Name: ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב באתרו זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של LacZ תייג- (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: למד פרוטוקול לזיהוי גרורות בריאות ברזולוציית תא בודד בעכברים באמצעות הדמיה משופרת. השיטה משלבת זליפה באתרו של הריאה וצביעת X-Gal לתאים מתויגים ב-LacZ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Lubor Borsig (מכון לפיזיולוגיה, אוניברסיטת ציריך) בעצתו בטכניקה של זלוף ריאות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מKrebsliga של Kanton ציריך, וולטר ל &#39;ויוהנה קרן וולף, ציריך, לידיה Hochstrasser הקרן, ציריך, שווייץ הקרן הלאומית למדע, SNF, שוויץ, Schweizerischer Verein Balgrist, והאוניברסיטה של הציר.

1. זלוף וקיבוע ריאות באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכברים בהזרקת ה-IP של ~ פוספט μl 150 נאגר מלוח (PBS) המכיל 112.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג (משקל גוף) קטמין, xylazine 16.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג, ומ&quot;ג / ק&quot;ג 15 acepromazine (או על ידי הרדמה אחרת המכילה משככי כאבים מתאימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הרפלקסים של העכבר כבר לא נצפו, לתקן את זה על שולחן ניתוחי גב כלפי מטה ומרטיב את הפרווה עם אתנול 70% לחלקלקות את השערות למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את העור מהבטן עד הצוואר ולמשוך אותו לצדדים או להסיר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח הצפק ובית החזה לגודל בשפע. למנוע קרע של כולים גדולים (jugularis הווריד למשל) כדי להימנע מיעילות מופחתת של זלוף שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הווריד הנבוב caudalis מתחת הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 20 מ&quot;ל מצויד ב21 ז&#39;- 24G מחט להזריק לאט 10-15 המ&quot;ל PBS לחדר הימני של הלב הפועם עד הריאות הן לבנות לחלוטין והלב מפסיק לפעום (asystole). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבוט את כלי הדם מעל הכבד והסרעפת עם מהדק של כלי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק מ&quot;ל 10 מצוידים ב21 ז&#39;- 24G מחט להזריק ~ 2 מ&quot;ל של paraformaldehyde 3% (PFA) ב PBS לחדר ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את קנה הנשימה מחוץ לבית החזה. השתמש באותו המזרק כדי להזריק ~ 3 מ&quot;ל של 3% PFA ב( מחוץ לבית החזה) PBS גולגולת לתוך קנה הנשימה עד לריאות מנופחות. מייד לאחר הסרת המחט, לצבוט את קנה הנשימה של הזנב לנקב עם מהדק של כלי דם ולחכות 10 דקות כדי לאפשר לקיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחצה את כלי הדם מעל מהדק כלי הדם, להסיר את המהדק ולהזריק ~ 2 המ&quot;ל PBS לתוך חדר ימין להסיר PFA העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את החלקים התחתונים של כל אונות הריאה עם מחט, להסיר את המהדק של כלי הדם בקנה הנשימה ולהזריק 3-5 מ&quot;ל של תמיסה של PolyFreeze הטבעה בינונית / PBS 01:01 לקנה הנשימה של הזנב לנקב הראשון עד PFA ב ריאותאונות מוחלפות בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הריאות