העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד בהצלחה לולאות מלבלב עכבר. זה מושג על ידי בידוד הלבלב מהרקמה שמסביב. לאחר מכן, צינור המרה מנולט כך שניתן לנפח את הלבלב בתערובת הפרוטאז של הקולגנאז.

לאחר ניפוח, הלבלב מוסר והלולאות מנותקות בזהירות. לבסוף, הלולאות המבודדות מסוננות ומצופות לשימוש עתידי. בסופו של דבר, שיטה זו של בידוד לולאות עם קולגנאז מטוהר ופרוטאז ניטרלי משמשת להשגת תפוקת לולאות מקסימלית ומורפולוגיה אופטימלית של לולאות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות לבידוד לולאות הוא שביטלנו את השונות הרבה להרבה על ידי שימוש באנזימים מטוהרים. ובנוסף, שינינו או ביצענו שיפורים בפרוטוקולים מסוימים כדי לשפר את המורפולוגיה של העפעפיים. לאחר המתת חסד, יש לכסות את פלג הגוף העליון באתנול 70% לפני פתיחת חלל הבטן לחלוטין מפי הטבעת לסרעפת.

לאחר מכן, הניחו את העכבר על פלטפורמה של מיקרוסקופ דיסקציה. משוך החוצה את הצקום והמעי הגס העולה והניח אותם מחוץ לחלל הגוף שמאלה, עקור את אונות הכבד כנגד הסרעפת. אם הם לא נשארים שם בכוחות עצמם, הגדילו את פתח חלל הגוף.

אחזו בתריסריון בעזרת מלקחיים מעוקלים ואתרו את וריד שער עורק הכבד וצרור צינור המרה המובילים לכבד. עם זוג נוסף של מלקחיים מעוקלים. הכנס תפר מתחת לווריד העורק וצרור הצינורות והדק אותו קרוב ככל האפשר לכבד.

בעזרת שני זוגות מלקחיים מעוקלים, תפסו בזהירות את התריסריון ומצאו את צינור המרה מחובר בפפילה, השתמש במלקחיים אחד של המלקחיים כדי לתקוע דרך הלבלב ורקמת החיבור ממש מתחת לצינור המרה וליד הפפילה הפועלת. במהירות, הניחו את המלקחיים דרך החור והכניסו תפר. באופן רופף. קשרו את התפר סביב צינור המרה ליצירת עיגול קטן באמצעות מלקחיים של 90 מעלות.

משוך את המעי הדק עד שצינור המרה הוא טאו. בצע חתך אופקי אחד על פני הפפילה עם מספריים עדינים במיוחד מבלי לעקור את צינור המרה מהפפילה תוך כדי החזקת המעי. הכנס צינורית לצינור המרה ולאחר מכן משוך בעדינות את התפר בחוזקה סביב הצינורית.

לאחר מכן, מלאו מזרק של שלושה מיליליטר ב -2.0 מיליליטר תערובת פרוטאז קולגנאז. הזריקו את התערובת הזו לתוך הצינורית בקצב איטי וקבוע. לאחר השלמת ניפוח הלבלב, הסר את הצינורית מצינור המרה.

החל מהמעי הגס היורד, גזור את רקמת החיבור תוך משיכת המעיים כלפי מעלה עד שמגיעים לצינור המרה. לאחר מכן, הפרד את הלבלב מהטחול ומהרקמות שמסביב. לבסוף, חותכים את התפרים ומסירים את הלבלב.

לאחר ההסרה, הכניסו את הלבלב לצינור של 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר HBSS על קרח. לאחר איסוף כל הדגימות, הנח כל צינורות של 50 מיליליטר המכילים רקמת לבלב לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. במשך 15 דקות, נענעו בעדינות את השפופרת ובדקו אם יש דיסוציאציה של רקמות.

ודא שהרקמה מתפרקת בקלות ומחזיקה את הצינור במכסה. סובב 12 פעמים כדי לנתק עוד יותר את הרקמה. הוסף לא יותר מ -30 מיליליטר HBSS וצנטריפוגה.

שאפו את הסופרנטנט בזהירות והשאירו כמות קטנה של סופרנטנט בתחתית כדי לא לשבש את פלטת התאים. בעזרת מזרק של 30 מיליליטר המחובר למחט בגודל 14, הוסף לא יותר מ-10 מיליליטר HBSS ושאף את המתלה למעלה ולמטה פעמיים. מסננים את תערובת התאים דרך מסננת T מפלסטיק לתוך צינור של 50 מיליליטר.

שוטפים עם עוד 10 מיליליטר, HBSS וצנטריפוגה. שפכו את הסופרנטנט והפכו את הצינורות לניקוז על מגבת נייר סופגת למשך דקה אחת. השעו מחדש כל צינור ב -10 מיליליטר.

קר 1100. הכיסוי האטום שלו, האטום שלו עם 10 מיליליטר, HBSS וצנטריפוגה. הסר את כל 20 מיליליטר הסופרנטנט באמצעות פיפטה גדולה של 25 מיליליטר והעביר את הסופרנטנט דרך מסנן הפוך של 70 מיקרון.

סנן את הלולאות ישירות לתוך צלחת פטרי ושטוף על ידי פיפטינג של 10 מיליליטר של מדיה לולאה דרך תרבית המסנן. הלולאות באינקובטור תרבית רקמה עד שהן מוכנות לניסויים. תפוקות לולאות, מורפולוגיה ואיכות הם הפרמטרים הכלליים המשמשים לשיפוט הצלחת בידוד העפעפיים.

מורפולוגיה אופיינית של לולאות מוצגת כאן. ללולאות צורה עגולה עד מלבנית עם גודל אחיד יחסית. הנה. לולאות מבודדות נותחו להפרשת אינסולין מגורה גלוקוז.

גירוי האינסולין היה דומה בין לולאות שהוכנו על ידי Sigma Type 11 בהשוואה ל-ci zyme TM, MABP מצביע על איכות גבוהה של הכנת לולאות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לקנולציה של צינור מרה של עכבר. עבדו עם קולגנאז zyme ופרוטאזות נויטרו כדי לבודד את העפעפיים שלכם לכל בדיקה.