Name: Osmometer Nanoliter הרומן LabVIEW המופעל לחקירות חלבון מחייב קרח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-04T09:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: חקור היסטרזיס תרמי של חלבונים מקשרי קרח באמצעות אוסמומטר ננוליטר מבוקר LabVIEW. השיטה מאפשרת בקרת טמפרטורה מדויקת לניתוח התנהגות קרח ומהירות גידולו במסחי חלבון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומי למדע, NSF, וERC. ברצוננו להודות לעזרה טכנית שלב הטמפרטורה מרנדי מילפורד, מייקל קורן, דאג שייפר, וג&#39;רמי דניסון. סיוע בפיתוח תוכנה סופק על ידי אור חן, די שו, Rajesh Sannareddy, וSumit Bhattachary. ברצוננו להודות לעמיתי פרופ &#39;פיטר ל&#39; דייויס וד&quot;ר לורי א גרהם לחלבון Mp IBP ודיונים מועילים. אנו מודים גם לחברי מעבדת ד&quot;ר מאיה הבר דולב, Yangzhong צ&#39;ין, ד&quot;ר Yeliz סליק, ד&quot;ר נטליה Pertaya, אורטל Mizrahy, וגיא שלומית למשוב מהמשתמשים שלהם.

0. הליכים המקדמיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית נימים להזרקת תמיסה. שימוש חולץ נימים (Narishige, טוקיו, יפן), להכין פיפטה חדה עם פתיחה מצוינת משפופרת מייקר נימי זכוכית (המותג GMBH, ורטהיים, גרמניה). גודל הפתח צריך להיות מאומת על ידי העברת אוויר דרך הנימים להשיג מבעבע עדינה במים נקיים. אם הנימים סגורות, ניתן לפתוח אותו על ידי שבירת הקצה שלה. ניתן לעשות זאת על ידי לחיצה או מגרדים אותו בעדינות על צינור המים המכילים קירות. הכן כגון נימים שהפתח חסום כמעט אך מספיק פתוח על מנת לאפשר ההיווצרות של בועות תת מילימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי דיסק נחושת. Sonicate את דיסקי הנחושת למשך 10 דקות במייקרו 0.1%-90 סבון (קול-לבן זוג, ורנון הילס, אילינוי, ארה&quot;ב), ואז לשטוף עם מים מזוקקים כפולים. להציג את הדיסקים לפתרון isopropanol (טכני) וsonicate שוב למשך 10 דקות. סנפירברית, לייבש את הדיסקים באמצעות אוויר מסונן. שלב ניקוי זו הוא קריטי כדי למנוע זיהום IBP בין ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבת coverglass כפולת שכבה. הרכבת coverglass הייתה מוכנה לאפשר לתצפית מדגם ללא עיבוי לחות על פני שטח כיסוי הזכוכית. זו הושגה על ידי צבת Drierite חלקיקים (WA המונד Drierite, קסניה, אוהיו, ארה&quot;ב) (2 מ&quot;מ קוטר) בין שתי coverslips, שלאחר מכן הדביק עם אקדח דבק חם. תצורה זו מונעת עיבוי שעלולה לחסום את הנוף כאשר הדגימה קוררה לטמפרטורות נמוכות ובטלה את הצורך לפוצץ באוויר יבש לחלון התצפית. </li></ol> 1. שלב הקירור Set-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבור את כניסת מי זרימה והיציאה של שלב הקירור עד 4 מ&quot;מ קוטר פנימיים Tygon צינורות (Saint-Gobain, פריז, צרפת), ולחבר את צינור יניקת זרימת מים למשאבת מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינור 4 Tygon קוטר פנימי מ&quot;מ ליניקה של t שלב הקירורo לספק אוויר יבש. האוויר היה יבש באמצעות עמודת Drierite באונליין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את משאבות אוויר ומים. שים לב כי יסודות הקירור לא צריכים לרוץ בלי גוף קירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את בקר הטמפרטורה, מצלמה, ושגרת LabVIEW. </li></ol> 2. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפת μl 3-4 טבילת השמן B (Cargille מעבדות, סדר גרוב, ניו ג&#39;רזי, ארה&quot;ב) בצד האחורי של דיסק נחושת קוטר 7 מ&quot;מ היו 500 מיקרומטר חורים שנקדחו באמצעות הדיסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את דיסק הנחושת על הבמה עם קירור צד שמן הטבילה פונה כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחבר את צינור הנימים (בקצה הקהה) לצינור בקוטר 0.7 מ&quot;מ פנימי Tygon מחובר בקצה השני למזרק 2 מיליליטר זכוכית (Poulten-גרף, ורטהיים, גרמניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שימוש בצינור הנימים, בדוק את הפתח הקטן של הנימים כדי להבטיח שהפתיחה היא גודל מתאים (ראה הליכים המקדמיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להכניס את GLAss נימים לתוך הצינור המוכן IBP חלבון המדגם (2.4 מיקרומטר Mp IBP-GFP ב20 מ&quot;מ CaCl 2 ו 25 מ&quot;מ טריס-HCl ב-pH 8, ראה התייחסות 10 לפרטי ההכנה) ומושך את מזרק הזכוכית עד נימי הזכוכית מכילה 0.1 μl של חלבון הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בהקלטת וידאו באמצעות תוכנת LabVIEW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הקצה החד של זכוכית הנימים (המכיל חלבון הפתרון) לאחד החורים בדיסק הנחושת בשלב הקירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך כדי התבוננות מבעד למיקרוסקופ (אולימפוס, טוקיו, יפן, אובייקטיבי 10x), לחדור בזהירות את שכבת שמן הטבילה עם קצה נימי הזכוכית, ולחץ על מזרק הזכוכית (מאוד בעדינות) כדי לספק כמות קטנה (~ 10 NL) של החלבון פתרון כדי ליצור טיפת מיקרומטר 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את החור בשלב הקירור עם מכלול coverglass שכבה הכפולה (ראה הליכים המקדמיים). </li></ol> 3. מדידת פעילות TH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קדםss כפתור הקירור ולקבוע את הטמפרטורה ל -40 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחילה, אגל הפתרון יהיה ברור. בטמפרטורות נמוכות, בדרך כלל בטווח -30 ° C עד -35 ° C, צבע שינויי האגל, מצביע על כך שהפתרון הוקפא. מייד לאחר המדגם הקפיא, להגדיל את הטמפרטורה לאט לאט עד שהקרח בתפזורת מתחיל להתמוסס. עלייה הדרגתית של הטמפרטורה נחוצה כדי למנוע להחטיא מהטמפרטורה שעלולה לגרום להמסה המלאה של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למטרת 50x ומתחיל להמס את הקרח על ידי התאמת הטמפרטורה. התאמה זו היא אינטראקטיבית, והשלבים הסופיים בדרך כלל מבוצעים באמצעות צעדי טמפרטורה קטנות של 0.002 מעלות צלזיוס תמשיך לינמס עד גביש יחיד נשאר. הגודל הסופי של הגביש צריך להיות בסביבות 10 מיקרומטר. הטמפרטורה הגבוהה ביותר שבי ההיתוך חדל תיקבע כנקודת התכה ונקבעה במדויק בשלב ניתוח וידאו מאוחר יותר. </li> &lt;li&gt; הגדר את הטמפרטורה לכמה מאיות צלזיוס תואר מתחת לנקודת ההתכה של הגביש ולהתחיל רמפת טמפרטורה באיחור 10 דקות. להתאים את קצב ramping כרצונך. במהלך תקופה זו, הגביש יהיה חשוף לIBPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סיום זמן החשיפה 10 דקות, הטמפרטורה פחתה באופן אוטומטי תחת השליטה של ​​שגרת LabVIEW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לצורת גביש כירידות בטמפרטורה. בשלב מסוים, הפרץ הפתאומי של גביש הקרח יכול להיות שנצפה. הטמפרטורה שבה זה מתרחש תצוין כטמפרטורת פרץ הגביש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בניתוח וידאו על מנת לקבוע את נקודת ההתכה המדויקת וטמפרטורת הפרץ. ראשית, על ידי שימוש בניתוח וידאו, למצוא את נקודת ההתכה המדויקת. תזכיר כי הטמפרטורה הגבוהה ביותר שבי ההיתוך חדל תיקבע כנקודת התכה. לתעד את נקודת התכה זה בתוכנת גיליונות אלקטרוניים. לאחר מכן, לקבוע את טמפרטורת פרץ הגביש המדויקת, ולתעד את הערך הזהגם כן. ההבדל בין נקודת ההיתוך ונקודת קיפאון, או בטמפרטורת פרץ גביש, הוא פעילות hysteresis התרמית של פתרון IBP. </li></ol> 4. מדידה של פעילות TH תלוית זמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב הפרוטוקול המתואר בסעיפים 3.1-3.3 להכין גביש יחיד של קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההיווצרות של הגביש, להגדיר את זמן ההשהיה של הרמפה כרצון, ולהפעיל את הרמפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמפרטורה תקטן בשיעור קבוע (בהתאם לדרישות של המפעילים) באופן אוטומטי לאחר זמן השהית הרמפה עבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתעד את הטמפרטורה שבה פרץ הגביש מתרחש. לחשב את זמן החשיפה (הזמן בין היווצרות גבישים ופרץ הגביש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הניסוי לזמני השהיה שונים ולהתוות את פעילות TH כפונקציה של זמן החשיפה על מנת להעריך את זמן התלות של פעילות TH. </li></ol>

