Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה"כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד טופולוגיה של הידבקות תאים על מצע בדיוק ננומטרי. זה מושג על ידי טיפוח תאים על שקופיות זכוכית שקופות ודגירה עליהם עם טוש פלואורסצנטי. לאחר מכן מכויל המיקום הזוויתי של המראה המתכווננת של המיקרוסקופ והמיקום מאוחסן בתוכנית מיקום המראה.

השלב הבא הוא להקליט את תמונות הקרינה בעת הקרנה בכ-10 זוויות שונות. השלב האחרון הוא חישוב מרחקי מצע התא בדיוק של כמה ננומטרים. בסופו של דבר, תוצאות טופולוגיה של הידבקות תאים על מצע משמשות כדי להראות הבדלים בהדבקה בין קווי תאים שונים, למשל, תאים סרטניים ותאים פחות ממאירים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא שהרזולוציה בפועל היא בטווח של ננומטרים בודדים בלבד. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי קרומי התאים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון שלפוחיות קטנות או ננו-חומרים.

שידגים את הניסוי יהיו הפוסט-דוקטורנט שלנו פטרה, שיכין את דגימות התאים והמהנדס שלנו, מיכאל וגנר, שינהל את הניסוי כדי להכין תאים לזווית משתנה, השתקפות פנימית כוללת. מיקרוסקופ פלואורסצנטי זרע תאים בודדים בצפיפות של 100 תאים למילימטר רבוע על שקופית זכוכית במדיום תרבית בתוספת 10% עגל עוברי, סרום ואנטיביוטיקה. לגדל תאים במשך 72 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, יש למרוח על התאים את הממברנה הפלואורסצנטית, סמן שש D, דקאנו שתיים, דימתיל אמינו נפתלין או לוראן בריכוז של שמונה מיקרומולר בתרבית, דגירה בינונית למשך 60 דקות לפני מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שטפו את התאים עם פיפטה PBS את תמיסת החיץ מעל שקופית האובייקט כדי להסיר את המדיום לאחר מכן, נגב את תמיסת החיץ מהצד האחורי של שקופית האובייקט. מיקרוסקופ זקוף כגון תוכנית Zeiss Axio, המצויד במצלמת E-M-C-C-D מוארת אחורית או אקסון משמש לזווית משתנה.

T-I-R-F-M החלף את המעבה שלו במכשיר תאורה בהתאמה אישית עם מנסרת זכוכית גלילית HEMI המחוברת אופטית לשקופית האובייקט. קרן הלייזר נפגעת מסיב במצב מונו מואסף, אשר לאחר הדמיה על ידי מנסרת הזכוכית ורכיבים אופטיים נוספים, מביא שוב לקרן מקבילה על פני הדגימה. הקפד שווקטור השדה החשמלי יהיה מקוטב, בניצב למישור האירועים.

מיקום זה מסומן על מצמד הפלט של הסיב. השתמש במראה מתכווננת הממוקמת בתוך הקבל, המצולמת במישור הדגימה ומאירה את הדגימה תחת זווית משתנה של תקריות או קרן אובייקט. המראה המתכווננת עשויה להיות מונעת על ידי מנוע צעד, הנשלט על ידי תוכנה.

כל מיקום מתאים לזווית מוגדרת היטב של אירועים כפי שנקבעה על ידי מדידות מטריות מתקדמות. כדי לכייל את המיקום הזוויתי של המראה המתכווננת, השתמש בצבע פלואורסצנטי כגון נוקלאוטיד פלבין מילימולרי אחד, מומס במים. כדי לדמיין את הזווית הקריטית בעת שינוי זווית האירועים, השתמש בזווית הקריטית של 61.3 מעלות עבור מעבר מים מזכוכית כערך קבוע, המיקום הזוויתי של המראה שבו זווית האירועים שווה לזווית הקריטית מאוחסן בתוכנית מיקום המראה.

