Name: Transfection נוגדן לנוירונים ככלי ללימוד פתוגנזה מחלות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למדו שיטת טרנספקציה של נוגדנים לתאי עצב חיים לחקר אינטראקציות מולקולריות במחלות נוירולוגיות. שיטה זו מאפשרת הדמיית השפעות נוגדנים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ומייעלת מחקר בנוירואימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי משרד המחקר והפיתוח, מחקר רפואי שירות, מחלקה לענייני יוצאי הצבא. מחקר זה מומן בפרס הצטיינות VA סקירה (לMCL) ואוניברסיטת טנסי קרן למדעי בריאות במרכז לחקר טרשת נפוצה על ידי.

1. תיוג נוגדן (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 0.1 3 חיץ NaHCO M: <ul type="circle" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8.4 גרם NaHCO 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 29.2 גרם NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 הליטר H 2 O </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את המאגר לרמת חומציות של 8.4 עם הפתרון הזה (10.6 גרם Na 2 3 CO, 29.2 גרם NaCl, 1 הליטר H 2 0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 35 Atto550 NHS μl לאנטי hnRNPA1 ו500 3 חיץ μl μl 70 NaHCO ולסובב לשעה 1 בטמפרטורת חדר. אחרי הסיבוב באורך שעה, להזריק את התערובת לתוך dialyzer ודיאליזה ב2 ליטר של PBS בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לרכז את Atto550 NHS אנטי hnRNPA1-דיאליזה באמצעות עמודת ספין (Amicon Ultra 0.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר Atto550 NHS כותרת הנוגדן אנטי hnRNPA1 כבר מרוכז, ננו טיפת מדגם כדי לקבוע את הריכוז. </li></ol> 2. Transfection נוגדן (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 10 5 תאים / גם לתוך 500 μl של Dulbecco השינוי של הנשר הבינוני (+1% אנטיביוטיקת FBS DMEM/F12 +10%) בשקופית 24 שעות גם 8 לפני transfection. confluency תא צריך להיות לפחות 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרים וארבע שעות לאחר זריעה, להוסיף 2 μl של ריאגנט Ab-סחורה בלתוך צינור אפנדורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, להוסיף 2 מיקרוגרם של Atto550 NHS כותרת הנוגדן אנטי hnRNPA1 (0.5 מיקרוגרם / μl) לאותו הצינור אפנדורף ודגירה 10-15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, לשאוב תקשורת ולהוסיף 394 μl של תקשורת DMEM הטריה לתאים. </li></ol> שים לב: הוסף 500 DMEM μl לתא אחד של תאי תוליים לפעול כביקורת. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להוסיף 100 μl של DMEM לתערובת הנוגדנים, מערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה, ולהוסיף לתאים בDMEM להיקף כולל של 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התקשורת לאחר 48 שעות של לידת נוגדן. </li></ol> הערה: הפרוטוקול חזר על עצמו עם FITC שכותרת ריג כביקורת חיובית. 3. הדמיה חייה וקבועה לקביעת יעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת תאי החיים 48 שעות בשימוש במסנן Cy3 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונה את Atto550 NHS transfected הנוגדנים שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדמיה חייה הושלמה, לשאוב את התקשורת ותאים לתקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר aspirating תקשורת, לטפל בתאים עם Paraformaldehyde 0.4% למשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. שטוף תאים 4 × 5 דקות כל אחת עם PBS. ואז, לעגן את התאים עם מדיה הרכבה המכילה ריאגנט DAPI וcoverslip תיקון. למדוד יעילות transfection של התאים הקבועים עם AxioVision תוכנה. אם AxioVision תוכנה היא לא בהישג יד, פשוט לספור את האירועים מהתמונה שלך על ידי יד ותוצאות חישוב בתקע 3.7. לחלופין, תוכנת ImageJ יכולה לשמש לחישובים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, שימוש במדידה &quot;האירועים&quot; כדי לספור את המספר הכולל של תאים בתמונה על פי בחירתך ב20x הגדלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן השתמשתי במדידה &quot;האירועים&quot; לספור את התאים שלא היוtransfected בהצלחה עם נוגדנים באותה התמונה בהגדלה 20x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגשת ל&quot; אירועים &quot;נמדדו בפורמט סגנון Excel, לחץ על&quot; מאפיינים &quot;, לחץ על הכרטיסייה&quot; המדידה &quot;, ולחץ לצפייה&quot; כשולחן. &quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, השתמש בחישוב הבא כדי לקבוע את יעילות transfection שלך על ידי ההשוואה בין שני אירועים שנמדדו בעבר: ((תאים - תאי סך Untransfected) / תאים סה&quot;כ) = יעיל x 100 Transfection. </li></ol> 4. נציג תוצאות תמונות החיות של untransfected (האיור 3A) בהשוואה ל( איור 3B) נוירונים transfected מגלה כי התיוג של הנוגדנים (אדום או ירוק בכל דמות) הוא ציין באופן ברור בתוך תאים (האיור 3B, C, D). בעקבות שאיפה וכביסה עם תקשורת כדי להסיר נוגדנים או בין חסיד אל פני השטח של תאים, נוגדנים שכותרתו הם עדיין נמצאים בתאי עצב (האיור 3C, ד).<html> כדי לחשב את יעילות transfection, השתמש בתוכנת AxioVision לחשב תאים הכוללים בהשוואה לתאים שלא transfected בהצלחה. ערכים אלו נקשרו לנוסחת יעילות transfection לרכוש את יעילות transfection כאחוז מכלל תאים (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של הנהלים המשמשים לנוגדני תווית עם ATTO 550 NHS אסתר אחרי הצעדים הנדרשים כדי לרכז את הנוגדנים שהכותרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" /> איור 2. תרשים זרימה של הנהלים המשמשים לtransfect נוגדנים שכותרתו לתוך תאי חיים בתרבות.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" /> איור 3. חי תמונות של הנוירונים transfected 48 השעות transfection הבא. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" /> איור 4. קבוע ושטף תמונות עם אירועים נספרו על מנת לקבוע יעילות transfection.