<ol><li>DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins+as+biological+antifreeze+agents+in+antarctic+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes.</a> Science. 172, 1152-1155 (1971).</li>
<li>Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrot+leucine-rich-repeat+protein+that+inhibits+ice+recrystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization.</a> Science. 282, 115-117 (1998).</li>
<li>Raymond, J. A., Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice+binding%2C+recrystallization+inhibition%2C+and+cryoprotective+properties+of+ice-active+substances+associated+with+Antarctic+sea+ice+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms.</a> Cryobiology. 46, 174-181 (2003).</li>
<li>Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+composition%2C+and+physical+properties+of+a+thermal+hysteresis+%22antifreeze%22+protein+from+larvae+of+the+beetle%2C+Tenebrio+molitor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor.</a> Biochemistry. 21, 716-721 (1982).</li>
<li>Kiko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+freeze+protection+in+a+sea-ice+crustacean+through+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Polar+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer.</a> Polar Biology. 33, 543-556 (2010).</li>
<li>Robinson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+adaptation+in+Arctic+and+Antarctic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi.</a> New Phytol. 151, 341-353 (2001).</li>
<li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150, 171-180 (2004).</li>
<li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).</li>
<li>Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).</li>
<li>Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superheating+of+ice+crystals+in+antifreeze+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).</li>
<li>Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolarity+of+tear+microvolumes+in+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca.</a> Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).</li>
<li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive%2C+Ca2%2B-dependent+antifreeze+protein+in+an+Antarctic+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).</li>
<li>Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+of+persistence+exponents+in+two-dimensional+ostwald+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening.</a> Phys. Rev. Lett. 103, (2009).</li>
<li>Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+for+determining+ice+recrystallization+inhibition+by+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Bioph.+Res.+Co%22%5BJournal%5D)">A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).</li>
<li>Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solute+Effects+on+Ice+Recrystallization+-+an+Assessment+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique.</a> Cryobiology. 25, 55-60 (1988).</li>
<li>Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).</li>
<li>Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

עבודה זו ממחישה את הפעולה של osmometer nanoliter מבוקר מחשב המאפשר מדידות מדויקות של פעילות TH עם בקרת טמפרטורה יוצאת דופן. בכל מערכת רגישה לטמפרטורה, גרדיאנטים בטמפרטורה רצוי יש להימנע. כדי להימנע משיפועי טמפרטורה במנגנון שהוצג כאן, אגל פתרון המבחן חייב להיות ממוקם במרכז חור בשלב קירור דיסק הנחושת (שלב 2.7). בנוסף, הגביש היחיד צריך להיות במרכז של רביב ולא ליד הקצוות (ברוב המקרים, זה לא יקרה באופן ספונטני). תלות הזמן המתואר מצביעה על כך שקצב הקירור עשוי להשפיע על קריאות ה. לפיכך, אנו ממליצים לרבות דוח של הזמן שבו הגביש נחשף לפתרון לפני הקירור, כמו גם את קצב הקירור. אנחנו בדרך כלל חיכינו 10 דקות לפני ramping את הטמפרטורה ב0.01 ° C שלבים כל 4 שניות. את שיתוף LabVIEW המבוקרשלב oling הותאם לשימוש עם מיקרוסקופ ההפוך שבו יכולים להיות שהופעלו התקני microfluidic תרמית. מערכת זו מאפשרת ביצוע הניסויים בexchange פתרון של גבישי קרח וIBPs מתויגים עם 9 eGFP, 10, 16. מערכת LabVIEW המבוקרת עשויה להיות מותאמת לשלב קליפטון על ידי חיבור בקר 3040 טמפרטורה באמצעות מעגל חשמלי ייעודי הסתגלות. מערכת כזו פעלה בדייויס 17 המעבדה. תוכנת LabVIEW והעיצוב הייעודי התאמת המעגל החשמלי לבמת קליפטון זמין לפי בקשה. לסיכום, אנו מתארים osmometer nanoliter המאפשר שליטה הרגישה ומניפולציה של טמפרטורה וקצב עליית הטמפרטורה והירידה (עם רגישות 0.002 ° C), בתיאום עם ממשק וידאו דרך שגרת LabVIEW לניתוח בזמן אמת. מערכת זו יכולה לבצע ניסויים לשעתק שיעור בשליטה כי הם importanלא לחקירת קינטיקה של אינטראקציות IBP עם קרח. ניסויים כאלה יכולים לטפל בכמה בעיות ארוכות התווכחו מקיפות את מנגנון פעולה של IBPs.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים / דגם </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> טבילת שמן מהסוג B </td><td> מעבדות Cargille </td><td> 16484 </td><td></td></tr><tr><td> Drierite </td><td> WA המונד Drierite </td><td> 043063 2270g </td><td></td></tr><tr><td> תמיסת ניקוי מייקרו 90 </td><td> קולמן לבן זוג </td><td> <a href="http://www.coleparmer.com/Product/Cole_Parmer_small_sup_reg_sup_small_Micro_90_small_sup_reg_sup_small_cleaning_solution_case_of_four_4_Liter_bottles/EW-18100-11" target="_blank">EW-18100-11</a> </td><td></td></tr><tr><td> נימי חולץ </td><td> Narishige </td><td> PB-7 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות זכוכית נימים </td><td> המותג GNBH </td><td> 7493 21 </td><td> 75 מ&quot;מ אורך, 1.15 קוטר </td></tr><tr><td> טמפרטורהבקר </td><td> ניופורט, אירווין, קליפורניה, ארצות הברית </td><td> דגם 3040 </td><td> דגם 3040 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ אור </td><td> אולימפוס </td><td> דגם BH2 </td><td></td></tr><tr><td> מטרת 10x </td><td> אולימפוס </td><td></td><td> S תכנית 10, 0.3, 160/0.17 </td></tr><tr><td> מטרת 50x </td><td> ניקון </td><td></td><td> CF תכנית, 50X/0.55 EPI ELWD </td></tr><tr><td> CCD מצלמה </td><td> Provideo </td><td> CVC-140 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות Tygon </td><td> Saint-Gobain, פריז, צרפת </td><td></td><td> Tygon הגיבוש Tubing S-50-HL </td></tr><tr><td> זכוכית המזרק (2 מ&quot;ל) </td><td> Poulten-גרף, ורטהיים, גרמניה </td><td> 7 10227 </td><td></td></tr><tr><td> כרטיס PCI-GPIB </td><td> המכשירים לאומיים, אוסטין, טקסס, ארה&quot;ב </td><td> 778032-01 </td><td></td></tr><tr><td> וידאו המסגרת grabber IMAQ-PCI-1407 </td><td> המכשירים לאומיים, אוסטין, טקסס, ארה&quot;ב </td><td> 322156B-01 </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת עיצוב מערכת LabVIEW </td><td> המכשירים לאומיים, אוסטין, טקסס, ארה&quot;ב </td><td> גרסה 8 </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת מחבר DIVX </td><td> DivX LLC, סן דייגו, קליפורניה, ארה&quot;ב </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