בזהירות על ידי משייכת הלב עם מלקחיים וtransecting רצועות רקמות חיבור, כלי דם וקנו נשימה. שמור על הלב הקשור לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי איך להמשיך עם ניתוח רקמת הריאה להמשיך בפרוטוקולים המפורטים בסעיפי 2 או 3. אם אתה רוצה לעשות את שני הניתוחים, להסיר אונת ריאה אחת והמשך כמתואר תחת 3. לעבד את האונות הנותרות הקשורים ללב כפי שתואר תחת 2. </li></ol> 2. ויזואליזציה של תאי גידול גרורתי lacZ מתויג-באונה של ריאות שלמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הריאות בכוס פלסטיק עם מכסה סגירה הדוק ולתקן את זה עם פורמלדהיד 2% ב PBS בטמפרטורת חדר במשך 30-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון קיבעון ולשטוף ביסודיות 3 פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לפחות 10 מ&quot;ל מוכן טרי 5-Bromo-4-כלורו-3-β-indolyl-D-galactoside (X-גל) (פתרון מנייה מכתים פתרון ה-X גל [40 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDimethylformamide] 1:40 דילול בפתרון בסיסי כתמים; pH 7.1 (טבלה 1); להגן מפני אור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים פיסת הגזה על גבי הריאה שהחייה כדי לשמור אותו לחלוטין בפתרון ולמקם את המכסה רק באופן רופף על הסיר על מנת לאפשר חילופי האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 שעות מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון X-גל, לשטוף פעם עם PBS להסיר פתרון ה-X גל שיורים (אופציונלי) ולהוסיף 4% PFA. </li></ol> 3. ויזואליזציה של תאי גידול גרורתי lacZ מתויג-בCryosections ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מראש עובש כותרת הטבעה ל1 / 3 עם מדיום הטבעת PolyFreeze מהול. שים את אונת הריאה על גבי ולהתמלא בהטבעה בינונית עד שהאונה מכוסית לגמרי. נסה למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הריאות המשובצות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז להקפיא את הריאות המשובצות לאט בתערובת של קרח יבש וIsopentane ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך מיקרומטר cryo 7-10קטעים על cryostat ולעגן אותן בשקופיות מיקרוסקופ SuperFrostPlus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הסעיפים מייד עם פתרון מכתים X-גל על ​​37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות ב2 פעמי PBS למשך 5 דקות ולאחר מכן לזמן קצר במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counter-הכתם אדום במהירות גרעינית ל10-30 שניות, לשטוף במים מזוקקים ולעגן את השקופיות עם Immu-הר. </li></ol> 4. נציג תוצאות Asai et al. דיווח במאמר המקורי על מודל דאן נגזר-OS LM8 העכבר שגידולי sc עיקריים הנגזרים מתאי דאן ההורים, שונים מאלה הנגזרים משורת התאים גרורתי מאוד LM8 משנה, לא באופן ספונטני בצורת גרורות בריאות בגילוי עכברי syngeneic C3H 14. עם טכניקות כאן שדווחו, אנו reinvestigated ההיווצרות של גרורות בDunn/LM8 מודלי OS עכבר. נצלנו היציב דאן lacZ-transduced וLM8 תאשל ושל פרוטוקול לזלוף באתרו ריאות וקיבעון בעכברים. תמונות מייצגות של ריאות perfused ולא perfused של עכברים שהוזרקו תת עורית עם lacZ-transduced