Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה"כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד טופולוגיה של היצמדות תאים על תשתית בדיוק ננומטרי. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול תאים על סליידי זכוכית שקופים ודגירה שלהם עם סמן פלואורסצנטי. לאחר מכן, המיקום הזוויתי של המראה המתכווננת של המיקרוסקופ מכויל והמיקום נשמר בתוכנת מיקום המראה.

השלב הבא הוא הקלטת תמונות פלואורסצנציה בעת הקרנה בכ-10 זוויות שונות. השלב הסופי הוא חישוב המרחקים בין התאים למצע בדיוק של מספר ננומטרים. בסופו של דבר, תוצאות הטופולוגיה של היצמדות התאים למצע משמשות להדגמת הבדלים בהיצמדות בין קווי תאים שונים, למשל, תאי סרטן ותאים פחות ממאירים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא שרזולוציה בפועל היא בטווח של ננומטרים בודדים בלבד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ממברנות של תאים, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות כגון שלפוחיות קטנות או ננו-חומרים.

את הניסוי תדגים הפוסט-דוקטורנטית שלנו פטרה, שתכין את דגימות התאים, והמהנדס שלנו, מייקל ואגנר, שיבצע את הניסוי. כדי להכין תאים עבור מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה ובזווית משתנה, זרעו תאים בודדים בצפיפות של 100 cells per square millimeter על למסחת זכוכית בתוך תמיסת תרבית המועשרת ב-10% fetal calf serum ואנטיביוטיקה. גדלו את התאים במשך 72 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.

בשלב הבא, החיל את הממברנה הפלואורסצנטית, marker six D, decano two, dimethyl amino naphthalene, או lorane בריכוז של 8 µM במצע תרבית, והדגר למשך 60 דקות לפני המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית. שטוף את התאים ב-PBS על ידי הזרקת תמיסת הבופר מעל העגילה כדי להסיר את המצע, ולאחר מכן נגב את תמיסת הבופר מגב העגילה. לצילום בזוויות משתנות השתמש במיקרוסקופ אנכי, כגון Zeiss Axio plan, המצויד בתאורה אחורית ובמצלמת exon E-M-C-C-D.

במיקרוסקופ TIRFM מוחלף העדשה המקבילה (condenser) במכשיר תאורה מותאם אישית הכולל מנסרה זכוכית חצי-גלילית המחוברת אופטית לזכוכית העצם. קרן הלייזר מגיעה מסיב אופטי חד-סיבי (mono mode) מקולט, אשר לאחר דימוי על ידי מנסרת הזכוכית ורכיבים אופטיים נוספים, יוצרת שוב קרן מקבילה על פני השטח של הדגימה. יש לוודא שוקטור השדה החשמלי מקוטב בניצב למישור הפגיעה.

מיקום זה מסומן על מצמד המוצא (output coupler) של הסיב. השתמש במראה מתכווננת הממוקמת בתוך המעבה, אשר נדמית במישור הדגימה ומאירה את הדגימה תחת זווית פגיעה משתנה של קרן האובייקט. המראה המתכווננת עשויה להיות מונעת על ידי מנוע פסועים (step motor), הנשלט באמצעות תוכנה.

כל מיקום תואם לזווית פגיעה מוגדרת היטב כפי שנקבע על ידי מדידות שהתבצעו בשיטת goniometric. כדי לכייל את המיקום הזוויתי של המראה המ可adjסטבילית, השתמש בצבע פלואורסצנטי כגון flavin nucleotide בריכוז 1 mM, המומס במים. כדי להמחיש את הזווית הקריטית בעת שינוי זווית הפגיעה, השתמש בזווית קריטית של 61.3 מעלות למעבר בין זכוכית למים כערך קבוע; המיקום הזוויתי של המראה שבו זווית הפגיעה שווה לזווית הקריטית נשמר בתוכנת מיקום המראה.

באמצעות תוכנת המצלמה, הגדירו את הפרמטרים של מצלמת ה-E-M-C-C-D, כולל הגבר טמפרטורה, זמן הקלטה ומהירות הזזה. השתמשו בשמן אימרסיה כדי להבטיח מגע אופטי של הדגימה. באמצעות פריזמה מזכוכית, בחרו עדשה אובייקטיבית בעלת הגדלה מתאימה לתאים וממספר מפתח (numeric aperture) בינוני.