osmometer nanoliter הרומן labview המופעל לחקירות חלבון מחייב קרח

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

חלבונים קושרי קרח (IBPs), הכוללים חלבוני אנטי-פריז (antifreeze proteins), חלבוני מבנה קרח (ice structuring proteins), חלבוני היסטרזיס תרמי (thermal hysteresis proteins) וחלבוני עיכוב גבישיות קרח חוזרות (ice recrystallization inhibition proteins), נמצאים באורגניזמים המותאמים לקור ומגנים עליהם מפני פגיעות קיפאון באמצעות אינטראקציה עם גבישי קרח. IBPs נמצאים במגוון אורגניזמים, כולל דגים1, צמחים2, 3, פרוקי רגליים4, 5, פטריות6 וחיידקים7. ה-IBPs נסמכים על פני השטח של גבישי קרח ומונעים ממולקולות מים להצטרף לסריג הקרח במיקום הסמיכה של ה-IBP. קרח הגדל על פני השטח של הגביש בין ה-IBPs הסמוכים מפתח קימור גבוה המוריד את הטמפרטורה שבה גדלים גבישי הקרח, תופעה המכונה אפקט גיבס-תומסון (Gibbs-Thomson effect). ירידה זו יוצרת פער (היסטרזיס תרמי, TH) בין נקודת ההמסה לבין נקודת הקיפאון שאינה בשיווי משקל, שבו צמיחת הקרח נעצרת8-10, ראו איור 1. אחד הכלים המרכזיים המשמשים במחקר IBPs הוא האוזמומטר הננו-ליטרי, המקל על מדידות של פעילויות TH של תמיסות IBPs. אוזמומטרים ננו-ליטריים, כגון מכשיר Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) ומכשיר Otago (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), תוכננו למדוד את האוזמולריות של תמיסה על ידי מדידת ירידת נקודת ההמסה של טיפות בנפחים של ננו-ליטרים. מכשירים אלה שימשו למדידת האוזמולריות של דגימות ביולוגיות, כגון דמעות11, ונמצאו כשימושיים במחקר IBPs. שליטה ידנית באוזמומטרים ננו-ליטריים אלה הגבילה את האפשרויות הניסיוניות. לא ניתן היה לשלוט באופן מהימן בשינויי קצב הטמפרטורה, טווח הטמפרטורות של מכשיר ה-Clifton היה מוגבל ל-4,000 mOsmol (בערך -7.5 °C), והקלטות טמפרטורה כפונקציה של זמן לא היו אפשרות זמינה במכשירים אלו.
תכננו מערכת ננוליטר-אוזמומטר מותאמת אישית המבוקרת במחשב באמצעות פלטפורמת LabVIEW (National Instruments). הבמה הקרה, שתוארה בעבר9, 10, מכילה בלוק מתכת שדרכו זורם מים, ובכך היא משמשת כפיזור חום, ראו איור 2. לבלוק זה מחוברים מקררים תרמואלקטריים שניתן להפעילם באמצעות בקר טמפרטורה מסחרי הניתן לשליטה דרך מודולי LabVIEW, ראו איור 3. פרטים נוספים מופיעים להלן. היתרון המרכזי של מערכת זו הוא הבקרת הטמפרטורה הרגישה שלה, ראו איור 4. בקרת טמפרטורה אוטומטית מאפשרת תיאום של שינוי טמפרטורה (ramp) קבוע עם פלט של מיקרוסקופיה בווידאו המכיל פרטים ניסיוניים נוספים.
כדי לחקור את התלות בזמן של פעילות ה-TH, בדקנו IBP היפר-אקטיבי בעל מסה של 58 kDa מהחיידק האנטארקטי Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. חלבון זה סומן עם חלבוני פלואורסצנציה ירוקים משופרים (eGFP) בקונסטרוקט שפותח על ידי קבוצתו של פיטר דייוויס (Queens University)10. הראינו כי פרופיל שינוי הטמפרטורה השפיע על פעילות ה-TH. שליטה מצוינת בפרופיל הטמפרטורה בניסויים אלה שיפרה באופן משמעותי את מדידות ה-TH. האוזמומטר הננו-ליטרי אפשר לנו בנוסף לבחון את עיכוב הגביש מחדש של IBPs5, 13. באופן כללי, גביש מחדש הוא תופעה שבה גבישים גדולים גדלים על חשבון גבישים קטנים. IBPs מעכבים ביעילות גביש מחדש, אפילו בריכוזים נמוכים14, 15. השתמשנו באוזמומטר המבוקר על ידי LabVIEW כדי לעקוב באופן כמותי אחר הגביש מחדש של קרח וכדי לאכוף שבר קרח קבוע באמצעות ניתוח וידאו בו-זמני בזמן אמת של התמונות ומשוב טמפרטורה מתא הדגימה13. החישובים בזמן אמת מציעים אפשרויות בקרה נוספות במהלך הליך ניסויי. פותחה במה עבור מיקרוסקופ הפוך כדי להתאימה למכשירים מיקרו-פלואידיים מבוקרי טמפרטורה, אשר יתוארו במקום אחר16.
מערכת הבמה הקרה
מכלול הבמה הקרה (איור 2) מורכב מקבוצה של מקררים תרמו-אלקטריים המקררים לוח נחושת. חום מוסר מהבמה על ידי זרימת מים קרים דרך תא סגור מתחת למקררים התרמו-אלקטריים. חור בקוטר 4 mm במרכז לוח הנחושת משמש כחלון תצפית. חור במישור בעל קוטר 1 mm נקדח כדי להתאימו לתרמיסטור. דיסקית נחושת בהתאמה אישית (בקוטר 7 mm) עם מספר חורים (בקוטר 500 μm) הונחה על לוח הנחושת והוצמדה לחלון התצפית. אוויר הועבר בקצב זרימה של 35 ml/sec והיובש באמצעות Drierite (W.A. Hammond). האוויר היבש שימש להבטחת סביבה יבשה בבמת הקירור. הבמה חוברה באמצעות יציאת חיבור בעלת 9 פינים לבקר טמפרטורה (דגם 3040 או 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). בקר הטמפרטורה חובר באמצעות כבל לכרטיס GPIB-PCI במחשב (National instruments, Austin, Texas, USA).