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
<li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambert-Eaton+syndrome+antibodies%3A+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li>
<li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA%2C+DNA-binding+proteins%2C+and+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Rheum.+Dis.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li>
<li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry%3A+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons%3A+implications+for+molecular+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li>
<li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+cause+of+disease+or+caused+by+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li>
<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
<li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li>
<li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer%2C+Axl%2C+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+%27passive+transfer%27+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

על מנת לבדוק את ההשערות לגבי מולקולות ספציפיות וביטוייהם, גנים ווקטורים אחרים transfected נפוץ לתוך תאים. ההיבט הייחודי של הליך זה הוא היכולת בקלות transfect נוגדנים לתאי המטרה. בצענו בשיטה זו בחמישה ניסויים נפרדים, כל אחד בכפילויות. תוצאות יעילות transfection היו דומות בכל הניסויים. חשוב מכך, השיטה מאפשרת כניסה של נוגדנים לתא מבלי לשנות מבנה נוגדן או פונקציה. יתר על כן, בשימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי עצב חיים, אנו מסוגלים לקבוע יעילות transfection, אשר בדרך כלל עולה על 55%....

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלורסנט AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> AxioVision גרסת 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> אנטי rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC מתויג אנטי ריג </td><td> העוז Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS אסטר </td><td> סיגמא </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-סחורה ב </td><td> העוז Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10% FBS אנטיביוטיקת 1% </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> פולי-D-ליזין שקופיות תרבות 8-כן </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Rotator רב תכליתי </td><td> המדעי Industries Inc </td><td> דגם 151 </td></tr><tr><td> DAPI הרכבת מדיה </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialyzer </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (פתרון 4%) </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td></td></tr></tbody></table>

