Ultrafiltration זרימה משיק: שיטה "ירוקה" לבחירת הגודל והריכוז של חלקיקי כסף Colloidal

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את ההיתכנות של שיטת סינון אולטרה תאגיפי (tangential flow ultra filtration) עבור נפחים גדולים יותר של ננו-חלקיקים קולואידליים ונפחים קטנים יותר של Tate. ראשית, סנתזו ארבעה ליטרים של ננו-חלקיקי כסף קולואידליים מסוג cretin. ודאו את איכות הקולואיד על ידי קביעת תהודה פלסמונית של השטח באמצעות ספקטרופוטומטריית בליעה ב-UV-vis.

בשלב הבא, השתמשו בסינון אולטרה-פילטרציה בזרימה מماسית (tangential flow ultrafiltration) כדי למיין, לבחור ולרכז קולואיד זה לארבעה מיליליטר של מים. לאחר מכן, כמותו של הכסף בקולואיד המקורי ובדגימות המייצגות של תהליך האולטרה-פילטרציה תימדד באמצעות ספקטרוסקופיית פליטה אופטית באמצעות פלזמה עם השראה (inductively coupled plasma optical emission spectroscopy). לבסוף, בצעו מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת (transmission electron microscopy) בשילוב עם עיבוד תמונה.

תוכנת Image J משמשת להצגת התפלגות הגדלים של ננו-חלקיקי הכסף בקולואיד המקורי ובסינון an ultra filtration הסופי. אנשים שאינם מנוסים בכימות ננו-חומרים באמצעות I-C-P-O-E-S יצטרכו ללמוד את נהלי ניקוי כלי הזכוכית, שהם קריטיים כדי להבטיח שהכלים נקיים מכל שארית של זיהום מתכתי. כמו כן, חשוב להתחשב בזמן הנדרש לעיכול תקין של הדגימות הקולואידליות ולהכנת תמיסות הכיול עבור ה-I-C-P-O-E-S.

בניגוד לשיטות אחרות כגון הפרדה לפי גודל, מסיסות תלוית גודל, כרומטוגרפיית הֶסְגֵּר לפי גודל, התגבשות שברית ואלקטרופורזה של ג'ל, שיטה זו מונעת בעיות כגון אגרגציה, רעילות של ריאגנטים של סינתזה, ציפויים לא רצויים, עלות גבוהה ו/או חוסר יעילות. את הסינתזה של ננו-חלקיקי ה-Colorado Suen ואת אפיון שלהם באמצעות ספקטרומטריית UV-Vis ו-ICP-OES ידגימו אוסטין וויליאמס, ג'ושוע בייקר וקתרין אנדרס, סטודנטים למחקר מהמעבדה שלי. שלום, אני ד"ר וולי ואני אבצע את הסינון בזרימה טנגנציאלית, וג'קי סיסקו תבצע את המיקרוסקופיה האלקטרונית. יש לנקות ביסודיות את כל כלי הזכוכית המתוארים בטקסט הנלווה.

השתמשו במים שעברו עיקור באוטוקלאב וקוררו ל-10 °C, והכינו 300 מיליליטר של תמיסת sodium borohydride בריכוז של שני מילימולר ו-100 מיליליטר של תמיסת silver nitrate בריכוז של מילימולר אחד. כעת, הוסיפו 300 מיליליטר מהתמיסה של sodium borohydride לבקבוק תגובה מסוג Erlenmeyer בנפח של 500 מיליליליטר המכיל מגנט Stir bar. עטפו את הבקבוקר בנייר אלומיניום כדי למנוע חמצון של כסף וערבבו על קרח.

כדי להכין ביורטה של 25 מיליליטר, שטפו אותה עם עמוד מלא של מים אולטרה-טהורים, ולאחר מכן שטפו אותה עם עמוד מלא של חומרי כסף חנקתי (silver nitrate). לאחר מכן עטפו את הביורטה בנייר אלומיניום ומלאו אותה בתמיסת כסף חנקתי. בחדר חשוך, הוסיפו 50 מיליליטר של תמיסת כסף חנקתי לתמיסת הנתרן או ההידריד.

