פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

המטרה הכוללת של הליך זה היא למקסם את המידע של הקריאות המולקולריות הקשורות לוויסות הדופמין מדיסקציה של רקמה בודדת מהאזורים הסומאטו דנדריטיים של גשם המוח האמצעי. זה מושג על ידי ביצוע תחילה דיסקציה מדויקת כדי להפריד את הניגרה המשמעותית מאזור הקטע הגחוני. השלב השני הוא עיבוד הרקמות לניתוח דופמין על ידי HPLC ועיבוד נוסף של החלבון האנדוגני המשקע לניתוח.

לאחר מכן, עיבוד החלבון המשקע לתכולת החלבון הכוללת מאפשר לקבוע אילו חלבונים המווסתים דופמין או זרחון חלבון ניתן למדוד בשילוב עם קריאת תכולת רקמת הדופמין בדגימה. בסופו של דבר, ניתוחי הדופמין והחלבונים המווסתים שלו במוח האמצעי הבדיד. אזורים דנדריטיים של סומאטו מאפשרים להסיק מסקנות לגבי המנגנונים המולקולריים הקשורים לוויסות דופמין.

המונואמינים משפיעים על תוצאות התנהגותיות רבות, ואכן חוקרים בתחום ההתמכרות, הביולוגיה ותפקוד לקומוטורי כמו במיוחד במחלת פרקינסון מתעניינים מאוד באופן שבו מונו פירושו כמו דופמין, שאותו אנו חוקרים במעבדה שלי, משפיע על תוצאות התנהגותיות. אבל החשיבות של חקר אמצעי המונו יכולה להיות מעוטרת עוד יותר אם נבין כיצד הם מווסתים ברמה המולקולרית. היתרון של הטכניקה שלנו הוא שאנו יכולים לקחת מדגימה בודדת שהתקבלה מרקמת מערכת העצבים המרכזית, קריאות מרובות מאותה דגימה אחת כדי שנוכל לקבל קריאה מלאה של האופן שבו אירועים מולקולריים משפיעים על חוסר הוויסות של אמצעי מונו.

אנחנו יכולים לקחת את הנתונים האלה ואז לשים אותם בהקשר של איך ההתנהגות הולכת להיות מושפעת. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שקביעת חלבון וזרחון דורשת ידע כמה חלבון כולל יידרש לקריאה מדויקת בהתאם לנוגדנים שנבחרו על ידי החוקר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.

טכניקות הדיסקציה וקביעת אמצעי מונו עם החלבונים המווסתים היא גישה חדשה יחסית לניתוח ויסות in vivo. כדי להתחיל בהליך זה, צנן את מטריצת מוח המכרסמים, צלחת פטרי המכילה חמישה סכיני גילוח ואזמל מספר 11 על מצע של קרח רטוב. כמו כן, יש לקרר מראש כמה צינורות הדרושים לדיסקציה על קרח יבש.

לאחר מכן, לאחר הקרבת חולדה, הסר את המוח שלה והנח את המוח הפוך כשהמוח הקטן הצדדי מתאים לחריצים במטריצה הקרה כקרח. לאחר דקה, הכנס את סכיני הגילוח הקרים למוח הקר, החל משני מילימטרים, רוסטרל לכיאזמה האופטית לניתוח הסטריאטום וגרעין האקומבנס. לאחר מכן המשיכו להכניס את סכיני הגילוח הקרים בכל קטע מילימטר אחד עד לאמצע הבריכות הבא, תנודדו את המיקום של כל סכין גילוח כדי להקל על ההסרה מהמטריצה.

כשאתם שולפים את סכיני הגילוח, חפשו את תחילת ההיפוקמפוס מכיוון שהוא המדריך הטוב ביותר להבטחת נוכחותם של ה-SN וה-VTA במיקום שבו ההיפוקמפוס עוטף לחלוטין את המוח האמצעי. קח קטעים עם להב האזמל מספר 11 כדי לנתח תחילה את ה- SN מה- VTA. הסר את קליפת המוח וההיפוקמפוס שמעליו.

לאחר מכן בצע חתך אנכי המפריד בין האזור הפיגמנטי של ה- SN לבין ה- VTA, וודא כי לסכין הגילוח יש מגע מתמיד עם הקרח הרטוב במהלך הדיסקציה. לאחר מכן, בצע חתך אופקי בקו האמצע או בסמוך לו, ממש מעל החלק הגבי והרוחבי של רוב ה-sn. לבסוף, הרחיקו את ה-SN משאר גזע המוח.

לאחר הסרת ה-SN, הרחיקו את ה-VTA משאר המוח האמצעי. הנח את הרקמות המנותחות לתוך צינורות המיקרו פוגה שלפני הקירור מיד. לאחר מכן אחסן את הרקמות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לעיבוד.