transfection נוגדן לנוירונים ככלי ללימוד פתוגנזה מחלות

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

נוגדנים לספק את היכולת לקבל תובנה רומן לאירועים שונים המתרחשים במערכות חיים. היכולת לייצר נוגדנים ספציפיים מאוד לחלבוני היעד אפשרה לשאלות ביולוגיות מדויקות מאוד להתייחסות. חשוב לציין, הנוגדנים היו מעורבים בפתוגנזה של מספר המחלות אנושיות לרבות זאבת מערכתית (לופוס), דלקת מפרקים שגרוניים (RA), תסמונות paraneoplastic, טרשת נפוצה (MS) וטיפוס אנושי T-lymphotropic וירוס 1 (HTLV-1) קשור myelopathy / paraparesis ספסטית הטרופית (HAM / כפית) 1-9. איך לגרום למחלה היא נוגדני שטח של חקירה מתמשכת, והנתונים מצביעים על כך שאינטראקציות בין מולקולות נוגדנים ותוצאות תאיות שונות בדלקת, שינו סלולריים הודעות, ואפופטוזיס 10. הוכח כי חולים עם טרשת נפוצה וHAM / TSP לייצר נוגדנים עצמיים לחלבונים התאיים RNA מחייבים חלבונים הטרוגנית ribonuclear1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. הנתונים האחרונים מצביעים על כך נוגדנים לאנטיגנים משטח תוך עצבי ושניהם פתוגניים 3, 5-9, 11. לפיכך, הליך המאפשר לחקר נוגדנים תאיים: אינטראקציות חלבון הייתי משאיל תובנה גדולה להיווצרות מחלה. גני transfected נפוץ לתוך תאים ראשוניים וקווים סלולריים בתרבות, לעומת זאת transfection של נוגדנים לתאים התעכב בשל שינוי של מבנה נוגדנים או יעילות transfection עניה 12. שיטות אחרות של transfection כוללות transfection נוגדן המבוסס על יפוזומים קטיוני (מורכב DOTAP / סמים) וpolyethylenimines (PEI); שניהם גרמו לירידה של פי עשרה בtransfection נוגדן השוואה לקבוצת ביקורת 12. השיטה מבוצעת במחקר שלנו היא דומה לשיטות קטיוני שומנים בתיווך ומשתמשת במנגנון מבוסס שומנים ליצירת קומפלקסים שאינם קוולנטיים עם הנוגדנים דרך אלקטרוסטטי וhydrאינטראקציות ophobic 13. אנו מנוצלים מגיבים Ab-סחורה ב, שהוא ניסוח שומנים מסוגל ללכוד נוגדנים דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופובי שאינם קוולנטיים ואספקתם בתוך תאים. לפיכך כימי וגנטיים זיווגים אינם הכרחיים עבור משלוח של נוגדנים פונקציונליים לתוך תאי חיים. שיטה זו אפשרה לנו לבצע מעקב נוגדנים שונים וניסויי חלבון לוקליזציה, כמו גם את הניתוח של ההשלכות המולקולריות של נוגדנים תאיים: אינטראקציות חלבון 9. בפרוטוקול זה, אנו נראים כיצד transfect נוגדנים לנוירונים במהירות, reproducibly ועם רמה גבוהה של יעילות transfection. כדוגמה, ישתמשו נוגדני A1 ואנטי IgG נגד hnRNP. לכימות קל של יעילות transfection השתמשנו נוגדני A1 אנטי hnRNP כותרתו עם ATTO-550-NHS וFITC שכותרת IgG. Atto550 NHS הוא תווית חדשה עם ספיגה מולקולרית גבוהה והקוונטים ייישן. מקור עירור ומסנני ניאון לAtto550 דומה לCy3 (שמות 556 Em. 578). בנוסף, יש Atto550 photostability גבוה. FITC מתויג-IgG שמש כבקרה כדי להראות ששיטה זו היא תכליתית ולא לצבוע תלוי. גישה זו והנתונים שיופקו תסייענה בהבנה של התפקיד שנוגדנים לאנטיגנים תאיים היעד עשויים לשחק בפתוגנזה של מחלות בבני אדם.

גישה מהירה כדי לחקור אינטראקציות והשפעות על מנגנונים מולקולריים הקשורים לנוכחות של נוגדנים בסביבה תאית מתוארת. השיטה כרוכה transfection של נוגדנים לתאים חיים באמצעות היווצרות מורכבת שאינן קוולנטיים המבוססת על ניסוח שומנים בדם. הטכניקה ניתנת להתאמה לשורות תאים הנציחו ותאים ראשוניים.

Transfection נוגדן לנוירונים ככלי ללימוד פתוגנזה מחלות

נוגדנים מעניקים את היכולת להשיג תובנות חדשות לגבי אירועים שונים המתרחשים במערכות חיות. היכולת לייצר נוגדנים בעלי ספציפיות גבוהה...

