כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את שיעורי תיקון הדנ"א ותמציות גרעיניות של תאים בזמן אמת באמצעות משואות מולקולריות שזוהרות לאחר שתיקנו. משואות מולקולריות לתיקון כריתה בסיסיות מורכבות מאוליגונוקלאוטידים דאוקסי במבנה לולאת גזע המכיל נגע בסיס יחיד עם שישה חלקי אוקסי פלואורסצאין עקומה מצומדים לחמשת הקצוות הראשוניים ודיל מוטי מצומד לשלושת הקצוות הראשוניים בעת קיפול. מוטי שש המשפחות מרווה על ידי דאב סיל בצורה לא פלואורסצנטית באמצעות העברת אנרגיית תהודה של יערן.

כדי להעריך את פעילות תיקון ה-DNA, משואות מודגרות עם תמציות גרעיניות של תאים, המכילות אנזימי תיקון. DNA גליקוזילט מזוהה ומסיר את נגע ה-DNA במשואה. אתרי ה-ABA המתקבלים הם מצעים לאנדונוקלאז AP אחד או קוף אחד עם זיהוי APE אחד מבקע את עמוד השדרה של ה-DNA באתר ה-ABA, ומאפשר ל-DNA המכיל את ששת המשפחות להתנתק בחופשיות מסיכת השיער.

ניתוק מהמרווה מביא לעלייה בקרינה שהיא פרופורציונלית לרמת תיקון ה-DNA וניתן להעריך אותה בזמן אמת באמצעות מכונת PCR כמותית בזמן אמת. היכולת לתקן נזק לדנ"א היא קריטית לכל תא ולכל אורגניזם. בין שלל מסלולי תיקון ה-DNA התאי, יעדי תיקון כריתת בסיס, בסיסים פגומים שעלולים לנבוע מעלבונות חמצונים או כימיים המבהירים את תפקידם של אלמנטים תאיים בודדים שעשויים להשפיע על תיקון כריתת בסיס היא אחת המטרות העיקריות במחקרי המעבדה שלנו.

ככזה, מדידת פעילות תיקון DNA בצורה מדויקת ורגישה הפכה לעניין במעבדה שלנו. בדיקה זו יכולה לספק נתונים כאלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תיוג 32 PN וניתוח על ידי אלקטרופורזה של ג'ל הוא שהטכניקה שלנו אינה משתמשת במצעים מסומנים רדיואקטיביים, יכולה למדוד שיעורי תיקון יבשים בזמן אמת ויש לה טווח דינמי גדול מאוד.

יתר על כן, גישה זו יכולה להשתמש במספר רביעיות פלואורו שונות ו/או נגעי בסיס כדי לקבוע את ספציפיות המצע. הראינו כי בדיקה זו כמותית מאוד ורגישה מאוד במסגרות שונות. בדיקת משואות מולקולרית לתיקון כריתת בסיס זו ניתנת לניתוח קינטי.

הרגישות והספציפיות הגבוהות של הבדיקה מאפשרות כימות מדויק של תיקון כריתת בסיס, ולכן היא שימושית עבור מסכי מעכבי תיקון או אימות. בנוסף, הוא ניתן להתאמה למדידת פעילות תיקון יבש ורקמות וליזטים של תאי גידול למדידות סמנים ביולוגיים פונקציונליים. בעת תכנון משואות מולקולריות שישמשו לבדיקה זו, שקול את האוליגונוקלאוטידים הבאים של DNA באורך 43 בסיסים כפי שמוצג כאן.

עבוד טוב. רצף ה-DNA אינו ייחודי, אך חייב לאפשר היווצרות מבנה סיכת ראש. כאשר כורע ברך כפי שמוצג כאן, הספציפיות מושגת על ידי החדרת נגעי בסיס ספציפיים כגון אוראציל או טטרה הידרו פורין.

