ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב באתרו זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של LacZ תייג-

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשפר את הזיהוי של מיקרו גרורות בריאות העכבר ex vivo תוך שמירה על ארכיטקטורת הריאות המנופחות. זה מושג על ידי החדרת הריאה במקום עם PBS כדי להסיר את הדם, שהוא המקור העיקרי לרקע הצבע ברקמה זו. השלבים הבאים הם לנפח את הריאה על ידי הזרקת PFA, ואז לצבוט כדי לקבע את רקמת הריאה תחת ניפוח.

לאחר מכן, הריאה מוסרת ומתקבעת עוד יותר ב-PFA או אונות ריאה בודדות מוטמעות להקפאה. השלבים האחרונים הם לצבוע את הרקמות בתמיסת Xal ולדמיין את תאי הגידול LA zag, בסופו של דבר ניתן לזהות גרורות על אונות ריאה שלמות או בקטעי רקמת ריאה עד לרמת תא בודד באמצעות מיקרוסקופ דו-עיני או מיקרוסקופ אור. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו השמיים עומדים בפני עצמם, הוא שיכולת הזיהוי של מיקרו גרורות משתפרת במידה ניכרת עקב הסרת רקע הקשור לדם.

התחל את הפרוטוקול על ידי הרדמת עכבר בהזרקה תוך-צפקית של קטמין, קסילזין ו-ace promazine בכ-150 מיקרוליטר של PBS. כאשר רפלקסי הכאב של העכבר כבר לא נצפים, תקן אותו על שולחן הניתוחים. חזרו לאחור והחליקו את השיער עם 70% אתנול.

פתח את העור מהבטן עד הצוואר. משוך את העור לצדדים או הסר אותו. פתח בזהירות את הצפק בבית החזה כדי למנוע קרע של כלי דם גדולים כמו הווריד הצווארי.

זה ישפר את יעילות הזילוף. כעת חותכים את הווריד הנבוב מתחת לכבד באמצעות מזרק של 20 מיליליטר עם מחט בגודל 21 עד 24. הזרקו לאט 10 עד 15 מיליליטר PBS לחדר הימני של הלב הפועם עד שהריאה לבנה לחלוטין והלב מפסיק לפעום.

לאחר מכן צבט את כלי הדם מעל הכבד והסרעפת בעזרת מהדק כלי דם. טען מזרק של 10 מיליליטר עם 3% אלדהיד פרפורם, ועם מחט בגודל 21 עד 24 הזריק לחדר הימני. כשני מיליליטר.

חשוף את קנה הנשימה מחוץ לבית החזה ונפח את הריאה בזריקה לקנה הנשימה של כשלושה מיליליטר אלדהיד מחוץ לבית החזה. ואז מיד לאחר הסרת המחט, צבט את קנה הנשימה המכוסה לנקב בעזרת מהדק כלי דם והמתן 10 דקות כדי לאפשר קיבוע. לאחר מכן, חצו את כלי הדם מעל מהדק כלי הדם.

לאחר מכן הסר את המהדק והזריק כשני מיליליטר PBS לחדר הימני כדי להסיר עודף פורמלדהיד. לנקב את החלקים התחתונים של כל אונות הריאה בעזרת מחט ולהסיר את מהדק כלי הדם בקנה הנשימה. כעת הזריק שלושה עד חמישה מיליליטר של תמיסת הטבעה מדוללת לקנה הנשימה המחובר לזריקה השנייה.

הפסק את ההזרקה כאשר הסתרת הפרפורם באונות הריאה מוחלפת בתמיסה. הסר את הריאה בזהירות על ידי משיכת הלב במלקחיים ועל ידי מעבר רצועות רקמת חיבור, כלי דם וקנה הנשימה. הקפידו לשמור על הלב מחובר לריאות.

הניחו בצד אונה אחת לקטעי קריו והשתמשו ברקמת הריאה הנותרת לצביעה ארוכה שלמה. הניחו את הריאה בכוס פלסטיק עם מכסה סגור היטב וקבעו אותה עם 2% פורמלדהיד ו-PBS. הניחו חתיכת גזה על גבי הריאה כדי לשמור אותה בתמיסה ותנו לה לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר חצי שעה, הסר את תמיסת הקיבוע ושטוף את הרקמה היטב עם PB S3 פעמים, הכינו טרי את תמיסת ה-xal המוכנה לשימוש על ידי דילול מיליליטר אחד של תמיסת מלאי Xal, אחד עד 40 בתמיסת הצביעה הבסיסית והוסיפו לפחות 10 מיליליטר ממנו לכוס. שקע את הריאה עם חתיכת גזה. אבטח את המכסה בצורה רופפת כדי לאפשר חילופי אוויר ודגר אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש שעות מוגן מפני אור.