ולא transduced השליטה דאן וLM8 תאים מוצגים באיור 1. בעכברים הוזרקו תאי בקרת דאן, גרורות מאקרוסקופיים ומיקרוסקופיות נותרו בלתי ניתנות לגילוי בריאות הלא perfused וperfused (איור 1 א, I-IV). אבל, באופן מעניין, בעכברים הוזרקו תאי דאן-lacZ, כתמי X-gal חשפו micrometastatic מוקדים כחולים של תאים בודדים או באשכולות של תאים קטנים (&lt;0.1 מ&quot;מ) על פני השטח של ריאות שאינן perfused (איור 1 א, ו). ב זלוף וקיבעון אתר של ריאות נוספות שפרו את יכולת הגילוי של דאן-lacZ micrometastases (איור 1 א, ח). עם זאת, תולדה למוקדים מקרוסקופית לא נצפתה (איור 1 א, נ, ז). &lt;/ P&gt; בעכברים שהוזרקו עם LM8 תאי בקרה, שקופים למחצה, בקושי נראה macrometastatic מוקדים גדולים מ -0.1 מ&quot;מ בקוטר הוכרו ריאות הלא perfused (האיור 1B, ט). הטפטוף של הריאות (האיור 1B, ג) לא שפר את זיהוי של המוקדים. עם זאת, בעכברים שהוזרק תאים מרובים LM8-X-lacZ גל מוכתם כחול מאקרו-(התרשים 1B, v) וmicrometastases (האיור 1B, ו) התגלו על פני השטח של איברים שאינם perfused. יתר על כן, זלוף של ריאות נוספות שפר את יכולת הגילוי של מקרו וmicrometastases (האיור 1B, ז - ח). כתוצאה מכך, מייקרו וmacrometastases הפך גלוי בצפיפות גבוהה יותר ומספר גדול יותר, בעיקר בשל השקיפות של רקמת perfused שבמוקדים מתחת לפני שטח האיבר הפכו גם גלויים. שעות נוספותניתוח istological באמצעות cryosections של רקמת ריאה אשר detectability המשופרת של גרורות בריאות בעכברים שהוזרקו עם דאן lacZ-transduced וLM8 תאים. בעכברים עם גידולים ראשוניים מקורם דאן-lacZ או תאי LM8-lacZ, שלא כמו בעכברים עם גידולים ראשוניים של תאי בהתאמה בקרה, micrometastases או תא מוקדים אפילו אחת הוכרו בסעיפי ריאה (איור 2). יתר על כן, היו גם יותר macrometastases נראה בבירור בעכברים הוזרקו תאי LM8-lacZ מאשר בבעלי חיים הוזרקו שליטת LM8 תאים (איור 2 ג, ד). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> איור 1. איתור של גרורות ספונטניות של הלא transduced (I-IV) וlacZ-transduced (V-VIII) דאן () וLM8 (ב &#39;) בתאים שאינם perfused (I, II, VI, V) וperfused (ג, ד, ז, ח) ריאות בעכברי C3H. גרורות בנציג X-גלאון staריאות לעצמה שלמה (v, ז בA ו-B) והתקריבים מתאימים (VI, VIII בA ו-B) נראה כחול. Macrometastatic המוקדים (&gt; 0.1 מ&quot;מ) באיברים של עכברים שהוזרקו עם LM8 תאים שאינם מתויגים-(I-IV בבוקר) מסומנים בכוכביות. אזור שמוצג בצילומי תקריב הוא נציג לריאות שלמות. ברים בקנה מידה של 1 מ&quot;מ מצביעים בתמונות של ריאות שלמות ו0.1 מ&quot;מ בתקריב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> איור 2. איתור של דאן וLM8 micrometastases בcryosections ריאה. קטעי רקמת ריאה מוטבע אוקטובר הודגרו בפתרון מכתים X-גל על ​​37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בתא ולאחר מכן humidified counterstained באדום מהר גרעיני. חיצים מצביעים על micrometastatic המוקדים המוכרים בחלקי ריאות של עכברים שהוזרקו עם דאן-lacZ (B) או תאי LM8-lacZ (ד &#39;). Micrometastases נשאר בלתי ניתן לגילוי בסעיפי ריאות של עכברים שהוזרקו עם דאן אינו transduced () או LM8 תאים (C). ברי קנה מידה מצביעים 0.1 מ&quot;מ.