באמצעות תוכנת המצלמה, הגדר את הפרמטרים של מצלמת E-M-C-C-D, כולל עליית טמפרטורה, זמן הקלטה ומהירות משמרת. השתמש בשמן טבילה כדי להבטיח מגע אופטי של הדגימה. בעזרת מנסרת זכוכית, בחר עדשה אובייקטיבית בהגדלה מתאימה לתאים וצמצם מספרי מתון.

כדי לדמיין את האובייקט במיקרוסקופ, השתמש במסנן מעבר ארוך או פס מתאים לזיהוי פלואורסצנטי. הקלט תמונות פלואורסצנטיות של דגימות זהות עם שינוי זווית התאורה. זוויות האירועים צריכות להיות זהות או גדולות מהזווית הקריטית.

עם הזווית הקריטית המתאימה ל-64.5 מעלות עבור ממשק זכוכית תא, מומלץ טווח זוויתי של 66 מעלות עד 74 מעלות עם צעדים של 0.5 מעלות או מעלה אחת. כדי להתחיל בניתוח נתונים, השתמש בתוכנית תצוגת המעבדה כדי לקרוא את התמונות שהוקלטו בזוויות שונות כמו גם את הגדרות המצלמה, אורך גל העירור ומקדמי השבירה. עבור זכוכית, שהיא 1.52, ותאים, שהיא 1.37, ההגדרות מיובאות להערכה נכונה של הנתונים.

עבור כל סט פרמטרים, עומק החדירה וגורם השידור מחושבים אוטומטית להצלחת ההליך. חשוב שהתמונות יוקלטו בקפידה וייבחרו לניתוח. בחר תמונות המשמשות להערכת מרחקי מצע התא בהתאם למשוואה.

עבור סמן ממברנה, תמונות בודדות בתוך תאורה הומוגנית, כמו שמוצג בדוגמה זו, עשויות להיכלל. חשב תמונות של טופולוגיית מצע התא ובחר קוד צבע מתאים לתצוגה במהלך ההערכה. ניתן להציג פרופילים של פיקסלים בודדים כפי שמתואר באיור זה.

פרופילים אלה עשויים לשמש כאינדיקטור לאיכות ההתאמה. לבסוף, אחסן את פרוטוקול ההערכה. איור זה מתאר תמונות השתקפות פנימיות כוללות של תאי גליובלסטומה U2 51 מ"ג עם גן מדכא גידול TP 53 מופעל.

עם הדגירה עם לואן שנרשמה בזוויות שונות של אירועים, 66 מעלות מתאימות לעומק חדירה של השדה האלקטרומגנטי החולף של כ-140 ננומטר, 69 מעלות, המקבילות לעומק חדירה של 75 ננומטר ו-73 מעלות המתאימות לעומק חדירה של 60 ננומטר עם חדירה יורדת. פלואורסצנטיות העומק פוחתת בעוצמתה ומקורה באתרים שטחיים יותר של התאים, כגון מגעים מוקדיים בקצוותיהם. מרחקי מצע התא מתוארים בפאנל D על ידי קוד צבע שנע בין אפס ל-600 ננומטר כפי שניתן לראות כאן.

מרחקי מצע התא משתנים מאוד על פני התאים בין ננומטרים בודדים המיוצגים על ידי לבן לצהוב ו-250 עד 300 ננומטר המיוצגים על ידי אדום כהה. זה מצביע על מגעים מוקדיים ומרחקים גדולים יותר של מצע התא נמצאים בקרבת מקום. וריאציה דומה במרחקי מצע התא מחושבת עבור תאי גליובלסטומה U2 51 מ"ג עם גן מדכא גידול מופעל P 10.

לעומת זאת, מרחקי מצע התא קבועים למדי עבור תאי בקרה U2 51 מ"ג המיוצגים על ידי תאים צהובים ופראיים המיוצגים על ידי כתום לאדום לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום טופולוגיית מצע התא לחקור תאי גידול ואת השינויים המורפולוגיים לאחר טיפול בלייזר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין משטחים ברזולוציה ממשית בטווח הננומטר בחשיפה לאור נמוך, הנסבל היטב לאורגניזמים חיים.