מדידה של תלות זמן TH Osmometer nanoliter LabVIEW המופעל מאפשר ביצוע מדידות פעילות TH מדויקות. שיעור הפחתת הטמפרטורה הקבועה מותר המדידה של תלות זמן TH. בקרת הטמפרטורה המדויקת מופעלת על ידי osmometer nanoliter הייתה חיונית לניסויים אלה. זמן החשיפה של גביש קרח לIBPs בפתרון מוגדר כפרק זמן מהיווצרות הגבישים (סופו של תהליך ההיתוך) עד הצמיחה הפתאומית של קרח סביב הגביש (פרץ גביש). מצאנו כי זמן החשיפה של גבישי הקרח לIBPs מושפע פעילות TH מכריע. תקופות קצרות של חשיפת IBP (כמה שניות) המיוצרות על פעילות TH נמוכה בפתרון Mp IBP-GFP (2.4 מיקרומטר) (איור 5). פעילות TH גדלה עם זמן החשיפה IBP עד שהגיע לרמה של 4 חשיפת IBP דקות. בריכוזים גבוהים יותר IBP, הצלחתau, הושג בזמנים קצרים יותר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig1.jpg" /> האיור 1. IBPs ממחיש תרשים סכמטי adsorbed לקרח. אמץ באישור 10. <img alt="איור 2" fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2.jpg" /> איור 2. שלב הקירור. ) מחובר לצינורות במיקרוסקופ. ב) בלי להוביל העליון. ג) תרשים סכמטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig2large.jpg" target="_blank"> </a><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig3.jpg" /> איור 3. תמונת מסך של ממשק LabVIEW. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig3large.jpg" target="_blank">Cl</a>איכס כאן לצפייה בדמות גדולה. <img alt="איור 4" fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4.jpg" /> איור 4. גרף יציבות טמפרטורה. בקר הטמפרטורה נקבע שתוריד את טמפרטורת 0.01 ° C בכל 15 שניות. <img alt="איור 5" fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5.jpg" /> איור 5. פעילות TH Mp IBP כפונקציה של זמן חשיפת גביש קרח לIBPs. כל נקודת זמן היא ממוצעת של 3-6 ניסויים.

חלבוני קרח מחייבים (IBPs), הידוע גם כחלבוני רדיאטור, לעכב צמיחה וקרח הם תוסף מבטיח לשימוש בהקפאה קריוגנית של רקמות. הכלי העיקרי המשמש לבדיקת IBPs הוא osmometer nanoliter. פתחנו שלב בית מעוצב קירור רכוב על מיקרוסקופ אופטי ונשלטתי באמצעות שגרת LabVIEW שהותקן. Osmometer nanoliter מתואר כאן מניפולצית טמפרטורת המדגם באופן אולטרה רגיש.

Osmometer Nanoliter הרומן LabVIEW המופעל לחקירות חלבון מחייב קרח

חלבונים קושרים קרח (IBPs), הכוללים חלבונים נוגדי קיפאון, חלבונים מבני קרח, חלבונים של היסטריזה תרמית ועכבה של התגבשות מחדש של קרח...

