שינוי שיטת EPA 1623 שמשתמש תזרים משיק הולו סיבים Ultrafiltration ומחממים צעדים ניתוק לזהות waterborne

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות ולהדגים מינים של cryptosporidium ו-giardia המועברים במים. דבר זה מושג תחילה על ידי ריכוז דגימת המים באמצעות סינון אולטרה (ultra filtration) של סיבים חלולים בזרימה טנגנציאלית. השלב השני הוא אלוציה של האורגניזמים ולכידת השאריות מהמסנן לאחר שלב של סריפוגציה.

הפרדה אימונו-מגנטית מאפשרת הפרדה סלקטיבית של הטפילים מתוך השאריות המרוכזות. חרוזי מגנט מופרדים מהטפילים על ידי דיסוציאציה תרמית ומוסרים באמצעות מגנט. לאחר מכן, ציסטות ו-O cysts מונחות על סלייד, והדגימה נצבעת לצורך ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה.

היתרון המרכזי של סינון hofi על פני טכניקות קיימות הוא שהמסנן האולטרה זול משמעותית ולוכד מיקרואורגניזמים מרובים בנוסף ל-Cryptosporidium ו-Giardia, כגון וירוסים וחיידקים. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בהפרדה אימונולוגית יתקלו באתגרים בשל הכמות והסוג של השאריות הקשורות לדגימות שונות מתנאי אקלים שונים. התחילו בהרכבת מכשיר הסינון האולטרה בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית.

לאחר ההרכבה המכשיר פועל באופן הבא: דגימת המים נכנסת למערכת דרך מחבר ה-T השחור ועוברת דרך ראש המשאבה, מד הלחץ ואל תוך מסנן an ultra filter מסיבי חלולים; המים המסוננים יוצאים מצדו של המסנן אל מיכל הפסולת. המים שנותרו, המכילים את האורגניזמים, נדחפים לבקבוק ה-retentate ומסחררים במערכת עד לנפח המים המצומצם. כדי להתחיל בפרוצדורה, הסר את מכסה האוורור ופתח את כל התפסנים למעט את תפסן הלחיצה שתיים, שצריך להיות סגור כדי לאפשר לבקבוק ה-retentate להתמלא במים; הגדר את כיוון המשאבה כך שדגימת המים תזרום אל תוך המסנן.

לאחר מכן, כווננו את מהירות המשאבה ל-25% והפעילו את המשאבה כאשר בקבוק ה-renate מלא עד לשני שלישים. סגרו את התפסן השני ואטמו במהירות את הבקבוק בעזרת מכסה האוורור. בדקו את כל הצינורות והחיבורים כדי לוודא שאין דליפות.

לאחר מכן, הגדל באיטיות את מהירות המשאבה לכ-1.5 liters per minute באמצעות משיעור וטיימר או מד זרימה, ואמת שקצב הסינון – קצב המים היוצאים מקו השפכים – הוא אכן 1.5 liters per minute. עקוב אחר תהליך הסינון כדי להבטיח שבקבוק השמירה (reten bottle) לא יתרוקן, אף שנפח הנוזל עשוי לעלות או לרדת מעט. אם הנפח יירד מתחת לשליש, הסר את מכסה האוורור וסגור את תפס הלחיצה השני.

שוב, אפשרו לנפח בבקבוק לעלות לשני שלישים. לאחר מכן, סגרו את מכסה האוורור בצורה הדוקה ופתחו שוב את תפסית הסגירה שתיים. ברגע שמיכל הדגימה מתרוקן, סגרו מיד את תפסית הלחיצה אחת והפחיתו את מהירות המשאבה ל-20%. הסירו את מכסה האוורור מבקבוק הרטנטט (retentate) וסגרו את תפסית המעבר המחברת בין צינור השפכים של עמודת הסינון למיכל הפסולת.

הדק או שחרר את תפס המגס כדי לכוונן את הנפח בבקבוק השאריות (retentate) לכ-200 milliliters. לאחר מכן, הדק את תפס המגס עבור תמיסת האלוציה כדי לשטוף את הדגימה. ראשית, הוסף 500 milliliters של תמיסת אלוציה למכל הדגימה, תוך שטיפת פנים המכל במהלך התהליך.