<ol><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li>
<li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoussens%2C+LM+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 295, 2387-2392 (2002).</li>
<li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li>
<li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538(2011).</li>
<li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical & experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li>
<li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical & experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li>
<li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li>
<li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+lacZ+gene%3A+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+metastasis+reviews%22%5BJournal%5D)">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li>
<li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li>
<li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li>
<li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+and+cancer+revisited%3A+mechanistic+connections+involving+platelets%2C+P-selectin%2C+carcinoma+mucins%2C+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn%2FLM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li>
<li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+%28LM8%29+with+high+metastatic+potential+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li>
<li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

התוצאות שהוצגו כאן במודל עכבר Dunn/LM8 OS להדגים את כוחה של השיטה החדשה שהוקמה שמשלבת מכתים X-הגל של תאים סרטניים lacZ מתויג-עם זלוף באתרו / קיבוע של רקמת ריאה. זה שילוב של שתי הטכניקות מאפשר גילוי רגישות גבוהה של נגעי micrometastatic עד לרמת התא הבודדה ומשפר גם את ההדמיה של macrometastases על פני הריאות (איור 1), כמו גם בחלקי ריאה (איור 2). בעוד מכתים X-הגל גם מאפשר זיהוי של גרורות (מייקרו) באיברים אחרים, זלוף באתרו / קיבעון משפר את יכולת הגילוי של גרורת מוקדים ברקמות אחרות מאשר הריאה רק במעט בגלל צבע דם ורקמות הקשורה הטבעי 13 איברים אלה. גם אם זלוף מופנה לאיבר אחר, כגון הכבד, הסרת הדם הייתי חלקי בלבד לשפר את הימור הניגודמכתים Ween X-גל והצבע הטבעי של האיבר. עם זאת, השיטה ישימה לכל סוג של lacZ בתיוג תאים סרטניים, באופן דרמטי לשפר את יכולת הגילוי של גרורות ריאות עד לרמה של micrometastases הרדום תא בודד ומאפשר כימות קלה ואמינה של מאקרו וmicrometastases. מגבלה של שיטה זו ואת כל טכניקות האחרות המבוססות על גנים מדווחים, כוללים חלבוני וציפראז וניאון, היא היציבות של ביטוי transgene. כפי שמוצג באיור 2, שלא כל התאים הסרטניים בתוך macrometastatic המוקדים מוכתמים כחול, המעיד על חוסר הפעילות בטא גלקטוזידאז. זה יכול להיות קשור לנימק, אבל זה סביר יותר עקב אובדן ביטוי transgene. הבחנו כי דאן וLM8 התאים יעילים מאוד במורד הוויסות של lacZ ומושתל אחרים גם בבחירה מתמדת לביטוי. לכן החלפנו במחקרים שנעשה לאחרונה לK12 העכבריוK7M2 והוז, 143B האדם וSaOS-2 קווים סלולריים, סרטן העצמות שנשמרה כל ביטוי lacZ יציב במבחנה, כמו גם in vivo עד 100% לאורך זמן. ברגע lacZ ביטוי יציב מובטח, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת במחקרים בתאים סרטניים מניפולציות גנטיות, למשל מכניסטי לחקור את התהליך של קולוניזציה הרקמה 13, כמו גם לפיתוח והבדיקה של טיפולים החדשים שמטרתה מיגור הגרורות 15 , 16. יתר על כן, הוא יכול לשמש כאמת מידה לשיפור טכניקות נוכחיות רדיולוגיות הדמיה, כגון PET, (מייקרו) CT ו-MRI, המשמשות לגילוי מוקדם של גרורות. במחקר PET האחרון (לא פורסם) עם קליעים נותבים שונים שאומתו בריאה זוהתה vivo גרורות vivo מכן לשעבר עם הפרוטוקול המתואר. במחקר מתמשך עם חיה קטנה חדשה מייקרו-CT (SkyScan) אנחנו כל כך הרבה able לזהות גרורות בריאות בvivo עד גודל של 0.5 מ&quot;מ וvivo לשעבר עד 0.3 מ&quot;מ, אך אנו שואפים ברזולוציה של 0.1 מ&quot;מ. מעניין, זה הוא מגבלת הגודל שאנו קובעים להבחין המאקרו מmicrometastases עם השיטה המשולבת של זלוף באתר ומכתים X-גל. זה מדגיש שוב את הרגישות והתועלת של טכניקה קלה וחסכונית זו.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Narketan10 (קטמין) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli פארמה AG </td><td></td><td> 20 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazine) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון </td></tr><tr><td> בולדוג סוג Serrefine מהדק כלי דם </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 18051-35 </td><td> , 35 מ&quot;מ מעוגל </td></tr><tr><td> כוס פלסטיק עם מכסה </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 מיליליטר כוסות עם מכסים </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-כלורו-3-β-indolyl-D-galactoside (X-גל); אבקה </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> מתמוסס בN, N-Di-methylformamide עד 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל, חנות אור המוגן ב -20 ° C </td></tr><tr><td> פתרון בסיסי מכתים, מתאזן ל-pH 7.1, מאוחסן אור המוגן ב 4 ° C למקסימום. 1 חודש </td><td> מתוצרת עצמית </td><td></td><td> 100 10xPBS מ&quot;ל / ליטר, 1.64 גר &#39;/ ל&#39; K3Fe (CN) 6, 2.1 גר &#39;/ ל&#39; K4Fe (CN) 6, 2 מ&quot;ל / ליטר MgCl2 1M, 2 10% מ&quot;ל / L NP40, 1 מ&quot;ל / L 10% נתרן Deoxycholate </td></tr><tr><td> בינוני הטבעת PolyFreeze </td><td> Polysciences; מפיץ שויצרי: רונשוויג </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> הטבעה של עובש </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> יקה CM1850 cryostat </td><td> Microsystems היקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שקופיות SuperFrost </td><td> מנזל </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> פתרון אלומיניום סולפט - גרעיני-Fast אדום </td><td> חטיבת Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-הר </td><td> Thermo Electron, מפיץ שויצרי: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1. ריאגנטים וציוד.

