף את התאים ב-PBS על ידי הזרקת תמיסת הבופר מעל העגילה כדי להסיר את המצע, ולאחר מכן נגב את תמיסת הבופר מגב העגילה. לצילום בזוויות משתנות השתמש במיקרוסקופ אנכי, כגון Zeiss Axio plan, המצויד בתאורה אחורית ובמצלמת exon E-M-C-C-D.במיקרוסקופ TIRFM מוחלף העדשה המקבילה (condenser) במכשיר תאורה מותאם אישית הכולל מנסרה זכוכית חצי-גלילית המחוברת אופטית לזכוכית העצם. קרן הלייזר מגיעה מסיב אופטי חד-סיבי (mono mode) מקולט, אשר לאחר דימוי על ידי מנסרת הזכוכית ורכיבים אופטיים נוספים, יוצרת שוב קרן מקבילה על פני השטח של הדגימה. יש לוודא שוקטור השדה החשמלי מקוטב בניצב למישור הפגיעה.מיקום זה מסומן על מצמד המוצא (output coupler) של הסיב. השתמש במראה מתכווננת הממוקמת בתוך המעבה, אשר נדמית במישור הדגימה ומאירה את הדגימה תחת זווית פגיעה משתנה של קרן האובייקט. המראה המתכווננת עשויה להיות מונעת על ידי מנוע פסועים (step motor), הנשלט באמצעות תוכנה.כל מיקום תואם לזווית פגיעה מוגדרת היטב כפי שנקבע על ידי מדידות שהתבצעו בשיטת goniometric. כדי לכייל את המיקום הזוויתי של המראה המ可adjסטבילית, השתמש בצבע פלואורסצנטי כגון flavin nucleotide בריכוז 1 mM, המומס במים. כדי להמחיש את הזווית הקריטית בעת שינוי זווית הפגיעה, השתמש בזווית קריטית של 61.3 מעלות למעבר בין זכוכית למים כערך קבוע; המיקום הזוויתי של המראה שבו זווית הפגיעה שווה לזווית הקריטית נשמר בתוכנת מיקום המראה.באמצעות תוכנת המצלמה, הגדירו את הפרמטרים של מצלמת ה-E-M-C-C-D, כולל הגבר טמפרטורה, זמן הקלטה ומהירות הזזה. השתמשו בשמן אימרסיה כדי להבטיח מגע אופטי של הדגימה. באמצעות פריזמה מזכוכית, בחרו עדשה אובייקטיבית בעלת הגדלה מתאימה לתאים וממספר מפתח (numeric aperture) בינוני.כדי להדמיות של האובייקט במיקרוסקופ, השתמש במסנן long pass או band pass מתאים לזיהוי פלואורסצנציה. הקלט תמונות פלואורסצנציה של דגימות זהות תוך שינוי של זווית ההארה. זוויות הפגיעה צריכות להיות שוות או גדולות מהזווית הקריטית.כאשר הזווית הקריטית עבור ממשק זכוכית-תא היא 64.5 מעלות, מומלץ להשתמש בטווח זוויות של 66 מעלות עד 74 מעלות, בקפיצות של 0.5 מעלות או מעלה אחת. כדי להתחיל בניתוח הנתונים, השתמש בתוכנת LabVIEW לקריאת התמונות שהוקלטו בזוויות השונות, כמו גם את הגדרות המצלמה, אורך גל העירור ומקדמי השבירה. עבור זכוכית, שהמקדם הוא 1.52, ועבור תאים, שהמקדם הוא 1.37, ההגדרות מיובאות לצורך הערכה נכונה של הנתונים.עבור כל סט של פרמטרים, עומק החדירה ומקדם התמסורה מחושבים באופן אוטומטי. להצלחת הפרוצדורה, חשוב שהתמונות יתועדו וייבחרו בקפידה לצורך הניתוח. יש לבחור את התמונות המשמשות להערכת המרחקים בין התאים לתשתית בהתאם למשוואה.עבור סמן ממברנה, ניתן להוציא תמונות בודדות בעלות תאורה הומוגנית, כפי שמוצג בדוגמה זו. חשב תמונות של טופולוגיית תשתית התא ובחר קוד צבע מתאים לתצוגה במהלך ההערכה. ניתן להציג פרופילים של פיקסלים בודדים כפי שמתואר באיור זה.פרופילים אלו עשויים לשמש כאינדיקטור לאיכות ההתאמה. לבסוף, שמור את פרוטוקול ההערכה. איור זה מציג תמונות של החזרה פנימית מלאה של תאי גליובלסטומה U2 51 עם גן מדכא גידולים TP 53 פעיל.לאחר דגירה עם luan שנמדדה בזוויות פגיעה שונות, 66 מעלות המתאימות לעומק חדירה של השדה האלקטרומגנטי הנעלם של כ-140 nanometers, 69 מעלות המתאימות לעומק חדירה של 75 nanometers ו-73 מעלות המתאימות לעומק חדירה של 60 nanometers עם חדירה פוחתת. עוצמת הפלואורסצנציה פוחתת ככל שעומק החדירה קטן, והיא מקורה באתרים שטחיים יותר של התאים, כגון מגעים מוקדיים בקצותיהם. מרחקי התאים מהמצע מוצגים בלוח D באמצעות קוד צבעים הנע בין zero ל-600 nanometers, כפי שניתן לראות כאן.המרחקים בין התאים לתשתית משתנים במידה ניכרת בין התאים, החל מכמה ננומטרים בלבד, המיוצגים בצבע לבן עד צהוב, ועד ל-250 עד 300 ננומטרים, המיוצגים בצבע אדום כהה. הדבר מעיד על כך שנקודות מגע מוקדיות (focal contacts) ומרחקים גדולים יותר בין התאים לתשתית נמצאים בסמיכות קרובה. שונות דומה במרחקים בין התאים לתשתית חושבה עבור תאי גליובלסטומה U2 51 mg עם גן מדכא גידול P 10 פעיל.לעומת זאת, המרחקים בין התאים לתשתית הם קבועים למדי עבור תאי ביקורת U2 51 mg המיוצגים בצהוב ותאי פרא (wild type) המיוצגים בכתום עד אדום לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום טופולוגיית תא-תשתית לחקור תאי גידול ושינויים מורפולוגיים בעקבות טיפול בלייזר. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן להדמיות משטחים ברזולוציה ממשית בטווח הננומטרים תחת חשיפה נמוכה לאור, דבר שנסבל היטב על ידי אורגניזמים חיים.

