Name: שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: למד שתי שיטות גנטיקה הפוכה לשחזור norovirus Murine זיהומי בתרביות תאים באמצעות שעתוק RNA וחשמול או ליפופקציה. שיטות אלו מאפשרות חקר מהימן של שכפול נורובירוס ופתוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי עמיתי הקרן Wellcome בכיר הוענק לאיאן גודפלו, וגם מארי קירי תוך אחוות האירופי (FP7 המועצה האירופית למחקר) הוענק ארמנדו אריאס. אנו רוצים להודות איו הונג צ&#39;ונג, ד&quot;ר רבקה וד&quot;ר רובי מייק סקינר שנתן לנו רשות להשתמש bioanalyser Agilent שלהם ולעזור בניהול דגימות רנ&quot;א.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li>
<li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis%2C+Avon%2C+England%2C+2002-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li>
<li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li>
<li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5%27-end+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li>
<li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).</li>
<li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5%27+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li>
<li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase%3A+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li>
<li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs%3A+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li>
<li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

כאן אנו הדגימו שתי גישות שונות גנטית הפוכה המאפשרים התאוששות MNV מדבקות תרבית תאים. שתי הגישות יעילות לעקוף את הדרישה מוחלטת הצמדה קוולנטית של VPg עד הסוף &#39;5 של הגנום RNA ויראלי באמצעות הדור של כתרים תמלילי MNV המוכרים מכן על ידי הריבוזומים הסלולר. ב שעתוק במבחנה ואחריו enzymatically מכסת יעיל יותר ההתאוששות של MNV זיהומיות מאשר שעתוק של פלסמידים זיהומיות בתאים המבטאים T7 רנ&quot;א פולימרז, שבו תעתיקי ניתן כתרים על ידי אנזימים FPV פיקוק. וירוס של הסרט התאושש עם מערכות אלה גנטיקה הפוכה דומים אלה שהושגו על ידי transfection של VPg צמודות רנ&quot;א נגיפי מטוהרים מן בתרביות תאים נגועים 17 (איור 5). Transfection של כתרים MNV RNA לתוך תאים Raw264.7 מתירנית הופך titre וירוס רק 1-log נמוך ניסויים הקשורים transfection של RNA הכולל תאים נגועים המכילים ויראלי VPg צמוד RNA (איור 5). עובדה זו מעודדת בדיקות נוספות כדי לקבוע אם תוספת של מולקולת VPg עד הסוף &#39;5 של תמלילי שנוצר על ידי מערכות אלה עלול לגרום עלייה בתשואות וירוס אשר עשוי לחשוף היבטים פונקציונליים שבבסיס infectivity MNV בתאים הקשורים VPg. עם זאת, אנו רואים במערכת זו גנטיקה הפוכה כמו 1 היעילה ביותר להשוות אחרים וירוסים RNA להפוך מערכות גנטיקה המשמש כיום שבו במבחנה RNA עיבד מאפשר התאוששות של הסרט רק 10-100 נמוך יותר מאשר זיהומים אמיתיים עם 19 virions, 20. בסך הכל, את שיטות הנוכחי מהווה צעד משמעותי קדימה בתחום של ביולוגיה מולקולרית norovirus לספק לנו את הכלים לחקור את התפקידים תפקודית של חלבונים ונשמר מוטיבים רנ&quot;א ב הגנום norovirus. גישות אלה כבר בשילוב עם גבמודל עכבר urrent זמין הראו כי MNV התאושש cDNA זיהומיות יכול לגרום לזיהום קטלני של&gt; 80% STAT1-/ - העכברים בתוך פחות מ -10 ימים 4, 21. תוך שימוש במערכת זו אנו התאוששו קיימא מוטציות norovirus Murine של החלבון capsid של מערכת polypyrimidine מעורב מחייב גורמים מארחים שונים (PTB ו PCBP) המציגים פנוטיפים נחלש מעט ב 21 vivo, 22. בנוסף, הראו לאחרונה כי וירוסים חסרי יכולת לבטא את החלבון VF1 מ ORF4 ביעילות לשכפל תרבית תאים אבל שוב צמצמו ארסיות בעכברים לגבי WT MNV 8. מחקרים אלו מעודדים אותנו לעצב גרסאות נחלש noroviruses של אדם בהתבסס על מחקרים MNV אשר יכול להיחקר כמועמדים פוטנציאליים לחיסון.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> ליתיום כלוריד משקעים פתרון </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA פתרון האחסון </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 התסריט </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G תקרת מערכת </td><td> Epicentre ביוטכנולוגיות </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Transfection ניאון מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Transfection ניאון מערכת הערכה </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM אני </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> 2000 Lipofectamine transfection מגיב </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 ננו ערכת </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 דוoanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA וטיהור ג&#39;ל ערכת Band </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX גדול Scale-RNA ייצור System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus murine זיהומיות