מטרת פרוצדורה זו היא לספק גישה מהירה וניתנת לשחזור לבחינת האופן שבו נוגדנים, מנגנונים מולקולריים אוטומטיים הקשורים לתפקוד נוירונלי והפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות פועלים. ראשית, מסמנים את הנוגדנים בעזרת תג פלואורסצנטי ATO five 50 NHS. לאחר מכן, מערבבים את הנוגדנים עם ריאגנט טרנספקציה ולאחר מכן מבצעים טרנספקציה לתאים נוירונליים.בתרבית, 48 שעות לאחר הטרנספקציה, מקבעים את הנוירונים, מעגנים אותם עם מדיום DPI ומדמיים אותם באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה. ניתן לחשב את יעילות הטרנספקציה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במדעי המוח ובנוירואימונולוגיה, כגון כיצד נוגדנים עצמיים משנים מנגנונים מולקולריים הקשורים לתפקוד נוירונלי ולפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות ממקור חיסוני.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר רצינו לבחון את ההשערה כי נוגדנים ל-h ו-RPA 1 ולחלבון קישור ל-RNA המבטאים ביתר בנוירונים תרמו למנגנון של ניו روندגנרציה. את הפרוצדורה מדגים ג'וש דאגלס, סטודנט לתואר שני. לפני תחילת הפרוצדורה, ודאו כי תאי נוירונים שלמים ואיכותיים, שנשתלו בריכוז של 100,000 תאים לבאר והגיעו לרמה של לפחות 80% התמסרות (confluent), זמינים יום לפני הניסויים. ביום ביצוע הבדיקה, צפו בתאים כדי לוודא שהם בריאים.התחל בהכנת 0.1 mM של בופר סודיום ביקרבונט על ידי ערבוב של 8.4 גרם סודיום ביקרבונט ו-29.2 גרם נתרן כלורי בליטר אחד של מים. לאחר מכן, כוונן את ה-pH של הבופר ל-8.4 עבור 500 µL של הבופר. הוסף 70 µL מהנוגדן המיועד לטרנספקציה במקרה זה, anti H-N-R-N-P-A one, ו-35 µL מרכיב הסימון, oh five 50 NHS.סובב את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן הזרק אותה למכשיר דיאליזה ובצע דיאליזה בשני ליטרים של PBS בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. למחרת, השתמש בעמודת ספין (spin column) כדי לרכז את הנוגדן המסומן שעבר דיאליזה. לבסוף, קבע את ריכוז הנוגדן באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop.בשקופית בעלת שמונה בארות, זרקו 10,000 תאים לכל בארה בנפח של 500 µL של DMEM מלא. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה או עד שהצפיפות התאית (confluency) תגיע לפחות ל-70%. ברגע שהתאים הגיעו לצפיפות של 70%, התחילו את הפרוצדורה על ידי ערבוב של 2 µL של נוגדן, ריאגנטים לטרנספקציה ו-2 µg של נוגדן מסומן בריכוז של 0.5 µg/µL בתוך מבחנה (Eppendorf), ודגרו את התמיסה למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר.בינתיים, הסירו את ה-SUP natum מבארות תרבית התאים והחליפו אותו ב-394 µL בדיוק של מצע טרי לכל בארה. ברגע שתמיסת הטרנספקציה תהיה מוכנה, הוסיפו 100 µL של DMEM וערבבו באמצעות פיפוט מעלה ומטה. לאחר מכן, הוסיפו בדיוק 106 µL מתערובת הטרנספקציה לכל בארה המכילה תאים, כדי להגיע לנפח סופי של 500 µL לבארה.הקפידו לכלול באער של בקרה שלילית תאים שאינם טרנספקטיים (UNT TRANSFECTED), שבהם יתווסף DMEM במקום נוגדן. הדגרירו את התאים למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר הדגירה, החליפו את המצע ב-DMEM טרי, ובצעו דימות חי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 48 שעות לאחר הסימון.כדי להדגים חמישה נוגדנים מסומני NHS של ATO, השתמשו במסנן SI three; לאחר דימוי חי, שאבו את המצע וקבעו את התאים על ידי הוספת 4%paraldehyde ודגירה של הפלטה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר קיבוע התאים, שטפו אותם ארבע פעמים ב-PBS, תוך מתן תקופת דגירה של חמש דקות ב-PBS עבור כל שטיפה. לאחר מכן, הסירו את ה-PBS והוסיפו טיפה של תוך मीडियम להרכבה (mounting medium) המכיל DPI.הנח בעדינות זכוכית כיסוי מעל התאים בכל באר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התחל בדימוג של התאים. בניסוי זה, ביצענו דימוג פלואורסצנטי של תאי נוירונים חיים שעברו טרנספקציה מוצלחת עם ATO five 50 NHS labeled anti H-N-R-N-P-A one antibodies.תמונה זו מראה נוגדנים בתוך תאי העצבים, כולל בציטופלזמה ובבליטות העצביות, וכן קיבוע וצביעה של הגרעין. שימוש ב-DPI, המוצג כאן בכחול, מאפשר לקבוע את יעילות הטרנספקציה על ידי חלוקת מספר התאים שעברו טרנספקציה במספר התאים הכולל. במקרה זה, היעילות לאחר ביצוע הליך זה היא 50%.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אימונו-ציטוכימיה, הפקת RNA, ניתוח מיקרו-מערך (microarray) ובלאוט מערבי (western blot), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון קולוקליזציה של נוגדנים בתוך אבנים תאיות, כמו גם שינויים בתפקוד ובשלמות הנוירונים הקשורים לסגוליות של הנוגדן לאנטיגן המטרה. בסרטון זה, הדגמנו כיצד לסמן נוגדנים בעזרת סימון פלואורסצנטי, להכין קומפלקס של רכיב טרנספקציה עם נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית, לבצע טרנספקציה לנוירונים ולחשב את יעילות הטרנספקציה. שיטה זו שימושית בהערכה של האופן שבו נוגדנים עצמיים משפיעים על תפקודים תאיים כגון חיות, אפוזיטוזיס ותובלה נוירונלית, כמו גם על המנגנונים המולקולריים הקשורים לתפקוד נוירונלי ולפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות.

