ייצור ושימוש של microarrays Microenvironment (MEArrays)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את ההשפעות של מיקרו-סביבות שונות על תפקודים תאיים של סוגי תאים נצמדים, על ידי חשיפתם במקביל לאוסף מגוון של מיקרו-סביבות קומבינטוריות. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור של מצעי הדפסה התומכים בספיגה של תערובות של חלבונים מיקרו-סביבתיים. לאחר מכן מוכנות לוחיות מאסטר של חלבונים מיקרו-סביבתיים, המשמשות להדפסת מערכי ME באמצעות רובוט להדפסת מערכי מיקרו-סיכות מסוג quill או capillary.

בשלב הבא מכינים פלטות מאסטר של חלבונים מיקרו-סביבתיים. לאחר מכן, מגדלים תאים נצמדים על מערך ה-ME, עם אפשרות להגבלת מספר התאים. התוצאות המתקבלות מראות את השפעת הסביבות המיקרו-סביבתיות השונות על תפקודים תאיים, כגון דיפרנציאציה או פרוליפרציה, בהתבסס על ניתוח אימונופלואורסצנציה.

הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר ביקשנו לכמת את השפעותיהם של מיקרו-סביבות רקמה על החלטות לגבי גורלן של תאי גזע של הזיכרון האנושי, אך הבנו כי עבודה in vivo אינה אפשרית. כעת, לאחר שפותחה, יש לה יישומים רבים בביולוגיה של התא, במחקר ובגילוי תרופות. PDMS משמש כמצע המדמה רקמות קשיחות יותר, היות שהוא זול, קל להכנה וקל להדפסה.

עם זאת, ההידרופוביות של PDMS עלולה להפוך אותו לבלתי תואם עם קווי תאים מסוימים בעת עבודה עם רכיבי PDMS. יש להשתמש בכפפות ללא לטקס, מכיוון שלטקס עלול לעכב את הפולימריזציה של ה-PDMS. כדי להתחיל, ערבבו בכוס פלסטיק חד-פעמית בסיס אלסטומר סיליקון מסוג SYLGARD 184 עם חומר המקשה ביחס של 10 ל-1, וערבבו בעוצמה באמצעות מדחף לשון מעץ או מפלסטיק.

בשלב הבא, יש לבצע ניקוי גזים (degassing) לתערובת בפעמון ואקום בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כעת, מרכזו שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית על גבי תפסן הוואקום המופעל של מכשיר Spin Coater, לאחר מכן טפטפו 0.5 milliliters של פולימר האלאסטומר המעורב למרכז פני השקופית ובצעו ציפוי ספין (spin coating) במהירות של 6,000 RPM למשך 60 שניות. יש להקשות את השקופיות המצופות ב-PDMS בטמפרטורה של 70 °C למשך ארבע שעות או עד למשך הלילה.

ניתן לאחסן את השקופיות באטימה להוויר בטמפרטורה של החדר למשך מספר חודשים. PA הוא הידרוג'ל שיכול לחקות רקמות רכות בטווח שבו תאים של PA ייצמדו רק לנקודות שבהן קיימים חלבונים התומכים בהיצמדות תאים. התחל בתעשיית השקופיות באמצעות נתרן הידרוקסיד.

הניחו את השקופיות על בלוק חימום בטמפרטורה של 80 °C. טפטפו מיליליטר אחד של נתרן הידרוקסיד 0.1 normal על כל שקופית. ודאו כי כל שטח השקופית מכוסה, אחרת ה-PA ייכשל.

הניחו לסודיום הידרוקסיד להתאדות עד להשארת שכבה לבנה. חזרו על תהליך זה אם הפני השטח אינם מכוסים לחלוטין. ניתן לשמור את הזכוכית בטמפרטורת החדר למשך מספר ימים במידת הצורך.

בשלב הבא, יש לצפות את העגילות ב-PES בתוך מ常用的 מנדף. מקמו את העגילות בצלחת של 15 milliliter. הוסיפו 300 microliters של PES על כל עגילה שנצרבה בנתרן הידרוקסיד.