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי x-גל של<em&gt; lacz</emגידול תאים&gt; תייג-

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

גרורות הן סיבת מוות העיקרי ברוב סוגי הסרטן, ולכן התמקדות עיקרית בחקר הסרטן. עם זאת, זיהוי של micrometastases ידי radiologic הדמיה וההצלחה במיגור הטיפולי שלהם יישאר מוגבל. בעוד מודלים של בעלי חיים הוכיחו להיות כלי רב ערך עבור סרטן 1 מחקר, הניטור / ההדמיה של micrometastases עדיין מהווה אתגר והערכה מדויקת של התפשטות גרורה במחקרים פרה פוטנציאלי מוביל לתוצאות מאכזבות בניסויים קליניים 2. כתוצאה מכך, יש עניין רב בשיטות זיקוק לבסוף לאפשר זיהוי לשעתק ואמין של גרורות עד לרמת התא הבודדה ברקמה נורמלית. ההתמקדות העיקרית לכן היא על טכניקות, המאפשרים זיהוי של תאים סרטניים בגוף חי, כמו מייקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מייקרו), טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), פליטת אור או דימות פלואורסצנטי &lt;sup&gt; 3,4. כרגע אנחנו ייעול שיטות אלה לניטור vivo של גידול ראשוני וגידול בגרורות סרטן עצמות מודלים שונים. כמה טכניקות אלו יכולות גם לשמש לניתוח vivo לשעבר של גרורות לצד שיטות קלסיות כמו qPCR 5, 6 FACS או סוגים שונים של צביעה היסטולוגית. כאמת מידה, הקים במחקר הנוכחי transfection או התמרה של תאים סרטניים עם גן lacZ היציב קידוד חיידקי אנזים β-גלקטוזידאז שחילוף חומרי מצע chromogenic 5-4-כלורו-3-indolyl-beta-D bromo -Galactopyranoside (X-גל) לכחול וסגול, 7 צבע מסיס ומאפשר את הצביעה רגישה מאוד סלקטיבית histochemical הכחולה של תאים סרטניים ברקמת vivo לשעבר עכבר לרמת התא הבודדה, כפי שמוצג כאן. זהו כלי עלות נמוכה ולא ציוד אינטנסיבי, המאפשר אימות מדויקת של גרורות 8 במחקרי ההערכה חדשהטיפולי ticancer 9-11. גורם מגביל של מכתים X-gal הוא ניגודיות הנמוכה לדוגמא כתמי דם אדומים הקשורה ברקמות כלי דם כן. ברקמת ריאת בעיה זו יכולה להיפתר על ידי זלוף ריאות באתרו, טכניקה שהוקמה לאחרונה על ידי Borsig et al. Perfused 12 שריאות של עכברים תחת הרדמה כדי לנקות אותם מהדם ולתקן ולהטמיע אותם באתרו תחת אינפלציה דרך קנה הנשימה. שיטה זו מונעת גם הקריסה של ריאות ובכך שומרת על המורפולוגיה של הריאות alveoli הפונקציונלי, אשר משפר את האיכות של הרקמות לניתוח היסטולוגית. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול חדש, שמנצל את היתרון של שילוב של כתמי X-גל של lacZ-להביע תאים סרטניים ובאתרו זלוף וקיבוע של רקמת ריאה. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מעודן רגישות גבוהה של תאים גרורתי בודדים בריאה ואפשר לנו בשנים האחרונה במחקר לדetect micrometastases &quot;הרדום&quot; ריאה במודל עכבר 13, שתואר במקור להיות שאינם גרורתי 14.

פרוטוקול הרומן שדווח במחקר הנוכחי מאפשר איתור סלקטיבי של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי שילוב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף ריאות וקיבעון וX-גל הכתמה של<em&gt; LacZ</em&gt; מתויג תאים סרטניים.

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

גרורות הן גורם התמותה העיקרי ברוב סוגי הסרטן, ולפיכך הן מהוות מוקד מרכזי במחקר הסרטן. עם זאת, גילוי של...