במיקום X שישה בסיסים מחמשת הקצה הראשוני, תוכן ה-GC צריך להיות לפחות 32% ואין למקם בסיס GB בקצה החמישה הראשוניים. יש להצמיד שישה פלואורסצאין קרבוקסי או שש משפחות לקצה החמישי הראשי ויש לשנות את שלושת הקצה הראשוני עם דאב סיל. זה יהיה המצע לחלבוני תיקון ה-DNA כדי להבטיח קשירה ופעילות של שחרור הגליקוזיל.

מיקום הנגע נבחר כדי לספק מספיק מקום ממבנה סיכת הראש וקצה ה-DNA. אורך דופלקס הגבעול או סיכת הראש צריך להיות מינימום של 15 זוגות בסיסים. אורך הלולאה המומלץ הוא 13 בסיסים.

משואת הבקרה המולקולרית צריכה להיות זהה למשואה המולקולרית הניסיונית, אלא שהיא אינה מכילה נגע DNA. לכן אין לזהות אותו על ידי אנזימי תיקון DNA. לאחר שהמשואות המולקולריות בהישג יד, יש לבצע הערכת איכות כדי להבטיח שהמשואות לא יזוהרו עד לחימום.

וכדי לקבוע את טמפרטורת ההיתוך האופטימלית, יש לבצע את כל השלבים במהלך הליך החילוץ על קרח או בארבע מעלות צלזיוס. כדי להבטיח יציבות חלבון, התכוננו לניסוי על ידי קירור מראש. שתי כוסות ליטר אחד לכל דגימה תאי דיאליזה חיץ, מיקרו צנטריפוגה, צינורות, מזרקים ומחטים.

סמן צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר והניח אותם על קרח. שאפו את מצע הגידול מהתאים ואז שטפו אותם פעמיים עם 7.5 מיליליטר PBS קר לאחר הכביסה השנייה. הוסף חמישה מיליליטר PBS קר לכל מנה והשתמש במרים תאים כדי לגרד את התאים מהצלחת.

העבירו את התאים לצינור חרוטי צונן של 15 מיליליטר, ואז צנטריפוגה ב -500 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. אחרי הסיבוב, הסירו את הסופרנטנט והעריכו את נפח התא הארוז על ידי השוואה לכמויות ידועות של נוזל בצינורות דומים. צנטריפוגה את הצינורות למשך דקה נוספת ואז הסר את ה- PBS שנותר בעזרת החזרת פיפטה.

השעו את גלולת התא ב-150 מיקרוליטר של מגיב מיצוי מכסח גרעין אחד לכל 50 מיקרוליטר של נפח תא ארוז. לאחר מכן העבירו את התאים התלויים לצינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר ומערבולת למשך 15 שניות במהירות גבוהה. לאחר המערבולת, דגרו את הצינור על קרח למשך חמש דקות, ואז מערבולת למשך 15 שניות נוספות וצנטריפוגה ב-13,000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הסיבוב, הסר והשליך את הסופרנטנט, המכיל את החלק הציטופלזמי. Resus השעו את הגלולה בתערובת של מיקרוליטר אחד של קוקטייל מעכב פרוטאז מושעה 100x, מיקרוליטר אחד של 100 מילי-מולרי DTT ו-75 מיקרוליטר של מיצוי מכסח גרעין. מגיב שניים לכל 50 מיקרוליטר של נפח תא ארוז.

תאי מערבולת למשך 15 שניות במהירות גבוהה. דגירה על קרח במשך חמש דקות ושוב מערבולת במשך 15 שניות בצנטריפוגה במהירות גבוהה ב-13,000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב משתמשים במזרק כדי להעביר את הסופרנטנט, המכיל את החלבונים הגרעיניים לקלטת דיאליזה עם חתך של 7,000 משקל מולקולרי.

לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של DTT טוחנת אחת ל-500 מיליליטר של מאגר דיאליזה מקורר מראש ודיאליזה את הליזאט למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס תוך ערבוב עדין. לאחר 90 דקות, העבירו את קלטת הדיאליזה לכוס שנייה המכילה 0.5 ליטר מאגר דיאליזה מקורר מראש עם DTT ודיאליזה. הליזאט למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין לאחר דיאליזה, ייתכן שהתמצית התגבשה עקב ריכוזי חלבון גבוהים.

לאחר מכן, הכנס מזרק חדש לפתח שונה מזה ששימש להזרקת הקסטה ואסוף את תמיסת החלבון הגרעיני בדיאליזה מקלטת הדיאליזה. נסה לכלול גבישים בעלי מראה עכור בעת הסרת תמיסת החלבון הגרעיני בדיאליזה. יש לצרף את הדגימה לצינורות מיקרו צנטריפוגה 20 מיקרוליטר כל אחד, להקפיא במהירות על קרח יבש ולאחר מכן לאחסן אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הצורך.

קבע את ריכוז החלבון ובצע בקרת איכות כמתואר במסמך הנלווה. כדי לבצע את בדיקת המשואה המולקולרית, יש להפשיר ולדלל את התא לשני מיקרוגרם למיקרוליטר חלבון עם מאגר תגובת תיקון בסיסי המכיל מילי-מולרית אחת של DTT, יש לדלל את המשואות המולקולריות ל-200 מיקרומולר עם מאגר תגובת תיקון כריתה בסיסי. מכיוון שמכונת ה-PCR הכמותית בזמן אמת אינה משמשת בדרך כלל כפלואורמטר, שנה את שיטת ההפעלה במכונת ה-PCR הכמותית בזמן אמת כדי לאסוף נתונים כל 20 שניות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 180 מחזורים לפחות.

לאחר מכן כל 20 שניות למשך 15 מחזורים בפלואורסצנטיות המקסימלית של המשואה המולקולרית כדי לקבל נתונים לנורמליזציה. הגדר את נפח התגובה ל-25 מיקרוליטר. לאחר מכן הגדר את עיצוב הצלחת במכשיר באמצעות תוכנת הביו-סיסטם המיושמת עם עקומה סטנדרטית שנבחרה כסוג הניסוי, השלם את פריסת הצלחת.

דוגמה מוצגת בטבלה זו, אותה ניתן למצוא גם במסמך הנלווה. אל תוסיף דבר לבאר שנבחרה כעקומה הסטנדרטית. הנח את מאגר תגובת תיקון הכריתה הבסיסי ליזאט תאי DTT בריכוז של שני מיקרוגרם למיקרוליטר ואת כל המשואות המולקולריות המשמשות בניסוי על קרח.

לאחר מכן הוסף את ה-DTT למאגר תגובת תיקון הכריתה הבסיסי לריכוז סופי של פיפטה מילי-מולרית אחת. 15 מיקרוליטר של מאגר תגובת תיקון כריתה בסיסי עם DTT לכל באר של צלחת Q-R-T-P-C-R אופטית תואמת על קרח. לאחר מכן, בעקבות פריסת הצלחת, פיפטה את המשואות לבארות המתאימות.

יש לבחון כל שילוב של ליזאט ומגדלור מולקולרי או בקרה בשלוש עותקים. לבסוף, פיפטה חמישה מיקרוליטר לבאר של הליזאט הגרעיני המדולל לבארות המתאימות. חשוב לזכור לשמור על כל ריאגנטים של המשואות המולקולריות קרים ולהכניס את הליזטים לצלחת כשלב האחרון.

זכרו, הליזטים מכילים חלבונים פעילים והם יתחילו לתקן את המשואות המולקולריות ברגע שהן יוחדרו לתערובת התגובה. לכן, חשוב מאוד לשמור על כל הריאגנטים קרים כדי למזער את כמות תיקון המשואות המתרחשת לפני שתתחיל לבצע מדידות. לאחר הוספת הכל, אטמו את הצלחת בסרט דבק אופטי וערבבו על ידי הקשה עדינה על הצלחת.