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Noroviruses האדם אחראים לרוב המקרים של גסטרואנטריטיס האנושי (GE) ברחבי העולם, הם הבעיה חוזרת בסביבות שבהן בקשר הדוק אדם אל אדם לא ניתן להימנע מכך 1, 2. בשנים האחרונות עלייה בשכיחות של התפרצויות בבתי חולים דווחה, לגרום לשיבושים משמעותיים והיכולת המבצעית שלהם, כמו גם הפסדים כלכליים גדולים. זיהוי של גישות אנטי החדשים הייתה מוגבלת בשל חוסר היכולת של האדם להשלים noroviruses זיהום פרודוקטיבי תרבית תאים 3. הבידוד לאחרונה norovirus Murine (MNV), קשורה קשר הדוק norovirus האנושי 4 אך ניתן מופצות בתאים 5 פתחה אפיקים חדשים לחקר אלה פתוגנים 6, 7. תוצאות MNV שכפול בסינתזה של הגנומי חדש במובן החיובי subgenomic מולקולות רנ&quot;א, האחרון שבהם מתאים תי האחרוןrd של הגנום הויראלי (איור 1). MNV מכיל ארבע מסגרות שונות הקריאה פתוחים (ORFs), מתוכם ORF1 מעסיק את רוב הגנום מקודד שבע ללא חלבונים מבניים (ns1-7) שוחרר מבית מבשר polyprotein. ORF2 ו ORF3 נמצאים בתוך האזור RNA subgenomic ו לקודד את החלבונים קפסיד (VP1 ו VP2, בהתאמה) (איור 1). לאחרונה, זיהינו כי ORF4 נוסף חופפים ORF2 אבל בתוך מסגרת קריאה שונה הוא פונקציונלי מקודד עבור גורם ארסיות המיטוכונדריה מקומי (VF1) 8. שכפול וירוסים תחושת חיוביות רנ&quot;א, כולל noroviruses, מתרחש בציטופלסמה וכתוצאה מכך סינתזה של הגנום חדשים הסיר את המיכסה RNA. כדי לקדם את התרגום ויראלית, וירוסים לנצל אסטרטגיות שונות שמטרתן גיוס חלבון הסלולר סינתזה מכונות 9-11. מעניין לציין, תרגום norovirus הוא מונע על ידי VPg רב תכליתיים חלבונים פריימר ויראליקשור קוולנטית לקצה &#39;5 של שני RNAs גנומית subgenomic 12-14. זה מנגנון מתוחכם של התרגום עשוי להיות גורם מרכזי היעילות המוגבלת של התאוששות ויראלי ידי הפוכה הגישות המקובלות גנטיקה. כאן אנו מדווחים על שתי אסטרטגיות שונות המבוססות על הדור של Murine norovirus-1 (המכונה MNV בזאת) תעתיקים כתרים בסוף &quot;5. אחת השיטות כרוכה הן סינתזה במבחנה מכסת של רנ&quot;א נגיפי, ואילו הגישה השנייה כרוכה שעתוק של MNV cDNA בתאים המבטאים T7 רנ&quot;א פולימרז. הזמינות של מערכות אלה גנטיקה הפוכה לחקר MNV ומודל חיה קטנה סיפקה יכולת חסרת תקדים לנתח את התפקיד של רצפים ויראליים שכפול בפתוגנזה 15-17.

Noroviruses הם אחד הגורמים העיקריים של הקיבה והמעיים עדיין בטכניקות מולקולריות לאפיון שלהם עדיין חדש יחסית. כאן אנו מדווחים על שתי גישות שונות גנטיקה הפוכה להתאוששות יעילה של norovirus Murine (MNV), הנציג היחיד של סוג זה אשר ניתן מופצות על תרבית תאים.

שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות

נורו-וירוסים אנושיים הם הגורם לרוב מקרי הגסטרואנטריטיס (GE) באנשים ברחבי העולם, והם מהווים בעיה חוזרת בסביבות שבהן קיימת קרבה...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיק נגיף neurovirus מזן mu eye זיהומי באמצעות שתי מערכות גנטיקה הפוכה. שלום, אני ארמנדו אריאס ממדור ה-Virology ב-Imperial College of London. בקבוצה שלנו, אנו מעוניינים לנתח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס השכפול של neurovirus.נורו-וירוסים הם גורם מרכזי לגסטרואנטריטיס. ברחבי העולם, טכניקות מולקולריות לאפיון שלהם הן עדיין חדשות יחסית. זיהוי גישות אנטי-ויראליות חדשות ותובנות לגבי מחזור החיים של הנורו-וירוס היו מוגבלים בשל חוסר יכולתם להשלים זיהום פרודוקטיבי בתרבית תאים.הבידוד האחרון של נגיף אנטי-ויראלי המסוגל להדביק עכברים ולהתרבות בתרבית תאים, דהיינו mirror neurovirus, פתח נתיבים חדשים לחקירת פתוגנים חשובים אלו. בדיווח זה, נדגים שתי אסטרטגיות המאפשרות יצירה של בידודים של neuro neurovirus המוגדרים גנטית בתרבית תאים. שתי האסטרטגיות מבוססות על יצירת תמלילי נגיף עם כובע (capped) בקצה ה-five prime.השלב הראשון כולל סינתזה של RNA ויראלי עם כיסוי (capping) in vitro לפני הטרנספקציה לתאים. הגישה השנייה כרוכה בשעתוק של cDNA של נורו-וירוס בתוך תאים המבטאים T7 RNA polymerase. סקירה כללית של הפרוצדורה. הפרוטוקול להשגת נורו-וירוס מתמליטי RNA עם כיסוי מתחיל בליניאריזציה.הפלסמיד המכיל את MV CD NA עבור mmv one. פעולה זו מבוצעת באמצעות אנזים ההגבלה NHE one. לאחר מכן, ה-DNA מתומלל in vitro ל-RNA באמצעות T seven RNA polymerase.לאחר מכן, ה-M-M-V-R-N-A עובר כapping in vitro ומוחדר (transfected) לתאים כדי לאפשר התאוששות של MMV זיהומי; התאוששות ישירה של MNV זיהומי באמצעות וירוס FAL PX המבטא T seven RNA polymerase. לצורך התאוששות של MMV משבטי cDNA שהוחדרו ישירות, התאים מודבקים תחילה עם וירוס FAL PX רקומביננטי המבטא T seven RNA polymerase. הדבקה ב-FAL PX תוביל לביטוי של T seven RNA polymerase וכן של אנזימי capping של RNA ויראלי שעשויים לבצע capping לחלק מה-RNA המסונתז. לאחר מכן, ה-M-M-V-C-D-N-A מוחדר לתאים המודבקים ב-FPV באמצעות transfection מתווך ליפידים. ה-T seven RNA polymerase מייצר אז את ה-M-M-V-R-N-A, שחלקו עשוי לעבור capping על ידי מנגנון ה-F-P-V-R-N-A capping.רצף של ריבوزים (ribozyme) מבטיח שכל תמליל RNA יכיל קצה 3' מוגדר. תמלילי MMV עם כיסוי (capped) יתורגמו לאחר מכן לחלבון לפני השכפול, מה שיוביל לייצור של חלקיקים זיהומיים חדשים. פרוטוקול לטרנסקריפציית RNA וכסויה להשגת MMV זיהומי, סינתזה של תמלילי MMV זיהומיים עם כיסוי.ראשית, ערבבו את הרכיבים הבאים: transcription buffer, נוקלאוטידים, מים ופלסמיד ליניארי המכיל את ה-M-M-V-C-D-N-A. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת התגובה RNA ו-T7 RNA polymerase. קיימות ערכות מסחריות רבות למטרה זו המספקות שיטה הדירה לסנתזת RNA.תגובת השעתוק מבוצעת על ידי דגירה של התערובת בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים לפחות. נתח מנה קטנה מתגובת שעתוק זו על ג'ל agarose שאינו דנטורנטי. ראשית, נקה את ציוד הג'ל באמצעות דטרגנט ושטף במים נקיים מ-RNA לפני השימוש.