המטרה הכללית של הליך זה היא לשפר את הגילוי של גרורות מיקרוסקופיות בריאות עכבר ex vivo, תוך שימור המבנה של הריאות המנופחות. זאת מושגים תחילה על ידי ביצוע פרפוזיה לריאות in situ באמצעות PBS להסרת הדם, המהווה את מקור הרקע הצבעוני העיקרי ברקמה זו. השלבים הבאים כוללים ניפוח של הריאה באמצעות הזרקת PFA, ולאחר מכן קשירה (pinch off) לצורך קיבוע רקמת הריאה במצב נפוח.בשלב הבא, מוציאים את הריאה ומקבעים אותה באופן נוסף ב-PFA, או שמטמיעים אונו של ריאה בודדת לצורך חיתוך קריוסטטי. השלבים הסופיים כוללים צביעה של הרקמות בתמיסת Xal והדמיה של תאי גידול LA zag; בסופו של דבר, ניתן לזהות גרורות באונו של ריאה שלמה או בחתכי רקמת ריאה עד לרמת התא הבודד באמצעות מיקרוסקופ בינוקולרי או מיקרוסקופ אור. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון sky standing on its own, הוא שהיכולת לזהות מיקרו-גרורות משתפרת באופן ניכר הודות להסרת הרקע הקשור לדם.התחילו את הפרוטוקול על ידי הרדמת עכבר באמצעות זריקה תוך-peritonal של ketamine, xylazine ו-ace promazine בערך ב-150 µL של PBS. כאשר לא נצפים עוד רפלקסי כאב של העכבר, קבעו אותו על שולחן הניתוח. גלחו את הפרווה והחליקו אותה עם 70% ethanol.פתחו את העור מהבטן ועד לצוואר. משכו את העור לצדדים או הסירו אותו. פתחו בזהירות את הפריטוניאום בחזה כדי למנוע קרע של כלי דם גדולים כמו הוורידים הג'וגולריים (venina jugulars).פעולה זו תשפר את יעילות הפרפוזיה. כעת, חתוך את ה-vena cava cardis מתחת לכבד באמצעות מזרק של 20 מיליליטר עם מחט בכיול 21 עד 24 gauge. הזרק באיטיות 10 עד 15 מיליליטר PBS לתוך החדר הימני של הלב הפועם, עד שהריאה תהיה לבנה לחלוטין והלב יפסיק להפעים.לאחר מכן, צבטו את כלי הדם שמעל הכבד והסרעפת בעזרת תפס כלי דם. מלאו מזרק של 10 מיליליטר ב-3% paraform aldehyde, והזריקו לתוך החדר הימני באמצעות מחט בקוטר 21 עד 24 gauge. כמות של כשני מיליליטרים.חשוף את הקנה מחוץ לבית החזה ונפח את הריאה על ידי הזרקה לקנה של כ-3 milliliters של אלדהיד מחוץ לבית החזה. מיד לאחר הוצאת המחט, סגור את הקנה באזור הדקירה באמצעות תפסנית כלי דם והמתן 10 דקות לאפשר את הקיבוע. לאחר מכן, חתוך את כלי הדם מעל לתפסנית כלי הדם.לאחר מכן הסר את התפס והזרק כ-2 mL של PBS לתוך החדר הימני כדי להסיר שאריות פורמלדהיד. נקב בעזרת מחט את החלקים התחתונים של כל אונוני הריאה והסר את התפס הווסקולרי מהקנה. כעת הזרק 3 עד 5 mL של תמיסת שימור (embedding solution) מדוללת אל תוך הקנה, באופן תואם להזרקה הקודמת.הפסיקו את ההזרקה כאשר הפראפורמליד באונות הריאה מוחלף על ידי התמיסה. הוציאו את הריאה בזהירות על ידי משיכת הלב באמצעות פינצטה וחיתוך של רצועות רקמה מחברת, כלי דם והקנה. ודאו שהלב נשאר מחובר לריאות.הפרידו אונה אחת לצורך חתכים קריוגניים והשתמשו ברקמת הריאה הנותרת לצביעה של איברים שלמים. הניחו את הריאה בכוס פלסטיק עם מכסה אטום וקבעו אותה ב-2% formaldehyde ו-PBS. הניחו פיסת גזה מעל הריאה כדי להבטיח את הישארותה בתמיסה והשאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר חצי שעה, הסירו את תמיסת הקיבוע ושטפו את הרקמה היטב עם PBS שלוש פעמים. הכינו תמיסת Xal מוכנה לשימוש על ידי דילול של מיליליטר אחד של תמיסת Xal מקורית ביחס של 1:40 בתמיסת הצביעה הבסיסית, והוסיפו לפחות 10 milliliters ממנה אל הכלי. השקיעו את הריאה באמצעות פיסת גזה. סגרו את המכסה באופן רופח כדי לאפשר חילוף אוויר והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד חמש שעות, כשהדגימה מוגנת מאור.לאחר הדגירה, הסירו את תמיסת ה-xal. שטפו את הריאות פעם אחת עם PBS כדי להסיר שאריות של תמיסת ה-xal והוסיפו לפחות 10 milliliters של 4% paraform aldehyde ב-PBS. הרקמה מוכנה כעת להיסטולוגיה וניתנת לאחסון לטווח ארוך ב-4% PFA בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס.התחילו במילוי של שליש מתבנית השקיעה במדיום שקיעה poly forze לא מהול. לאחר מכן, הכניסו את נאחית הריאה לתבנית והמשיכו להוסיף מדיום עד שהנאחית תהיה מכוסה לחלוטין. הימנעו בזהירות מיצירת בועות אוויר, וכעת הדגירו את הנאחית השקועה בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות.בשלב הבא, הכין את הריאות המוטמעות לחיתוך על ידי הקפאה איטית בתערובת של קרח יבש ואיזופנטאן. במידת הצורך, ניתן להעבירן כעת למקפיא של 80- מעלות צלזיוס לאחסון. באמצעות קריוסטט, חתוך נתחים קריוגניים בעובי של 7 עד 10 מיקרון מהאונו. העבר את הנתחים לשקופיות מוכנות לחיתוכי קריו הזמינות מסחרית. לאחר ההעברה, דגור מיד את הנתחים בתמיסת צביעה xal בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בתא לח. למחרת, שטוף את השקופיות ב-PBS פעמיים למשך חמש דקות לכל שטיפה.בצע לאחר מכן שטיפה קצרה במים מזוקקים. כעת צבע את השקופיות בצבע נגד (counterstain) מסוג nuclear fast red למשך 10 שניות כדי לקבל צביעה חלשה שתדגיש את ה-xal, ושטוף מיד את צבע הנגד במים מזוקקים. לצביעה כהה יותר, האריך את זמן הצביעה עד 30 שניות או יותר.הצמידו את השקופיות באמצעות תמיסת הצמדה אימונוגנית (immuno mount). נבדקה מחדש היווצרות גרורות במודלים של OS בעכברים מסוג done LM eight. השתמשו בתמונות הנציגיות המתוארות כאן של ריאות מפורפרו (perfused) וריאות שאינן מפורפרו של עכברים שהוזרקו בו-זמנית תאי done ו-LM eight שעברו טרנסדוקציה של laxy ותאי done ו-LM eight שאינם טרנסדוקטד (בקרה), וכן בעכברים שהוזרקו תאי done של בקרה.גרורות מאקרוסקופיות ומיקרוסקופיות נותרו בלתי ניתנות לזיהוי בריאות שאינן מבושנות ובריאות מבושנות. אך באופן מעניין, בעכברים שהוזרקו תאי dun LA Z, צביעת xgl חשפה מוקדים מיקרו-גרורתיים כחולים של תאים בודדים או מקבצי תאים קטנים על פני ריאות שאינן מבושנות; ביצוע פרפוזיה וקיבוע של הריאות במקום (in situ) שיפרו עוד יותר את יכולת הזיהוי של מיקרו-גרורות dun la z. עם זאת, לא נצפתה צמיחה למוקדים מאקרוסקופיים בעכברים שהוזרקו תאי LM eight של ביקורת. מוקדים מאקרו-גרורתיים שקופים, שבקושי ניתן היה לזהותם וקוטרם גדול מ-0.1 millimeter, זוהו בריאות שאינן מבושנות. פרפוזיה של הריאה לא שיפרה את זיהוי המוקדים.עם זאת, בעכברים שהוזרקו להם תאי ate LAC Z, זוהו מספר גרורות מאקרו כחולות בצביעת X gal על פני איברים שאינם מבושפים. כמו כן, זוהו גרורות מיקרו על פני איברים שאינם מבושפים. יתרה מכך, ביצוע פרפוזיה לריאות שיפר עוד יותר את יכולת הגילוי של גרורות מאקרו ומיקרו.כתוצאה מכך, גרורות מיקרו ומקרו הפכו לנראות בצפיפות גבוהה יותר ובמספר רב יותר, בעיקר בשל השקיפות של הרקמה המבושפת, שגרמה לכך שמוקדים הנמצאים מתחת לפני השטח של האיבר הפכו גם הם לנראים. ניתוח היסטולוגי נוסף באמצעות חתכי קריו של רקמת ריאה אישר את השיפור ביכולת הגילוי של גרורות ריאה בעכברים שהוזרקו תאי LAX Z transduced done ו-LM eight, ובעכברים עם גידולי ראשוניים שהגיעו מתאי Dun LAX Z. גרורות מיקרו או אפילו מוקדים של תא בודד זוהו בחתכי הריאה.דבר זה לא נצפה בעכברים עם גידולים ראשוניים של תאי הבקרה המתאימים. יתרה מכך, גרורות מאקרו היו גלויות יותר בעכברים שהוזרקו עם תאי LM eight LA C מאשר בבעלי חיים עם תאי הבקרה LM eight. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע פרפוזיה וקיבוע של ריאות ב-ZI two, ושל צביעה עוקבת של הגרורה בריאות שהוצאו.טכניקה זו מהווה מדד קצה רגיש מאוד לפיזור גרורות בריאה בכל סוג של מחקר סרטן, והיא יכולה לשמש גם כנקודת ייחוס לשיפור טכניקות דימות in vivo קיימות, כגון micro ct PET ו-MRI, המשמשות לזיהוי מוקדם של נגעים מטאסטטיים.