antibody-transfection-into-neurons-as-tool-to-study-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את תהליך התמרת תאי עצב אנושיים עם נגיף לנטי המקודד חלבון טאו אנושי מוטנטי המתויג בחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כדי לחקור צבירת חלבונים. הוא מתאר את השלבים מכניסה ויראלית לביטוי טאו מוטנטי, ומגיע לשיאו בהיווצרות אגרגטים ציטופלזמיים גלויים בתאי העצב.

התמרה מתווכת לנטיוויראלית של נוירונים אנושיים לניתוח צבירת חלבון טאו

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

שליטה בביטוי החלבון היא לא רק חיונית לכל אורגניזם חי, אלא גם אסטרטגיה חשובה לחקירת תפקודי חלבונים במודלים תאיים. הפרוטוקול שהוצג מראה את היישום של הפרעות נוגדנים בתאי יונקים כולל נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ומדגים את השימוש בשחזורים תלת מימדיים בחקר תפקוד החלבון.

תפקוד חלבון לימוד ותפקיד ביטוי חלבון לשנות על ידי הפרעת נוגדן שחזור תלת ממדי

כתב יד זה מתאר כיצד העברת גנים מקומיים בתיווך וקטור ויראלי מספקת דרך אטרקטיבית לבטא טרנסגנים במערכת העצבים המרכזית.  הפרוטוקול מתאר את כל השלבים החיוניים לביצוע הזרקת וקטור ויראלי בחומר השחור של החולדה כדי לפתח מודל בעלי חיים מבוסס וקטור ויראלי למחלת פרקינסון.

פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים

תוך הזרקה של recombinase תלויה רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV) ניתן להשתמש כדי לטפל בכל סוג התא גנטית שכותרתה בחוט השדרה. כאן נתאר כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני. טכניקה זו מאפשרת פונקציונלי חקירתו של המשנה נוירון מניפולציה.

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מערכת מבוססת תא משכפל היווצרות של אלפא-synuclein אגרגטים ויוו. תכלילים תאיים אלפא-synuclein הם זרועה בנוירונים הראשי על-ידי הפנמת האמונה, הפצת אקסוגני מנוהל אגרגטים מקורי microsomes-הקשורים אלפא-synuclein מבודד מן העכברים הטרנסגניים חולה אלפא-synuclein.

הממשל אקסוגני של אלפא-synuclein Microsomes-הקשורים אגרגטים כדי נוירונים העיקרי כמודל תא עוצמה היווצרות הסיבים

מטרת טכניקה זו היא להכין תרבות מועשר של ראשי motoneurons (MNs) של חוט השדרה מאתר. כדי להעריך את ההשלכות של מוטציות גורמות למחלות MN, נתאר כאן ניתוקה של אלה מבודדים MNs של תרביות תאים שלהם על-ידי magnetofection.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.

מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים

דלקת המוח האוטואימונית היא קטגוריה חדשה של מחלות בתיווך נוגדנים של מערכת העצבים המרכזית. ניתן להשתמש בנוירונים בהיפוקמפוס כדי לגלות ולאפיין נוגדנים אלה. מאמר זה מספק פרוטוקול לתרבית תאים ראשונית ואימונוסטינינג כדי לקבוע נוגדנים עצמיים בסרום ובנוזל המוח והשדרה של חולים.

תרביות נוירונים בהיפוקמפוס כדי לזהות ולחקור נוגדנים פתוגניים חדשים המעורבים בדלקת המוח אוטואימונית

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

למדו שיטת טרנספקציה של נוגדנים לתאי עצב חיים לחקר אינטראקציות מולקולריות במחלות נוירולוגיות. שיטה זו מאפשרת הדמיית השפעות נוגדנים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ומייעלת מחקר בנוירואימונולוגיה.

Transfection נוגדן לנוירונים ככלי ללימוד פתוגנזה מחלות

גלה סרטונים נוספים