כדי להדמיות של האובייקט במיקרוסקופ, השתמש במסנן long pass או band pass מתאים לזיהוי פלואורסצנציה. הקלט תמונות פלואורסצנציה של דגימות זהות תוך שינוי של זווית ההארה. זוויות הפגיעה צריכות להיות שוות או גדולות מהזווית הקריטית.

כאשר הזווית הקריטית עבור ממשק זכוכית-תא היא 64.5 מעלות, מומלץ להשתמש בטווח זוויות של 66 מעלות עד 74 מעלות, בקפיצות של 0.5 מעלות או מעלה אחת. כדי להתחיל בניתוח הנתונים, השתמש בתוכנת LabVIEW לקריאת התמונות שהוקלטו בזוויות השונות, כמו גם את הגדרות המצלמה, אורך גל העירור ומקדמי השבירה. עבור זכוכית, שהמקדם הוא 1.52, ועבור תאים, שהמקדם הוא 1.37, ההגדרות מיובאות לצורך הערכה נכונה של הנתונים.

עבור כל סט של פרמטרים, עומק החדירה ומקדם התמסורה מחושבים באופן אוטומטי. להצלחת הפרוצדורה, חשוב שהתמונות יתועדו וייבחרו בקפידה לצורך הניתוח. יש לבחור את התמונות המשמשות להערכת המרחקים בין התאים לתשתית בהתאם למשוואה.

עבור סמן ממברנה, ניתן להוציא תמונות בודדות בעלות תאורה הומוגנית, כפי שמוצג בדוגמה זו. חשב תמונות של טופולוגיית תשתית התא ובחר קוד צבע מתאים לתצוגה במהלך ההערכה. ניתן להציג פרופילים של פיקסלים בודדים כפי שמתואר באיור זה.

פרופילים אלו עשויים לשמש כאינדיקטור לאיכות ההתאמה. לבסוף, שמור את פרוטוקול ההערכה. איור זה מציג תמונות של החזרה פנימית מלאה של תאי גליובלסטומה U2 51 עם גן מדכא גידולים TP 53 פעיל.

לאחר דגירה עם luan שנמדדה בזוויות פגיעה שונות, 66 מעלות המתאימות לעומק חדירה של השדה האלקטרומגנטי הנעלם של כ-140 nanometers, 69 מעלות המתאימות לעומק חדירה של 75 nanometers ו-73 מעלות המתאימות לעומק חדירה של 60 nanometers עם חדירה פוחתת. עוצמת הפלואורסצנציה פוחתת ככל שעומק החדירה קטן, והיא מקורה באתרים שטחיים יותר של התאים, כגון מגעים מוקדיים בקצותיהם. מרחקי התאים מהמצע מוצגים בלוח D באמצעות קוד צבעים הנע בין zero ל-600 nanometers, כפי שניתן לראות כאן.

המרחקים בין התאים לתשתית משתנים במידה ניכרת בין התאים, החל מכמה ננומטרים בלבד, המיוצגים בצבע לבן עד צהוב, ועד ל-250 עד 300 ננומטרים, המיוצגים בצבע אדום כהה. הדבר מעיד על כך שנקודות מגע מוקדיות (focal contacts) ומרחקים גדולים יותר בין התאים לתשתית נמצאים בסמיכות קרובה. שונות דומה במרחקים בין התאים לתשתית חושבה עבור תאי גליובלסטומה U2 51 mg עם גן מדכא גידול P 10 פעיל.

לעומת זאת, המרחקים בין התאים לתשתית הם קבועים למדי עבור תאי ביקורת U2 51 mg המיוצגים בצהוב ותאי פרא (wild type) המיוצגים בכתום עד אדום לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום טופולוגיית תא-תשתית לחקור תאי גידול ושינויים מורפולוגיים בעקבות טיפול בלייזר. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן להדמיות משטחים ברזולוציה ממשית בטווח הננומטרים תחת חשיפה נמוכה לאור, דבר שנסבל היטב על ידי אורגניזמים חיים.