יש לוודא שג'לי האגרוז הוכנו באמצעות ריאגנטים נקיים מ-RNA. ה-M-V-R-N-A ירוץ בערך בשלושה קילו-בסיסים על ג'ל אגרוז לא דנטורטיבי. בנוסף, ניתן להשתמש ב-Agilent bioanalyzer כדי לספק שיטה מהירה לניתוח שלמות ה-RNA.יש לטהר את ה-RNA כדי להסיר נוקלאוטידים שלא נקשרו. קיימות שיטות רבות, אך בפרוטוקול זה, אנו מטהרים את ה-RNA על ידי שיקוע בליתיום כלוריד כחלופה חסכונית, ומשקיעים את ה-RNA באמצעות סבוב בצנטריפוגה במהירות מרבית למשך 15 דקות. יש להסיר את supernatant בזהירות כדי לא להפריע למשקע השקוף ולשטוף באמצעות 70% ethanol.יש להמיס מחדש את תמליל ה-MMV בתמיסה לאחסון RNA ולוודא שהוא מומס לחלוטין. חימום ה-RNA ל-65 °C עשוי לסייע בתהליך זה בשלב מאוחר יותר. יש לכמת את ה-RNA באמצעות ספקטרומטריה.נתחו את שלמות ה-RNA על ידי הרצת מנה קטנה בג'ל אגרוז 1% שאינו דנטורנטי. כפי שניתן לראות, שלמות ה-RNA לאחר שיקוע בליתיום כלוריד צריכה להישאר ללא שינוי כדי לשפר את יעילות ה-capping. חממו מנה של ה-RNA בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות.הנח את המבחנה מיד על קרח. כדי למנוע דגרדציה או קיפול מחדש, הכן תערובת תגובה לסגירה (capping) כפי שהמליץ היצרן. בדרך כלל אנו מוסיפים כ-60 micrograms של M-N-V-R-N-A לתגובה סופית של 100 microliters.למרות שניתן להקטין את קנה מידה של התגובה, יש לערבב היטב ולהדגיר ב-37 degrees למשך שעה אחת, ולאחר מכן לטהר את ה-RNA באמצעות שיקוע של ליתיום כלוריד כפי שבוצע קודם לכן. חיוני לבדוק שוב את שלמות ה-RNA לפני ההמשך לטרנספקציה. פרוטוקול שלבי להשבת MMV באמצעות אלקטרופורציה של RNA לתאי raw cells. Resus.שעלו את התאים הגולמיים שבבקבוק לתוך DMEM. ודאו שנוצר תרחיף של תאים בודדים. קבעו את ריכוז התאים החיים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer) בשיטת הדחייה של trypan blue.יש להשקיע את התאים באמצעות צנטריפוגה ולפתוח אותם בזהירות. יש להשעותם באליקוטיות של מצע טרי נטול אנטיביוטיקה בריכוז של 8 מיליון תאים לטרנספקציה ולהשקיעם במיקרו-צנטריפוגה. יש להסיר את המצע ולשטוף את התאים ב-500 microliters של PBS, לצנטריפוגה שוב ולהסיר את ה-PBS, ולאחר מכן להשעות את התאים ב-130 microliters של תמיסה בטמפרטורת החדר.תמיסת ריסוס (resus) של Neon. הוסיפו את הכמות המתאימה של RNA מסומן, בדרך כלל 1.3 micrograms ל-130 microliters של תאים, שווה ערך ל-one microgram של RNA ל-6 מיליון תאים. תאים המעורבבים עם תסריטים (transcripts) נאספים לתוך קצה הטרנספקציה של neon בנפח 100 microliter.יש להקפיד מאוד לא להחדיר בועות בשלב זה. לאחר מכן, בצעו אלקטרופורזה באמצעות פולס בודד של 1700 volts למשך 25 milliseconds. העבירו את התאים למבחנה מסוג Eppendorf המכילה 1 ml של מצע ללא אנטיביוטיקה.חלק את התאים מהמבחנה לבארות נפרדות המכילות DMEM ללא אנטיביוטיקה עם 10% FCS והדגר את התאים ב-37°C למשך 24 עד 72 שעות. התאוששות של MMV באמצעות ליפופקציה של RNA לתאי BSR T7 כפי שבוצע קודם לכן. תמלili MMV נוצרים על ידי לינאריזציה של פלסמיד MMV cDNA, תמלול in vitro באמצעות T7 polymerase וסימון כובע (capping) in vitro; התמלילים מועברים לאחר מכן לתאי BSR T7 באמצעות ליפופקציה. בצע טריפסין לשכבה אחת של תאי BSR T7 וזראה 7.5 × 10⁵ תאים חיוניים לתוך פלטות של 6 בארות.דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. הסירו את המצע מהתאים והחליפו אותו ב-3 mL של מצע טרי ללא אנטיביוטיקה. כדי להבטיח יעילות טרנספקציה מקסימלית, ערבבו 1-2 µg של capped M-M-V-R-N-A עם 100 µL של optimum.ערבבו בנוסף 4 µL של lipectomy 2000 עם 100 µL של optimum. שלבו את הדגימות המכילות RNA ו-lipectomy וערבבו אותן היטב באמצעות שאיבה ופליטה (pipetting) 15 פעמים. השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.לאחר מכן, הוסיפו את קומפלקסי הטרנספקציה המכילים תמלילי MMV עם כיסוי (capped) לשכבת התאים באופן מדורג (dropwise). נערו את הפלטה בכיוונים ניצבים. דגרו את התאים למשך 24 עד 72 שעות.פרוטוקול להשגה ישירה של MMV זיהומי מ-CDNA בתאים המבטאים T7 RNA polymerase כפי שתואר קודם לכן. פרוטוקול זה מבוסס על ביטוי של T7 RNA polymerase ואנזימי capping של נגיף oxx בתאים שהודבקו בעזרת נגיף oxx. לאחר מכן, M-N-V-C-D-N-A תחת בקרה של פרומטור T7 מותמר (transfected) לתוך התאים.ראשית, הסר את מצע גידול התאים והוסף לכל באר 700 µL של נגיף F pox המדולל במצע ללא אנטיביוטיקה. בדרך כלל נעשה שימוש בריבוי זיהום (multiplicity of infection) של כ-0.5 PFU לתא; נער את הפלטות בתנועה ניצבת והדגר למשך שעה אחת ב-37 °C. לאחר מכן, הוסף 2 mL של מצע ללא אנטיביוטיקה והדגר את התאים למשך שעה נוספת ב-37 °C כדי לאפשר ביטוי של T7 RNA polymerase MNV CG NNA transfection; הסר את המצע מהתאים המזוהמים והוסף 3 mL של מצע טרי ללא אנטיביוטיקה.הכינו תערובת של 1 µg של M-M-V-C-D-N-A וליפקטומי (lipectomy) כפי שהוסבר בסעיף הקודם. ערבבו היטב באמצעות פיפוט מעלה ומטה. השאירו את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן ערבבו שוב והוסיפו טיפות למסכי התאים (cell monolayer).נער את הפלטה בעדינות בכיוונים ניצבים. דגרו את התאים ב-37 degrees למשך 24 עד 72 שעות כדי לאשר את השחזור של MMV זיהומי באמצעות גישות הגנטיקה ההפוכה השונות המוצגות במהלך סרטון זה. שחררו וריונים זיהומיים מהתאים באמצעות הקפאה והפשרה חוזרים. קבעו את הכמות בכל דגימה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים כגון TCID 50 או בדיקת פלאקים (plaque assay) לתוצאות מייצגות.הזמינות של מערכות גנטיקה הפוכה אלו למחקר של mi Neurovirus סיפקה יכולת חסרת תקדים לנתח את תפקידם של רצפים ויראליים בשכפול של neurovirus ובפתוגנזה שלו במארח הטבעי. שתי גישות הגנטיקה ההפוכה המוסברות בסרטון זה יעילות ביותר לשחזור של neuro ו-neurovirus זיהומיים בתרבית תאים. כפי שמוצג באיור זה.במקרה של MMV זיהומי, התארים העולים על 10⁵ TCID₅₀ למ"ל התאוששו לאחר טרנספקציה של תמלילי MMV עם כובע (capped) לתאים גולמיים או לתאי BSRT7. טרנספקציה של MMV-cDNA לתאי BSRT7 שזוהמו בעבר בעזרת fowlpox virus הביאה לתרים ויראליים העולים על 10⁴ TCID₅₀ למ"ל. תארים ויראליים שהושגו בגישות של גנטיקה הפוכה דומים לתארים שהחולצו בטרנספקציה של RNA שבודד מנגיף זיהומי, מהמדגיש את היעילות הגבוהה של מערכות הגנטיקה ההפוכה המתוארות כאן.

