ייצור ושימוש של microarrays Microenvironment (MEArrays)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את ההשפעות של מיקרו-סביבות שונות על תפקודים תאיים של סוגי תאים דבקים על ידי חשיפתם במקביל לאוסף מגוון של מיקרו-סביבות קומבינטור. זה מושג על ידי ייצור מצעי הדפסה לתמיכה בספיגה של תערובות של חלבונים מיקרו-סביבתיים. לאחר מכן מכינים לוחות אב של חלבונים מיקרו-סביבתיים, המשמשים להדפסת מערכי ME באמצעות רובוט הדפסת מיקרו-מערך סיכות או נימי.

לאחר מכן מכינים צלחות מאסטר של חלבונים מיקרו-סביבתיים. לאחר מכן תאים דבקים מתורבתים במערך ME עם אפשרות להגביל את מספר התאים. התוצאות שהתקבלו מראות את ההשפעה של המיקרו-סביבות השונות על תפקודים תאיים כגון התמיינות או התפשטות בהתבסס על ניתוח אימונופלואורסצנטי.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשרצינו לכמת את ההשפעות של מיקרו-סביבות רקמה על החלטות גורל תאי גזע של זיכרון אנושי, אך הבנו שעבודה in vivo היא בלתי אפשרית. כעת, לאחר שהוא פותח, יש לו יישומים רבים בביולוגיה של התא, מחקר וגילוי תרופות. PDMS משמש כמצע המחקה רקמות נוקשות יותר מכיוון שהוא זול, קל להכנה וקל להדפסה.

עם זאת, הידרופוביות PDMS יכולה להפוך אותו לבלתי תואם לקווי תאים מסוימים כאשר עובדים עם PDMS נעשה. כפפות שאינן לטקס כמו לטקס יכולות לעכב פילמור PDMS. כדי להתחיל בכוס פלסטיק חד פעמית, שלב בסיס אלסטומר סיליקון סיגר 184 עם חומר הריפוי ביחס של 10 לאחד וערבב אותו במרץ עם מדכא לשון מעץ או פלסטיק.

לאחר מכן, הסירו את התערובת בפעמון ואקום בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כעת מרכז שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית על צ'אק הוואקום המופעל של ספין קואר, ואז טפטף 0.5 מיליליטר של פולימר האלסטומר המעורב על מרכז משטח ההחלקה וציפוי סיבוב ב-6,000 סל"ד למשך 60 שניות. רפאו את השקופיות המצופות PDMS ב-70 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות עד לילה.

ניתן לאחסן את המגלשות אטומות לאוויר בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים. PA הוא הידרוג'ל שיכול לחקות רקמות רכות יותר בטווח על תאי PA יתחבר רק למקומות שבהם יש חלבונים התומכים בהידבקות התאים. התחל בתחריט שקופיות עם נתרן הידרוקסיד.

הניחו את השקופיות על גוש חום בחום של 80 מעלות צלזיוס. זרוק מיליליטר אחד של 0.1 נתרן הידרוקסיד רגיל על כל שקופית. הקפד לכסות את כל משטח ההחלקה או שהרשות תיכשל.

הניחו לנתרן הידרוקסיד להתאדות ולהשאיר סרט לבן. חזור על תהליך זה אם המשטח אינו מכוסה לחלוטין. ניתן לאחסן את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך מספר ימים במידת הצורך.

לאחר מכן, מצפים את השקופיות עם PES במכסה אדים. מניחים שקופיות בכלי של 15 מיליליטר. הוסף 300 מיקרוליטר של PES על כל שקופית חרוטה של נתרן הידרוקסיד.

תן ל-A PES להגיב עם שקופיות הנתרן הידרוקסיד למשך חמש דקות בדיוק. לא יותר. שטפו היטב את ה-A PES במים נטולי יונים פעמיים-שלוש משני צידי המגלשות.

אחרת, הוא יתחמצן ליצירת משקע חום על השקופיות בשלב הבא. כעת שאפו את כל הפתרונות ממשטחי השקופיות לכל מנה. הוסף 25 מיליליטר של 0.5% גלוטרלדהיד ב-PBS.

הניחו את השקופיות בחושך והמתינו 30 דקות. לאחר 30 דקות, שאפו את כל תמיסת הגלוטרלדהיד ממשטח המגלשה. לאחר מכן יבש את השקופיות בזהירות באמצעות נייר סופג נטול מוך.

כעת ניתן לאחסן את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך הלילה במידת הצורך. לאחר הכנה והסרת הגז של תערובות ה-PA, הניחו אותן על קרח כדי להאט את הפילמור שלהן. רגע לפני הכנת השקופיות לכל תערובת על קרח, מוסיפים אמוניום לכל סולפט וטמיד ומערבבים אותם בעזרת פיפטה למשך חמש עד 10 שניות.

כעת פיפטה את תערובת הרשות הפלסטינית על משטחי השקופיות. כמות ה-PA משתנה בהתאם לקשיות הג'ל הנדרשת. לאחר מכן הנח החלקות כיסוי זכוכית על גבי הרשות מבלי להפעיל לחץ כלשהו כדי למנוע היווצרות בועות.

הניחו לג'ל PA להתפלמר במשך שעתיים ולאחר מכן הסירו את החלקות הכיסוי מתחת למים נטולי יונים. שטפו את שקופיות הג'ל של PA במים בצנצנות קופלאן גדולות למשך הלילה. כדי להסיר את האקרילאמידים הלא מגיבים למחרת, יבש את השקופיות עד שג'ל PA מתקשה לחלוטין.