לאחר מכן, הכניסו את הפ pipette בנפח 10 milliliter המחוברת לקו ספיגת הדגימה לתוך מכל תמיסת ה-elucian. פתחו את תסמיך הצביטה one וסגרו את תסמיך הצביטה two לרגע כדי לשאוב את תמיסת ה-elucian. ברגע שכל התמיסה נטענה, סגרו את תסמיך הצביטה one, פתחו את תסמיך הצביטה two ואפשרו לתמיסה להזרים במשך חמש דקות במהירות משאבה של 20% הדקו או שחררו את תסמיך ה-ramp כדי לכוונן את נפח הדגימה בבקבוק ה-renate לכ-100 milliliters.

לאחר מכן, הדק את תפס הרמפה לחלוטין ואפשר לדגימה להסתובב במעגל למשך דקה אחת. בנקודה זו, הפוך את כיוון המשאבה למשך 20 שניות. פעולה זו תוביל להצטברות של כ-225 milliliters של דגימה בבקבוק tate.

לאחר מכן כבו את המשאבה. הסירו את הצינורית מראש המשאבה ואת הצינורית שיוצאת מהמסנן, והחזיקו את הצינורית מעל בקבוק ה-tate כדי לדחוף את שארית הדגימה לתוך הבקבוק. לאחר מכן נתקו את כל הצינוריות מהבקבוק והחליפו את פקק האוורור בפקק אטום.

העבר את הדגימה המרוכזת לשפופרת צנטריפוגה קונית של 250 milliliter. שטוף את בקבוק השאריות פעמיים עם 10 milliliters של מים רהיטים (reagent water) והעבר את נוזל השטיפה לשפופרת הצנטריפוגה. סבב את הדגימה בצנטריפוגה במהירות מינימלית של 1500 ×g למשך 15 דקות.

אין להשתמש בבלימה כדי להפסיק את הסבוב בצנטריפוגה. לאחר הסבוב, יש לשאוב בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) עד לגובה של חמישה מיליליטרים מעל המשקע (pellet). יש לנקוט משנה זהירות כדי להישאר בחלקו העליון של מפלס הנוזל ולהימנע משאיבת O cysts וציסטות שנמצאות בתוך המשקע.

יש לנער את המבחנה ב-Vortex כדי לערבב את המשקע באופן יסודי. לאחר מכן, העבירו את הדגימה למבחנת dyal L 10 בעלת דופן שטוחה המכילה מיליליטר אחד של 10 X SL buffer A ומיליליטר אחד של buffer B. שטפו את מבחנת הצנטריפוגה פעמיים עם 2.5 milliliters של reagent water והוסיפו את תמיסת השטיפה למבחנת ה-dyal L 10. כדי להביא את הנפח הסופי ל-12 milliliters, הוסיפו למבחנה 100 microliters מכל אחד של נוגדנים anti cryptosporidium ו-anti giardia המשורשרים לחרוזי מגנט.

לאחר מכן, סובב את המבחנה במהירות של 18 RPM למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות מערבל סיבובי. הצמד את הצד השטוח של המבחנה למגנט MP six ונער את המבחנה בעדינות במשך שתי דקות מבלי להסירה מהמגנט. השאר את הצד השטוח פונה כלפי מעלה ושפוך את הנוזל העליון (supernatant).

יש להקפיד לא להפריע לחרו지를 שנשמרו בצדו השטוח של המבחנה בקרבת המגנט. הוצא את מבחנת הדגימה מהמגנט ושטוף את צדו השטוח של המבחנה שלוש פעמים עם 500 µL של buffer A, תוך הימנעות משאריות החומר בצדו העגול של המבחנה. העבר כל נפח שטיפה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL המוצבת בתוך מגנט MPCS.

כאשר המגנט נמצא במצב אנכי, סגרו את המבחנה ונערו אותה בעדינות במשך דקה אחת. לאחר מכן, בעוד המגנט במקומו, שאבו את העליון (supernatant) באמצעות פיפטת פסטור הממוקמת בתחתית המבחנה, והוסיפו בעדינות 1 mL של PBS למבחנה.

יש להיזהר לא להפריע למשקע החרו지를. הצמידו את הדופן של המבחנה לסמוך למגנט. הסירו את פס המגנט ונערנו את המבחנה בעדינות עד להשעיה מחדש של החרוזים.

החזירו את הפס המגנטי למצב אנכי. נערו את המבחנה בעדינות במשך דקה ושאבו את הנוזל העליון (supernatant), תוך הסרה של כמה שיותר שיירי חומר מבלי להפריע לחרו지를. לאחר שטיפה זו, הסירו את המגנט והוסיפו 50 microliters של מים למס (reagent water) ישירות על גבי פלטת החרוזים.