כסו את החלק המרכזי של המכשיר באמצעות אוהל רדיד כדי למזער את החשיפה לאור. מלאו מחדש את אמבט הקרח מעת לעת במהלך זמן זה. המשיכו לערבב את התמיסה הקולואידית על קרח למשך 45 עד 50 דקות נוספות.

ההיווצרות של ננו-חלקיקי כסף מסומנת בשינוי צבע משקיפות לצהוב-זהוב, המאפיין את מקסימום תהודה של פלזמה שטחית (surface plasma resonance) של ננו-חלקיקי כסף. קררו את הקולואיד שהתקבל. מלאו קוvette חד-פעמית של 1 מיליליטר עם הקולואיד שנוצר ומים אולטרה-טהורים ביחס נפחי של 1 ל-10. לצורך תיקון קו בסיס (blank baseline correction), מלאו קוvette נוספת במים אולטרה-טהורים.

נגבו את החלק החיצוני של שתי ה-Q vets באמצעות Kim wipe. הגדירו את הספקטרופוטומטר למצב בליעה (absorbance mode) ממינימום Y של 0.5- למקסימום Y של 1.0. כמו כן, הגדירו את חלון הסריקה של X בין 200 ל-800 ננומטרים ובחרו בקצב סריקה מהיר עם תיקון קו בסיס (baseline correction).

הכנס את ה-Q vet המלא במים למכשיר ובצע סריקת בסיס (baseline scan). חזור על הפעולה במידת הצורך עד להשגת בקרת בסיס שאינה אפס. החלף את ה-Q.Vet הריק ב-Q vet עם הדגימה והפעל סריקת בליעה (absorbent scan) לאיסוף ספקטרום בליעת UV vis של הדגימה הקולואידית.

חברו צינור הזנה מסוג master flex 17 למשאבה הפריסטלטית כפי שמתואר בטקסט המלווה, בחרו כיוון פנייה נגד כיוון השעון באמצעות כפתור ה-DIR וודאו שכפתור המצב נמצא על INT. הגדירו את קצב השאיבה של המשאבה לפחות מ-300 milliliters per minute. לאחר מכן, בצעו ה priming למערכת על ידי יצירת ואקום בלולאת הסינון.

ברגע שהנוזל זורם בחופשיות במערכת, כבה את המשאבה, סגור את הפיה בחיבור הפיתולים והסר את התסמיך. הפעל שוב את המשאבה ונטר את מעגל הפיתולים לאיתור דליפות. כעת הגדל את קצב הזרימה של המשאבה בהתאם לגודל הפיתולים.

המשיכו בסינון עד שהנוזל בבקבוק המאגר כמעט יגמר וכבו את המשאבה, הנמיכו את קצב השאיבה ואספו את השארית (tate) מלולאת הסינון. השארית מורכבת מננו-חלקיקים הגדולים מ-50 nanometers. לאחר מכן, אספו את התסננת (filtrate), המורכבת מננו-חלקיקים הקטנים מ-50 nanometers.

ניתן להניח כי ה-Tate בטוח להמשך ניתוח, ואת התסננת משתמשים בשלב הבא. לאחר מכן, בוחרים ננו-חלקיקים שקוטרם פחות מ-20 nanometers. שוטפים את הצינורית ב-2% nitric acid במים אולטרה-טהורים.

חזור על תהליך הסינון עם מסנן CROs של 100 kilodalton. אסוף את הרטנט (reten) מלולאת הסינון. ניתן לרכז את הדגימה עוד יותר על ידי שימוש במסנן מיקרוס של 100 KD קטן יותר ובצינור בגודל 14 קטן יותר, עם קצבי משאבה נמוכים יותר של 30 mil ו-90 mil לשלבי ההכנה (priming) והסינון.

שיטה זו נועדה לכמת את הכסף לאורך שלבי הטהרה של הכנת ננו-חלקיקי הכסף. השתמשו במכלי פוליפרופילן בעלת דחיפות נמוכה כדי למנוע דליפה של כסף מהדגימות. ראשית, בצעו עיכול כימי של הדגימות באמצעות חומצה חנקית רכז.

הכינו בנוסף עקומת כיול לכסף באמצעות שמונה סטנדרטים. כעת הגדירו במכשיר ה-I-C-P-O-E-S את הפרמטרים של אורך הגל עבור כסף, הספק התדר הרדיואקטיבי (radio frequency power), זרימת הפלזמה, הזרימה העזרית ולחץ המערבל (nebulizer pressure). הגדירו את המכשיר למדידת דגימות בשלוש חזרות עם זמן חזרה של 10 שניות.