הניחו ל-APES להגיב עם שקופיות הסודיום הידרוקסיד למשך חמש דקות בדיוק. לא יותר מכך. שטפו את ה-APES ביסודיות במים דה-יוניים שתיים עד שלוש פעמים משני צידי השקופיות.

אחרת, הוא יתחמצן ויהווה משק了一种 חום על השקופיות בשלב הבא. כעת, שאבו את כל התמיסות ממשטחי השקופיות לכל צלחון. הוסיפו 25 milliliters של 0.5%glutaraldehyde ב-PBS.

הניחו את השקופיות בחושך והמתינו 30 דקות. לאחר 30 דקות, שאבו את כל תמיסת הגלוטראלדהיד מפני השטח של השקופית. לאחר מכן ייבשו את השקופיות בזהירות באמצעות נייר סופג ללא סיבים.

ניתן כעת לאחסן את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך הלילה במידת הצורך. לאחר הכנת תערובות ה-PA וניקוז הגזים מהן, יש להניחן על קרח כדי להאט את הפולימריזציה שלהן. ממש לפני הכנת השקופיות לכל תערובת על קרח, יש להוסיף ammonium per sulfate ו-temid ולערבב אותם באמצעות פיפטה במשך 5 עד 10 שניות.

כעת טפטפו באמצעות פיפט את תערובת ה-PA על פני השטח של העגלה. כמות ה-PA משתנה בהתאם לקשיחות הג'ל הנדרשת. לאחר מכן, הניחו כיסויי זכוכית מעל ה-PA ללא הפעלת לחץ, כדי למנוע היווצרות בועות.

הניחו לג'ל ה-PA להתבלגנת במשך שעתיים ולאחר מכן הסירו את כיסיי הזכוכית תחת מים דאיוניים. שטפו את שקופיות ג'ל ה-PA במים בתוך צנצנות Coplan גדולות למשך הלילה. כדי להסיר אקרילאמידים שאינם פעילים, ייבשו את השקופיות למחרת עד שג'ל ה-PA יתקשה לחלוטין.

ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חודש בתיבת שקופיות אטומה. ראשית, מותאם תא פלסטיק כך שיקיף את המערך המודפס משקופית בעלת שני תאים. הסירו את התאים וחתכו אותם לחצי באמצעות להב תער.

השתמשו בטיפ של פיפט של 1 ml כדי למרוח פס דק של סיליקון לאקווריום על קצה התא והדביקו אותו לפני השטח של מערך Emmy. הימנעו ממגע של הסיליקון עם כל אחד ממאפייני המערך. הבטחת היצמדות טובה של דפנות התרבית למערך ה-Emmy היא קריטית, מכיוון שדפנות לא צמודות מאפשרות למצע לדלוף מהתאים, דבר שעלול להוביל למות תאים נרחב.

עבור שקופיות מצופות PDMS, חסמו את השקופיות על ידי הדגרה שלהן ב-1% onic F 108 מימי במשך 15 דקות תחת ואקום עבור כל אחד מסוגי הג'ל; שטפו את המערכים עם מצע תרבית תאים עם אנטיביוטיקה שלוש פעמים, למשך חמש דקות לכל שטיפה. פעולה זו מסירה מונומרים שאינם תגובתיים, שעלולים להיות רעילים לתאים במקרה של ג'לי PA. לאחר השטיפה השלישית, המתינו ל-30 דקות נוספות של הדגרה במצע כדי להמחיא את הג'ל.

כעת הניחו ארבעה עד חמישה מערכים בתוך צלחת פטרי סטרילית של 15 סנטימטרים. הוסיפו לצלחת מחצית מנפח המדדי הסופי עם התאים הרלוונטיים בריכוז הנדרש ליישומם. יש להניח מערכי ME באינקובטור המתאים לתחזוקת סוג התאים שבהם נעשה שימוש.

בדקו תחת מיקרוסקופ את ההיצמדות האחידה של התאים למבנים המודפסים מדי 15 עד 20 דקות במהלך התצפית. נערה בעדינות את מערכי ה-ME כדי להבחין בין תאים היצמדו לתאים צפים. זמן ההיצמדות ישתנה, אך בדרך כלל הוא נמשך כשעתיים במערך ME מקודד PA.