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

צעד אחד RT-PCR assay לגילוי וזיהוי genogroup של מבודד norovirus מ כיסאות ילדים, אשר מנצל primers ו בדיקות TaqMan ספציפיים מסגרת קריאה פתוחה 1 (ORF1)-ORF2 באזור צומת, האזור משומר רוב הגנום norovirus הוא תיאר. לא מסחרי, חסכונית שיטת מיצוי RNA הוא מפורט.

איתור Genogrouping של Noroviruses מ שרפרפים לילדים עד Taqman צעד אחד RT-PCR

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

כאן אנו מתארים שיטה לכמת חלקיקים זיהומיות של norovirus העכברי (MNV), שהוא היחיד שיעילות norovirus משכפל בתרבות תא. Assay פלאק מנצל הכמיהות של MNV למקרופאגים Murine ויכול להיות מותאם לשימוש עם דגימות ביולוגיות או סביבתיות המכילות MNV.

Assay רובד לnorovirus Murine

מקור: Leuthold, M. M., et al. ייצור תחומים בולטים של נורו-וירוס אנושי ב - E. coli לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. J. Vis. Exp. (2016).סרטון זה מדגים את הטיהור של תחום נורו-וירוס אנושי רקומביננטי P באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, תוך הדגשת ההפרדה של חלבון המטרה מזיהומים בעלי משקל מולקולרי גבוה ונמוך יותר בהתבסס על נגישות נקבוביות דיפרנציאלית. התהליך מנוטר על ידי ספיגת UV ומאושר באמצעות ניתוח SDS-PAGE של שברים שנפלטו.

טיהור חלבוני תחום P רקומביננטיים שמקורם בחיידקים של נורו-וירוס אנושי

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה בשורות תאי ה-FDA (Vero) לפיתוח חיסון מספק אפשרויות חדשות לייצור חיסונים יעילים ובטוחים כדי להילחם Arenaviruses פתוגניים אדם.

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

כאן אנו מציגים הליך לכימות אנטרו-וירוס ונורו-וירוס במי סביבה ושתייה באמצעות PCR כמותי של שעתוק הפוך. התאוששות הנגיף הממוצעת ממי תהום עם הליך סטנדרטי זה משיטת EPA 1615 הייתה 20% עבור נגיף הפוליו ו-30% עבור נורו-וירוס עכברים.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

שיטות איתור שגרתית ניצול גנום ויראלי הגברה מוגבלים על ידי חוסר יכולתם להפלות זיהומיות של חלקיקים שאינן זיהומיות. מטרת מאמר זה נועד לספק נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור שיטות אלטרנטיביות לסייע אפליה של חלקיקים norovirus זיהומיות באמצעות איגוד aptamer, פיזור אור דינאמי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת את הכריכה של הפתוגן איקריוטית האנושי הנגיף כדי חיידקים. לאחר ביצוע הראשונית וירוס חיידק הקובץ המצורף, הזרימה cy, לנסות לזהות חיידקים מאוגדים וירברית בתוך האוכלוסייה.

כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

למד שתי שיטות גנטיקה הפוכה לשחזור norovirus Murine זיהומי בתרביות תאים באמצעות שעתוק RNA וחשמול או ליפופקציה. שיטות אלו מאפשרות חקר מהימן של שכפול נורובירוס ופתוגנזה.

שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות

גלה סרטונים נוספים