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אנו מתארים שיטה לתגובת הדמיה לטיפול נגד...

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות תא-stroma הגידול בתוך גרורות ריאה, ניצול כתבים ניאון בעכברים. באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאים חיים לפחות 4 שעות ויכול להיות מותאם ללמוד תנאים ריאות דלקתיות אחרות.

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה מולטיפוטונית לביצוע הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה של תא בודד של הריאה השלמה בזמן אמת באמצעות חלון הדמיה מיוצב ואקום.

לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק

במודל חיה יש צורך לפענח את התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום קולוניזציה ריאות במהלך גרורות סרטן. . הנה, הקמנו, לבצע בהצלחה של ויוו assay לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבה fibronectin פולימריים (polyFN) על CTCs ריאות קולוניזציה.

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

הגישה המתוארת משלבת הזנב הנסיוני גרורות מוסר עם הדמיה vivo live בעלי חיים כדי לאפשר ניטור בזמן אמת של גרורות סרטן השד היווצרות וצמיחה בנוסף לקוונפיקציה של מספר גרורות וגודל בריאות.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים משמשת לעתים קרובות במחקר גרורות, אבל נטל הגידול גרורתי יכול להיות קשה לנתח. כאן, אנו מדגימים מודל הזרקת וריד זנב של גרורות וכוללים גישה חדשנית לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי שנוצר.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

אנו מתארים מודל עכבר xenograft של גרורות במוח של סרטן השד שנוצרו באמצעות הזרקת ורידים בזנב של קו תאי סרטן שד דלקתי מוגבר אנדוגניים HER2.

מידול גרורות במוח באמצעות הזרקת ורידים בזנב של תאי סרטן שד דלקתיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת חלון אופטי השוכנות לצמיתות עבור בית החזה מורין, המאפשר הדמיה תוך-ויאלית ברזולוציה גבוהה של הריאה. קביעות החלון הופכת אותו מתאים היטב לחקר תהליכים תאיים דינמיים בריאה, במיוחד אלה המתפתחים לאט, כגון התקדמות גרורתית של תאים סרטניים מופצים.

חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

אתגר מרכזי בפיתוח טיפולים חדשים לסרטן ריאות כולל מידול המיקרו-סביבה של הגידול כאשר מחלה אזורית מתקדמת למחלה גרורתית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה להקמת מודל סינגני אורתוטופי של סרטן ריאות המאפשר מעקב in vivo אחר המחלה לאורך זמן.

שיטה זעיר פולשנית ליצירת מודל עכבר אורתוטופי סינגני של סרטן ריאות

למד פרוטוקול לזיהוי גרורות בריאות ברזולוציית תא בודד בעכברים באמצעות הדמיה משופרת. השיטה משלבת זליפה באתרו של הריאה וצביעת X-Gal לתאים מתויגים ב-LacZ.

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב

גלה סרטונים נוספים