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

השתקפות פנימית מוחלטת פלואורסצנטי (TIRF) מיקרוסקופיה היא גישה חזקה כדי לבחון מבנים סמוך לפני השטח של התא על ניגודיות גבוהה ורזולוציה הזמני. אנו מדגימים כיצד TIRF יכול להיות מועסק על מנת ללמוד על הדינמיקה חלבונים בקליפת המוח של קיר סגורים תאים תאים חיידקיים פטרייתי.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

סרטון זה מתאר את TIRF, טכניקה מבוססת מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת להמחשת דינמיקת פילמור אקטין ומיקרוטובול. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול בזמן אמת, החיונית להבנת שיחות צולבות תאיות.

מיקרוסקופ TIRF להמחשת דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול

מקור: Daniele, F., et. al בדיקות GFP רגישות ל-TIRFM ו-pH להערכת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y: הדמיית תאים וניתוח נתונים. J. Vis. exp. (2015). סרטון זה מדגים את ההדמיה של תאי נוירובלסטומה אנושיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללת (TIRF) כדי להמחיש שלפוחיות סינפטיות מתויגות פלואורופור. התאים מתמקדים תחילה במצב אפיפלואורסצנטי. לאחר מכן נעשות התאמות כדי להשיג השתקפות פנימית מוחלטת, וליצור גלים חולפים המעוררים באופן סלקטיבי פלואורופורים ליד הממברנה. לפני...

הדמיית תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת

הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

אנו מתארים את גישת ההדמיה לקביעת המצב oligomeric הממוצע של megfp-מתויג-קולטן מתויגים oligomeric הנגרמת על ידי ליגנד קשירה ממברנה פלזמה של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N &amp; B).

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

מיקרוסקופיה של ליטוגרפיה וכוח המתיחה של כמעט UV משולבות כדי למדוד כוחות תאיים על הידרוג'לים מיקרו-מרופדים. שחרור ממוקד המושרה באור של תאים בודדים מאפשר מספר גבוה של מדידות באותה דגימה.

שליטה בהידבקות תאים באמצעות טכניקות דפוס הידרוג'ל ליישומים במיקרוסקופיה של כוח המתיחה

אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

למד מיפוי ננוטופולוגי של הידבקות תאים על משטחים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם זווית משתנה. השיטה מאפשרת מדידת מרחקי תא-משטח ברמת דיוק של ננומטרים בודדים ומאפשרת השוואה בין קווי תאים שונים כולל תאי סרטן.

Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה"כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

גלה סרטונים נוספים