מטרתו של הליך זה היא למדוד היסטרזיס תרמית של חלבונים קושירי קרח וחומרים אחרים המשפיעים על גדילת קרח. פעולה זו מתבצעת תחילה על ידי יצירת צינור נימי בעל פתח צר ושאיבת טיפה של תמיסת חלבון. לאחר מכן, הצינור הנימי עם הדגימה מונח על במה בעלת בקרת טמפרטורה.השלב השני הוא הקפאת התמיסה על ידי קירורה לטמפרטורות נמוכות, כדי להחדיר קרח לתוך הטיפה. לאחר מכן, מחממים את הטיפה כדי להמיס את רוב הקרח, וזאת במטרה לשמר גביש בודד בתוך הטיפה.השלב הסופי הוא קירור הקרח שוב עד שיתחיל לגדול במהירות. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח במיקרוסקופיה וידאו כדי לחשב את ההפרש בין טמפרטורת ההמסה לטמפרטורת ההקפאה לצורך קביעת היסטרזיס תרמי, וכן כדי לקבוע את צורת גבישי הקרח ולמדוד את מהירות גדילת הקרח. היתרון המרכזי של בקרת המעבדה Nanoliter SM שפיתחנו על פני שיטות קיימות הוא שניתן לבצע מדידות ארוכות מאוד או מהירות מאוד באופן מדויק וחזרתי.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של חלבוני קישור קרח, כגון התלות בזמן של אלו. ראשית, הכינו קפילרית זכוכית להזרקת תמיסה. השתמשו במכשיר למשיכת קפילריות (capillary puller) כדי להכין פיפטה חדה עם פתח דק מתוך מיקרו-צינור קפילרי מזכוכית.יש לוודא את גודל הפתח על ידי העברת אוויר דרך הנימי כדי להשיג התהוות בועות עדינות במים. הכין את הנימי כך שהפתח יהיה כמעט חסום, אך פתוח מספיק כדי לאפשר היווצרות של בועות תת-מילימטריות. אם הנימי סגור, פתח אותו על ידי שבירת קצהו באמצעות לחיצה או שריטה עדינה כנגד דפנות המבחנה המכילה את המים.הכינו הרכבה של זכוכית כיסוי דו-שכבית על ידי הנחת חלקיקי חומר מייבש (dessicant) בין שתי זכוכיתי כיסוי. הדביקו את זכוכיתות הכיסוי זו לזו בעזרת אקדח דבק חם. זכוכית הכיסוי הדו-שכבתית מאפשרת תצפית על הדגימה ללא התגבשות של לחות על פני השטח של זכוכית הכיסוי.להכנת שלב הקירור, חברו את פתחי הכניסה והיציאה של זרימת המים של שלב הקירור לצינורות Tigon בקוטר 4 מילימטר. חברו את צינור כניסת זרימת המים למשאבת מים. חברו צינור Tigon בקוטר 4 מילימטר לכניסה של שלב הקירור כדי להזרים אוויר יבש שעבר ייבוש.באמצעות עמודת קרח יבש המותקנת בקו (inline), הפעילו את משאבות האוויר והמים. שימו לב כי אין להפעיל את אלמנטי הקירור ללא גוף קירור (heat sink). הפעילו את בקר הטמפרטורה, את המצלמה ואת שגרת ה-LabVIEW.כדי להתחיל בהכנת הדגימה, הניחו טיפה של 3 עד 4 µL של שמן טבילה B על הצד האחורי של דיסकेट נחושת בקוטר 7 מילימטרים, עם חורים בקוטר 500 מיקרון שנקדחו דרך הדיסקה. מקמו את דיסקת הנחושת על במת הקירור כאשר צד שמן הטבילה פונה כלפי מטה. חברו את הקצה התעומם של צינור הנימי לצינור tigon בקוטר 0.7 מילימטרים.מחובר בקצהו השני למזרק זכוכית של שני מיליליטר. הכניסו לאט את קפילרית הזכוכית לתוך מבחנת הדגימה של חלבון קישור הקרח (ice binding protein או IBP) שהוכנה, ומשכו את מזרק הזכוכית עד שקפילרית הזכוכית תכיל 0.1 µL של תמיסת החלבון. התחילו בהקלטת וידאו באמצעות תוכנת ה-LabVIEW.החדירו את הקצה החד של קפילרית הזכוכית הממולאת לאחד מהחורים בדיסק הנחושת שעל משבצת הקירור. תוך כדי צפייה דרך המיקרוסקופ, חדרו בזהירות רבה ובCעדינות עם קצה קפילרית הזכוכית דרך שכבת שמן הטבילה. לחצו על מזרק הזכוכית כדי להוציא כמות קטנה של תמיסת החלבון ליצירת טיפה בנפח של 200 micron.