בהליך זה, הומוגניזציה עדינה של הרקמה מיד לאחר ההסרה מקרח יבש באמצעות 0.1 מולר קר כקרח לכל תמיסת EDTA של חומצה כלורית. לאחר מכן, שמור את הדגימה שוב על קרח יבש. לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימות ב-12,000 סל"ד למשקעים.

כדור החלבון שישמש לקביעת האצווה המערבית שואב לאחר מכן את הסופרנטנטים לתוך בקבוקון HPLC. הנח את כדורי החלבון המשקעים שעדיין קפואים שמקורם בטיפול חיץ HPLC על הקרח הרטוב כדי להפשיר וודא שכל המאגר הוסר ואוחסן. לעיבוד דו-צדדי של ה-SN הוסף 300 מיקרוליטר של 1% SDS המכיל חמישה טריס מילי-מולרי, ו-EDTA מילי-מולרי אחד לגלולה ולסוניקט, ואילו לעיבוד דו-צדדי של ה-VTA יספיקו 200 מיקרוליטר של 1% SDS.

לאחר מכן, הכניסו את הדגימות למים הרותחים למשך כחמש דקות כדי להשלים את דנטורציה של החלבון. לאחר מכן הניחו להם להתקרר לטמפרטורת החדר, וודאו שהכובעים מאובטחים בשלב זה. לאחר מכן השתמש בבדיקת BCA עם טווח עקומת חלבון סטנדרטי של שניים עד 40 מיקרוגרם חלבון.

כדי לקבוע את ריכוז החלבון בחמש דגימות המיקרוליטר, השתמש בערך החציוני המתקבל מניתוח משולש כדי לקבוע את כמות החלבון מול העקומה הסטנדרטית. חלקו את התוצאה בנפח הדגימה לריכוז החלבון. לאחר מכן, הכינו את הדגימות עם מאגר הדגימה המכיל DIO שלושה אטול להפחתת אלקטרופורזה SDS על ג'ל אקרילאמיד 10% במידת הצורך, כפי שמצוין על ידי צבע מאגר דגימה.

שנה לצהוב, הוסף לדגימה pH בסיס טריס טוחנת אחת 8.2 במרווחים של 10 מיקרוליטר עד שהצבע הכחול ניכר. כדי להבטיח pH תקין, יש להריץ את הכמות המתאימה של החלבון הכולל באמצעות דף SDS על ג'ל אקרילאמיד 10%, ולאחר מכן להעביר את החלבונים לגודל נקבוביות של 0.45 מיקרון. ניטרוצלולוז, הגדר את מיכל ההופר ל-27 וולט לפחות ואפשר להעברה להתבצע למשך הלילה.

למחרת יש לייבש את הכתם למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן מכתימים אותו בתמיסת פונצ'ו S למשך כחמש דקות. לאחר מכן, עצרו אותו במרץ עם תמיסת חומצה הידרוכלורית 0.2% עד שרצועות החלבון הבודדות נפתרות בבירור והסרת צביעת הרקע.

לאחר מכן קבל תמונה של צביעת הפונצ'ו S באמצעות תמונה J על מנת לכמת עוד יותר את עומסי החלבון היחסיים בכל נתיב ולנרמל את התוצאות של טירוזין הידרוקסילאז, טרנספורטר דופמין או טרנספורטר מונואמין שלפוחית שניים המוצגים כאן הם הכתם המערבי של טירוזין הידרוקסילאז זרחני 31 סורי בדגימות של ניגרה משמעותית של חולדה. העקומה הסטנדרטית הסורית המכוילת 31 טירוזין הידרוקסילאז זרחני נעה בין 0.3 ננוגרם ל-2.0 ננוגרם ונמצאת בטווח הזיהוי הליניארי. הנה הכתם המערבי של 40 טירוזין הידרוקסילאז זרחני סורי בדגימות הגחון של החולדה.

העקומה הסטנדרטית המכוילת SN 40 טירוזין הידרוקסילאז זרחני נעה בין 0.2 ננוגרם ל-1.5 ננוגרם ונמצאת בטווח הזיהוי הליניארי. שמירה על טמפרטורה נכונה חשובה כמו גם תיוג הצינורות. חשוב גם לנרמל חלבון כדי להפחית את השונות של התוצאות.

פרוטוקול זה, כאשר מקפידים עליו ביסודיות, יכול לתת לחוקרים בתחום תפקוד הקטר והתנהגות התמכרות, קריאות מולקולריות נרחבות המשפיעות על ויסות מונו-ממוצע ועל המוח, במיוחד דופמין, וזה מה שמעניין אותנו. וכתוצאה מכך, קריאות אלה יכולות לתת ניתוח מפורט ויסודי מאוד של המשמעות של תוצאות התנהגותיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למקסם את הקריאות של ויסות מונואמין באזור הטגמנטלי המשמעותי של הניגרה והגחון מדיסקציה של רקמה אחת.