לאחר הגעה לרוויית היצמדות או לאחר תום פרק הזמן שנקבע, שאבו את התאים שאינם קשורים ומלאו את הצלחת לנפח הסופי במערכי ME מצופים ב-PDMS. הסרה מוחלטת של כל המצע תהרוג את התאים. לכן, עבור כל החלפת מצע בגלשיות אלו, החליפו בהדרגה מחצית מנפח המצע ולאחר מכן מלאו את הצלחת לנפח הסופי.

ניתן להמשיך בגידול במשך מספר ימים עם החלפות מדיה רגילות. מקבעים נפוצים כגון paraform, aldehyde, ו-methanol acetone תואמים למערכות ה-Emmy array. זכרו שגם בזמן צביעה, מערכי ME מצופים ב-PDMS חייבים להישאר רטובים.

המשיכו בטכניקה של החלפת חצי הנפח כדי להכין שקופיות של מערכי ה-ME הצבועים. השתמשו בלהב תער כדי להסיר את התאים והדביקו זכוכיות כיסוי באמצעות flora. חלבון G הופקד על מערך ME מודפס ומקודד ב-PDMS באמצעות פינים סיליקוניים בעלי קצה מרובע על גבי quill pin.

השקעה של חלבונים שונים על ידי רובוט הדפסת מיקרו-מערכים אומתה באמצעות אימונופלואורסצנציה בעזרת נוגדנים. הדילולים של תמיסות החלבון בלוח המאסטר שיקפו את הכמות שהושקעה על פני השטח של תת-הנשאי להדפסה; תאים נצמדו לתבניות המודפסות באופן דפוסוסי ברור. באופן דומה, אותו דפוס ברור של היצמדות תאים מתרחש כאשר מערך Emmy מודפס בקנה מידה של 40,000 מעברים.

שני חלבונים של מיקרו-סביבה ב-PA gel עוררו פרופילים של ביטוי קרטין תלויי-ריכוז בשורת תאים של תאי אב אפיתליאליים של השד בעלי פוטנציאל רב-כווני באדם. יחס הלוגריתם של אותות קרטין 8 לאותות קרטין 14 ממחיש את השונות ואת השחזוריות של האות. לאחר 24 שעות של תרבית, תאים שאינם קשורים נשטפים בניתוח של 12 מערכי me.

נעשה שימוש בניתוחים סטטיסטיים סטנדרטיים כדי לקבוע האם הדילול השונים של קולגן מסוג 1 ו-p-cadherin אנושי רקומביננטי גורמים לשינויים בביטוי קרטין. בתחילה, לא נצפתה שונות מהממוצע בין התאים על המבנים מיד לאחר ההיצמדות. עם זאת, לאחר 24 שעות, ריכוזים גבוהים של קולגן מסוג 1 עוררו ביטוי גבוה באופן מובהק של קרטין 8.

בעוד שריכוזים גבוהים של PCA גרמו לאות חזק של keratin 14. ממצא זה עקבי עם דיווחים קודמים על תאי פרוגניטור זיכרון דו-פוטנציאליים. בשל הטבע הדינמי וההדדי של אינטראקציות אלו עם מיקרו-סביבת התאים, תאים אלו יכולים לשנות בעצמם את הרכב המיקרו-סביבות המודפסות.

לפיכך, כדי להבין את ההשפעות האקוטיות של המיקרו-סביבות שהדפסתם, זמן החשיפה לא יעלה על 48 שעות לאחר ביצוע הליך זה. ניתן לבחון כל תהליך תאי הניתן למדידה, באופן פלואורסצנטי או כימי, כפונקציה של המיקרו-סביבה במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון: כיצד מיקרו-סביבות שונות משנות תגובות לתרופות בקווי תאים של סרטן? ניתן למדוד זאת באמצעות שינויים באפופטוזיס ובשגשוג תאים.

או כיצד מיקרו-סביבות משנות את הגבשת התאים הפרוגניטורים.