ערבבו את המבחנה במיקסר וורטקס (Vortex) במהירות מלאה למשך 50 שניות כדי לתלות מחדש את החרו지를. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 80 °C למשך 10 דקות, כדי לאפשר לציסטות ה-Giardia ולציסטות ה-Cryptosporidium להתנתק מהחרו지를. לאחר הדגירה, ערבבו את הדגימה בוורטקס למשך 30 שניות. לאחר מכן, הכניסו את הרצועה המגנטית ל-MPCS במצב נטוי כדי להפריד את החרו지를 מהציסטות ומה-O cysts שנמצאים בתסמין.

העבירו את supernatant המכיל cysts ו-O cysts לשקופית עם בארות. חזרו על שלבי הוספת המים, ה-vortex והדיסוציאציה בחום פעם שנייה, והוסיפו את ה-supernatant לאותה שקופית. לאחר מכן, הניחו את השקופית על מחמם שקופיות בטמפרטורה של 37 °C כדי לייבש את התרחיף.

התחילו במריחה של 50 µL מתנול על העגלה כדי לקבע את הדגימה והניחו לה להתייבש בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תמיסת DPI והדגירו את העגלה למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לצביעת הגרעינים, השתמשו בנייר ניגוב מסוג Kim wipe כדי לספוג את הנוזל מהבאר, תוך הקפדה לא לגעת בדפנות הבאר.

לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של easy stain כדי לצבוע את דופן התא של ציסטות ה-Giardia וציסטות ה-cryptosporidium. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 35 °C למשך 30 דקות. הסירו את הצבע באמצעות Kim wipe כפי שנעשה קודם לכן.

לאחר מכן, הוסיפו באיטיות 300 µL של תמיפת קיבוע קרה מסוג easy stain, על ידי הנחת קצה הפ pipette בזהירות מחוץ לבאר והנחת הנוזל לזרום לתוכה. הדגירו את הפלטה למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את התמיפה באמצעות נייר kim wipe ומרחו 10 µL של תמיסת קיבוע (mounting medium). הניחו בעדינות זכוכית כיסוי על הדגימה, תוך הסרת בועות אוויר, ואטמו את זכוכית הכיסוי באמצעות לק שקוף. בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, בחנו את הפלטה בהגדלה של 200 x עד 1000 x, ותחילה עם מסנן fse ולאחר מכן עם מסנן DPI בהגדלה של 200 x. ציסטות ו-O cysts יופיעו כמבנים סגלגלים פלואורסצנטיים בצבע ירוק תפוח זוהר עם שוליים מודגשים בבהירות.

ציסטות של Cryptosporidium O הן עגולות וגודלן נע בין ארבעה לשישה מיקרונים. ציסטות של Giardia גדולות יותר, עם רוחב של חמישה עד 15 מיקרונים ואורך של שמונה עד 18 מיקרונים, ויכולות להיות עגולות או סגלגלות בהגדלה של 1000x. ובשימוש במסנן DPI, ניתן להתרשם טוב יותר מהמבנה הפנימי של הציסטות וה-CYS.

בדרך כלל, ניתן להבחין בעד ארבעה ספורוזואיטים, הנראים כגרעינים בצבע תכלת בצביעת DPI, בתוך ה-Cryptosporidium O cys וה-Giardia Cys.DIC. מיקרוסקופיה יכולה לסייע גם בזיהוי נכון של הטפילים, שכן ניתן להבחין במאפיינים מורפולוגיים נוספים. ספורוזואיטים של Cryptosporidium עשויים להיות נראים ב-DIC; ציסטות של Giardia מציגות לעיתים קרובות מבנה פנימי אחד או יותר שניתן להבחין בו, כגון גרעינים נראים, אברונים בצורת סהר הנקראים גופי ביניים (median bodies), ומבני שוטונים פנימיים הנקראים אקסונים.

חשוב לציין כי להליך הסינון an ultra filtration של ה-holo fiber ישנה יכולת ללכוד מיקרואורגניזמים מרובים. בנוסף, ניתן להחיל בדיקות זיהוי אחרות כגון QPCR וטיפוס גנטי (genotyping) על הדגימות המרוכזות, מה שהופך שיטה זו לגמישה יותר וניתנת להתאמה רבה יותר ליישומים שלכם. תודה שצפיתם ובקשו מאיתנו אם יש לכם שאלות כלשהן.