כסו את החור בבמת הקירור באמצעות מכלול זכוכית הכיסוי דו-שכבתית. לחצו על כפתור הקירור והגדירו את הטמפרטורה ל-40- מעלות צלזיוס. בתחילה, טיפת התמיסה תהיה שקופה בטמפרטורות נמוכות, בדרך כלל בטווח טמפרטורות של 30- מעלות צלזיוס עד 35- מעלות צלזיוס.הטיפה משנה את צבעה, דבר המעיד על כך שהתמיסה קפאה, מיד לאחר קפיאת הדגימה. העלו את הטמפרטורה באיטיות עד שהקרח העיקרי מתחיל להפשיר. עלייה הדרגתית בטמפרטורה נחוצה כדי למנוע חריגה בטמפרטורה שעלולה להוביל להפשרה מלאה של הדגימה; עברו לעדשה עם הגדלה של 50X והתחילו להפשיר את הקרח על ידי כיוון הטמפרטורה.כוונון זה הוא אינטראקטיבי, והשלבים הסופיים מבוצעים בדרך כלל בצעדי טמפרטורה קטנים של 0.002 °C; יש להמשיך בהמסה עד שנותר גביש בודד. הגודל הסופי של הגביש צריך להיות כ-10 מיקרון. הטמפרטורה הגבוהה ביותר שבה פסקה ההמסה נקבעת כנקודת ההיתוך, והיא נקבעת במדויק בשלב ניתוח הווידאו המאוחר יותר.שלב הבא, הגדירו את הטמפרטורה למאותית של מעלה צלזיוס מתחת לנקודת ההמסה של הגביש והתחילו עלייה בטמפרטורה (ramp) עם השהיה של 10 דקות; התאימו את קצב העלייה לפי הצורך. במהלך זמן זה, הגביש יהיה חשוף ל-ips. עם השלמת זמן החשיפה של 10 דקות, הטמפרטורה תרד באופן אוטומטי תחת בקרת שגרת ה-lab view. עקבו אחר צורת הגביש בעוד הטמפרטורה יורדת.בשלב מסוים, ניתן להבחין בפריצה פתאומית של גבישי קרח. הטמפרטורה שבה הדבר קורה נרשמת כטמפרטורת פריצת הגבישים. השתמש בניתוח וידאו כדי לקבוע את נקודת ההמסה המדויקת ואת טמפרטורת הפריצה.ראשית, השתמש בניתוח וידאו כדי למצוא את נקודת ההיתוך המדויקת. זכור כי הטמפרטורה הגבוהה ביותר שבה פסק ההיתוך היא זו שנקבעת כנקודת ההיתוך. תעד נקודת היתוך זו בתוכנת גיליון אלקטרוני.לאחר מכן, קבעו את טמפרטורת פריצת הגביש המדויקת ותעדו אותה גם כן. ההפרש בין נקודת ההמסכה לנקודת ההקפאה או לטמפרטורת פריצת הגביש הוא פעילות ההיסטרזיס התרמי של תמיסת ה-IBP. כדי להתחיל במדידת פעילות ה-TH התלויה בזמן, המיסו את הקרח עד שיישאר גביש בודד, כפי שנעשה קודם לכן לאחר היווצרות הגביש.הגדירו את זמן ההשהיה של ה-ramp לפי הצורך והפעילו את ה-ramp. כאן, לדוגמה, זמן ההשהיה הוגדר לדקה אחת. הטמפרטורה תרד באופן אוטומטי בקצב קבוע. לאחר שחלף זמן ההשהיה של ה-ramp, רשמו את הטמפרטורה שבה התרחש ה-crystal burst.חשבו את זמן החשיפה, שהוא הזמן שבין היווצרות הגביש לבין התנקצות הגביש. חזרו על הניסוי עבור זמני השהיה שונים ושרטטו את פעילות ה-TH כפונקציה של החשיפה. זמן זה משמש להערכת התלות של פעילות ה-TH בזמן.בקרת טמפרטורה מדויקת שהתאפשרה באמצעות נגב ה-OSM בנפח ננוליטר הייתה חיונית כדי לספק מדידה מדויקת של פעילות ה-TH והתלות שלה בזמן. זמן החשיפה של גביש קרח ל-IPS בתמיסה מוגדר כפרק הזמן מרגע היווצרות הגביש ועד לצמיחה הפתאומית של קרח סביבו. זמן החשיפה של גבישי ה-ICE ל-IPS השפיע באופן מכריע על פעילות ה-TH.תקופות קצרות של חשיפה ל-IBP הובילו לפעילות TH נמוכה בתמיסת MP I-B-P-G-F-P. פעילות ה-TH עלתה עם זמן החשיפה ל-IBP עד שהגיעה למישור (plateau) לאחר ארבע דקות חשיפה ל-IBP בריכוזי IBP גבוהים יותר. המישור הושג בזמנים קצרים יותר. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשילוב עם מכשירים למיקרופלואידיקה המשתמשים בבקרת במה של love view דומה יכולים לשמש למענה על שאלות נוספות, כגון הצטברות של חלבוני קישור קרח על פני גבישי קרח.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לנו הבנה טובה של האופן שבו יש לבצע מדידת STERIS תרמית המעריכה את הפעילות של חלבונים קושרי קרח (ice binding proteins).