לאחר הדגירה, הסר את תמיסת ה-xal. שטפו את הריאות פעם אחת עם PBS כדי להסיר שאריות תמיסת xal והוסיפו לפחות 10 מיליליטר של 4% אלדהיד פרפורם ב-PBS. הרקמה מוכנה כעת להיסטולוגיה וניתן לאחסן אותה לאורך זמן ב-4% PFA בארבע מעלות צלזיוס.

התחל במילוי שליש מתבנית הטבעה במדיום הטמעה פולי פורז לא מדולל. לאחר מכן טען את אונת הריאה לתבנית והמשיך להוסיף בינוני עד שהאונה מכוסה לחלוטין. הימנע בזהירות מיצירת בועות אוויר כעת לדגור על האונה המוטבעת בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן, הכינו את הריאות המוטבעות לחיתוך על ידי הקפאה איטית שלהן בתערובת של קרח יבש ואיזופ פנטן. במידת הצורך, כעת ניתן להעבירם למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון על קטעי קריו חתוכים של שבעה עד 10 מיקרון של האונה הרכיבו את החלקים למגלשות מוכנות לקטע קריוס זמינות מסחרית לאחר ההרכבה, דגרו מיד את החלקים בתמיסת צביעת xal ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בתא לח. למחרת, שטפו את השקופיות ב-PBS פעמיים במשך חמש דקות בכל שטיפה.

לאחר מכן יש לשטוף מעט במים מזוקקים. כעת כתם את השקופיות באדום מהיר גרעיני למשך 10 שניות כדי לקבל כתם נגדי חלש שהופך את ה-xal לדומיננטי יותר ושטוף מיד את כתם הנגד במים מזוקקים. לכתם נגדי כהה יותר, האריכו את הזמן עד 30 שניות או יותר.

הרכיבו את המגלשות עם תושבת חיסונית. היווצרות גרורות בדגמי מערכת ההפעלה של LM שמונה עכברים נחקרה מחדש. באמצעות התמונות המייצגות המתוארות כאן של ריאות מוחדרות ולא מוחדרות של עכברים שהוזרקו בו זמנית עם תאי תמרה רפויה וללא התמרה מבוקרת ו-LM שמונה בעכברים שהוזרקו עם תאים מבוקרים.

גרורות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיות נותרו בלתי ניתנות לגילוי בריאות שאינן מחוררות ומעופשות. אך באופן מעניין בעכברים שהוזרקו עם תאי LA Z דון, צביעת xgl חשפה מוקדים מיקרו-גרורתיים כחולים של תאים בודדים או אשכולות תאים קטנים על פני הריאות הלא מחוללות בזלוף באתרם וקיבוע הריאות משפרים עוד יותר את יכולת הזיהוי של גרורות מיקרו dun la z, עם זאת, צמיחה למוקדים מקרוסקופיים לא נצפתה בעכברים שהוזרקו עם שמונה תאי ביקורת LM שקופים, מוקדי מאקרו גרורתיים בקושי הניתנים לזיהוי בקוטר של יותר מ-0.1 מילימטר זוהו בריאות לא מפוצצות. זלוף של הריאה לא שיפר את זיהוי המוקדים.

עם זאת, בעכברים שהוזרקו עם תאי LAC Z אכולים, התגלו גרורות מאקרו כחולות מרובות בצבע X gal על פני השטח של איברים שאינם מחולפים. מיקרו גרורות התגלו גם על פני השטח של איברים שאינם מחולפים. יתר על כן, זלוף של הריאות שיפר עוד יותר את יכולת הזיהוי של גרורות מאקרו ומיקרו.

כתוצאה מכך, גרורות מיקרו ומקרו נראו בצפיפות גבוהה יותר ובמספר גדול יותר בעיקר בשל השקיפות של הרקמה המוחדרת בה נראו גם מוקדים מתחת לפני האיבר. ניתוח היסטולוגי נוסף באמצעות קטעי קריו של רקמת הריאה אישר את יכולת הזיהוי המשופרת של גרורות ריאה בעכברים שהוזרקו עם תאי LAX Z שהועברו ו-LM שמונה בעכברים עם גידולים ראשוניים שמקורם בתאי Dun LAX Z. מיקרו גרורות או אפילו מוקדי תא בודד זוהו בקטעי ריאות.

זה לא נצפה בעכברים עם גידולים ראשוניים של תאי הביקורת המתאימים. יתר על כן, גרורות מאקרו נראו בבירור גם בעכברים שהוזרקו עם שמונה תאי LM C מאשר בבעלי חיים עם תאי LM שמונה בקרה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע זלוף וקיבוע ריאות ב- ZI 2 והצביעה לאחר מכן של הגרורות בריאות הכרות.

טכניקה זו היא נקודת קצה רגישה ביותר לפיזור גרורות בריאה בכל סוג של מחקר סרטן, ויכולה גם לשמש אמת מידה לשיפור טכניקות הדמיה נוכחיות in vivo כגון micro ct PET ו-MRI המשמשות לגילוי מוקדם של נגעים גרורתיים.