השתמש בזה עם זמן התייצבות מדידה של 15 שניות והשהייה בספיגת דגימה של 30 שניות. כמו כן, הקפד להכניס בנק (blank) של השיטה בין כל דגימה כדי להפחית זיהום צולב פוטנציאלי. כעת, טען את הדגימות ומדוד; לדלל את דגימת ה-100 kilodalton tate במים אולטרה-טהורים.

כעת, הניחו 20 µL מהקולואיד המקורי ומהדגימה המדוללת של 100 kDa על גבי רשתות זהב מצופות בטבחי 300 mesh. השאירו את הרשתות לייבוש באוויר. הגדירו את פוטנציאל ההאצה של מכשיר ה-TEM ל-70 kV כדי להדמות את ננו-חלקיקי הכסף; צלמו מיקרוגרפים אלקטרוניים באמצעות המצלמה ברזולוציה גבוהה ושמרו אותם כקבצי תמונה בפורמט TIFF.

בהכנה זו של ארבעה ליטרים של קרט וננוחלקיקי כסף קולואידליים, לקולואיד הסופי היה צבע צהוב-זהוב אופייני. ספקטרום בליעת ה-UV vis של קולואיד זה הראה שיא פלזמון שטח סימטרי וחד טיפוסי ב-394 nanometers. ספקטרום ה-Raman של קולואיד הקרטין המקורי ושל ה-100 kilodalton Tate הסופי הציגו רק שלושה מצבי תנודה.

מצב הכפיפה ב-1,640 ומצבי המתיחה הסימטריים והבלתי סימטריים של מים. תהליך an ultra filtration בזרם טנגנציאלי בשלושה שלבים לבחירת גודל וריכוז של ננו-חלקיקי הכסף הניב רטנט סופי של 100 kilodalton בנפח של ארבעה מיליליטרים. מרבית תוצרי הלוואי של הסינתזה ועודפי הריאגנטים הוסרו באמצעות הממס המים.

כמות הכסף נקבעה לאחר מכן באמצעות עקומת כיול I-C-P-O-E-S. במקרה זה, התנובה בפועל קרובה מאוד לתנובה התיאורטית הטיפית של 15.4 parts per million. עבור תגובת ה-cretin, הריכוז הגבוה של ננו-חלקיקי הכסף בא לידי ביטוי בשינוי דרמטי בצבע, מזהב וצהוב עבור הקולואיד המקורי לחום כהה עבור ה-100 kilodalton הסופי. מדידות ה-I-C-P-O-E-S אישרו את התצפיות החזותיות, וחשפו את ריכוז הכסף עבור ה-100 kilodalton הסופי.

מיקרוגרפים אלו של TEM של הקולואיד המקורי ושל התמיסה הסופית ב-100 kilodalton מעידים כי במצבם הבלתי מצובן, ננו-חלקיקי כסף מופיעים כאזורים שחורים עגולים על רקע אפור בהיר יותר. היסטוגרמות הגדלים של TEM אלו נבנו על ידי ניתוח של כ-800 ננו-חלקיקי כסף עבור ננו-חלקיקי הכסף של הקריאון המקורי ועבור התמיסה הסופית ב-100 kilodalton. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע סינון זרימה מماسית (tangential flow filtration) לצורך ריכוז ובחירת גודל של ננו-חלקיקי כסף.

ניתן לרכז נפחים שונים תוך מינימום אגרגציה. כמו כן, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן אפיון הננו-חלקיקים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך שישה שעות או פחות.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי לתמיסות קולואידליות בריכוז גבוה יהיה זמן חיים מוגבל גם בקירור. ניתן לנהל הגבלה זו באמצעות מחקר, תכנון והכנה קפדניים. זכרו, בעבודה עם ריאגנט של חומצה חנקית חמה במהלך העיכול הכימי עבור I-C-P-U-S, האנליזה עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים, כגון עבודה במכסה מסינונים כימית או לבישת ציוד מיגון מתאים בעת ביצוע הפרוצדורה.