לאחר מכן בצע סיבוב מהיר של עשר שניות עם צנטריפוגה כדי לאסוף פתרונות בתחתית הצינורות או הצלחת לאחר הסיבוב, הכנס את הצלחת למכונת ה-PCR הכמותית בזמן אמת והתחל את הבדיקה לאחר השלמתה, ייצא את הנתונים הגולמיים רצוי בפורמט Excel ופעל לפי ההוראות במסמך הנלווה כדי לנתח את הנתונים לאחר ביצוע החישובים הדרושים. שרטט את נתוני הקרינה המנורמלים כאחוז חופשי כנגד זמן בשניות בתרשים פיזור עם שגיאות מתאימות להערכת פעילות תיקון ה-DNA ואיכות התמציות הגרעיניות מתאי LN 4 28 וקו תאים של ביטוי יתר MPG המוגדר כ-LN 4 28 MPG. הבדיקה המתוארת בסרטון זה בוצעה באמצעות משואה מולקולרית המכילה את APE one substrate tetra furin כבקרה חיובית.

כפי שמוצג באיור זה, לשני קווי התאים יש פעילות APE אחת חזקה כפי שמצוין על ידי המדרון התלול, פעילות גליקוזה של DNA ספציפית להסרת מצע MPG. היפו היפוקסנטין המצוין כ-HX נמדד בליזטים גרעיניים משני קווי התאים. כל ליזט נותח באמצעות משואה מולקולרית לתיקון כריתה בסיסית או משואה מולקולרית HX לתיקון כריתת בסיס עבור משואת הבקרה LN 4 28 מוצג בירוק ו-LN 4 28 MPG מוצג בסגול עבור משואת ההיפו.

LN 4 28 מוצג בכחול ו-LN 4 28 MPG מוצג בכתום. התוצאות מדווחות כ-A יחידות הקרינה הממוצעות ו-B, הקרינה המנורמלת. עלייה תלוית זמן בקרינה המעידה על תיקון HX התרחשה בכל תא.

ליזאט דגר עם המשואה המולקולרית HX כצפוי. לקו התאים LN 4 28 MPG המצוין על ידי העקבות הכתומות היה קצב תיקון גבוה בהרבה כפי שמצוין על ידי הצטברות מהירה יותר של פלואורסצנטיות מאשר קו התאים ההורי LN 4 28, שיש לו חלבון MPG מינימלי. לפיכך, ניתן למדוד את קצב התיקון של נגעי DNA ספציפיים על ידי חלבוני תיקון ספציפיים מתמציות תאים בזמן אמת עם רמות רקע מינימליות של מחשוף DNA לא ספציפי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעצב את המשואות המולקולריות שלך ולמדוד את שיעורי תיקון ה-DNA בזמן אמת באמצעות חלבונים מטוהרים או ליזטים של תאים. ביחס לניתוח, חיוני להעריך את הטווח הדינמי וערכי הרקע עושים זאת על ידי הכללת תגובות בקרה כגון עם או בלי משואות הבקרה החיוביות והשליליות. בהתחשב בשונות הבאר לבאר, כדאי לנרמל את הנתונים בבארות הבודדות לערכי הקלט.

אלה נקבעים על ידי הצעד העדין יותר בטמפרטורת ההיתוך. זה והכללת צבעים אחרים כמו קוביית סלע יסבירו את השונות הטבועה בשגיאות פיפטינג או הבדלים בגלאים. טכניקה זו אפשרה לנו להבהיר את ההשפעה של רכיבי תיקון כריתה מבוססי פרט על פעילות התיקון הכוללת ויכולתה.

הוא רגיש מספיק כדי לחשוף שינויים קטנים שלא היו ניתנים לזיהוי בשיטות קונבנציונליות.