לאחר מכן ניתן לאחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס למשך חודש בקופסת שקופיות אטומה. כדי להתחיל, מותקן תא פלסטיק כדי להקיף את המערך המודפס ממגלשה דו-קאמרית. הסר את התאים וחתך אותם לשניים בעזרת סכין גילוח.

השתמש בקצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי למרוח חרוז דק של סיליקון אקווריום על קצה החדר ולחץ אותו על פני השטח של מערך אמי. הימנע מלגעת בסיליקון בכל חלק מתכונות המערך. הבטחת חיבור טוב של הלווייתנים התרבותיים למערך האמי היא חיונית מכיוון שהלווייתנים מאפשרים למדיה לדלוף מהתאים, מה שעלול לגרום למוות נרחב של תאים.

עבור שקופיות מצופות PDMS, חסום את השקופיות על ידי דגירה שלהן במי 1% onic F 108 למשך 15 דקות בוואקום לכל אחד מסוגי הג'ל, שטוף את המערכים במצע תרבית תאים עם אנטיביוטיקה שלוש פעמים למשך חמש דקות לכל שטיפה. זה מסיר מונומרים לא תגובתיים, שעלולים להיות רעילים לתאים במקרה של ג'ל PA. לאחר הכביסה השלישית, אפשר 30 דקות נוספות של דגירה במדיה כדי להחזיר לחות לג'ל.

כעת הניחו ארבעה עד חמישה מערכים בצלחת פטרי סטרילית בגודל 15 סנטימטרים. למנה, הוסף מחצית מנפח המדיה הסופי עם התאים המעניינים בריכוז הנדרש ליישומם. יש למקם מערכי ME באינקובטור המתאים לתחזוקה של סוג התא בו נעשה שימוש.

בדוק אם יש חיבור אחיד של התאים לתכונות המודפסות במיקרוסקופ כל 15 עד 20 דקות תוך כדי התבוננות. נער בעדינות את מערכי ה-ME כדי להבחין בין תאים מחוברים וצפים. זמן ההתקשרות ישתנה, אך בדרך כלל הוא מושלם תוך שעתיים במערך ME מקודד PA.

לאחר הגעה לרוויה של החיבור או למגבלת זמן, שאפו את התאים הלא קשורים ומלאו את הצלחת עד לנפח הסופי במערכי ME מצופים PDMS. הסרת כל המדיה תהרוג את התאים. לכן, עבור כל שינויי המדיה בשקופיות אלה, החלף ברצף מחצית מנפח המדיה ולאחר מכן מלא את הכלי בנפח הסופי.

תרבית יכולה להימשך ימים רבים עם שינויי מדיה רגילים. מקבעים נפוצים כגון פרפורם, אלדהיד ומתנול אצטון תואמים למערכות מערך האמי. אל תשכח שגם כאשר מכתימים מצופה PDMS, מערכי ME חייבים להישאר רטובים.

אז המשך בטכניקת החלפת חצי הנפח להכנת שקופיות של מערכי ME המוכתמים. השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את התאים ולהרכיב החלקות כיסוי באמצעות פלורה. חלבון Mount G הופקד על מערך ME מקודד PDMS מודפס באמצעות סיכות סיליקון מרובעות על סיכת קולמוס.

תצהיר רובוט להדפסת מיקרו-מערך של חלבונים שונים אומת על ידי אימונופלואורסצנציה באמצעות נוגדנים. דילולים של תמיסות החלבון בלוח המאסטר שיקפו את הכמות שהופקדה על תאי פני השטח של שכבות ההדפסה המחוברים לתכונות המודפסות בצורה דפוסית ברורה. באופן דומה, אותו דפוס ברור של חיבור תאים מתרחש כאשר מערך אמי מודפס בסולם של 40,000 מעברים.

ג'ל PA שני חלבוני מיקרו-סביבה עוררו פרופילי ביטוי קרטין תלויי ריכוז בקו תאי אב אפיתל חלביים רב-פוטנטיים אנושיים. יחס הלוג של שמונה אותות קרטין לאותות קרטין 14 ממחיש את השונות והשחזור של האות. לאחר 24 שעות של תרבית, תאים לא קשורים נשטפים בניתוח של 12 מערכי me.

נעשה שימוש בניתוח סטטיסטי סטנדרטי כדי לקבוע אם הדילולים השונים של קולגן מסוג 1 ו-p cadherin אנושי רקומביננטי עולים שינויים בביטוי הקרטין. בתחילה, לא הייתה שונות מהממוצע בין התאים בתכונות מיד לאחר ההצמדה. עם זאת, לאחר 24 שעות ריכוזי קולגן גבוהים מסוג 1 גרמו לביטוי גבוה יותר של קרטין 8 באופן משמעותי.

בעוד שריכוזי PCA גבוהים כאן עוררו אות קרטין 14 חזק. ממצא זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על תאי אב זיכרון דו-עוצמתיים. בשל האופי הדינמי וההדדי של אינטראקציות מיקרו-סביבה תאיות אלה, תאים אלה עצמם יכולים לשנות את הרכב המיקרו-סביבות המודפסות.

לכן, כדי להבין את ההשפעות החריפות של המיקרו-סביבות שהדפסת, זמן החשיפה לא יעלה על 48 שעות לאחר הליך זה. כל תהליך תיאורטי שניתן למדוד, פלואורסצנטי או כאלי יכול להיות נכס כפונקציה של מיקרו-סביבה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד מיקרו-סביבות שונות משנות את התגובות לתרופות בקווי סרטן? זה עיקרי על ידי שינויים בפטוזיס ובהתפשטות.

או כיצד מיקרו-סביבות משנות את התמיינות האבות.