labview-operated-novel-nanoliter-osmometer-for-ice-binding-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

חלקיקים פלורסנט המיוצר במעבדה שלנו משמשים ריכוזי הדמיה יונים והנתיבים יון במערכות ביולוגיות כגון תאים במהלך נוזל איתות ביניים במהלך הומאוסטזיס פיזיולוגיים.

חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

בסרטון זה, אנו מדגימים טכנולוגיית אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) כדי לזהות את האינטראקציות הבין-מולקולריות בין ליגנדות ואנליטות מטרה בזמן אמת. BLI מודד שינויים בתבנית ההתאבכות של אור לבן המוחזר משכבה של ליגנדים משותקים על משטח ביו-סנסור בזמן שהם מתקשרים עם אנליטים בתמיסה.

טכנולוגיית אינטרפרומטריה ביו-שכבתית לזיהוי אינטראקציות בין ליגנד לאנליט

סרטון וידאו זה מדגים שיטה לחקר אינטראקציות חלבון-תרופה באמצעות ביו-פנינג מבוסס ביו-סנסור QCM של ספריית הפפטידים-פאגים T7. הביו-פנינג של פאגים המציג פפטיד ספציפי על הביו-חיישן QCM מאפשר בידוד ספציפי של פפטידים בעלי זיקה גבוהה, ולאחר מכן ריצוף חומצות אמינו, המסייע לזהות אתרי אינטראקציה ספציפיים על חלבון המטרה.

קוורץ-קריסטל מיקרו-איזון ביו-פנינג מבוסס ביוסנסור לחקר אינטראקציות חלבון-תרופה

הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

מאמר זה מתאר את זיהוי של חלבוני קושרי קרח מצמחי הקפאה-סובלנית דרך ההערכה של פעילות עיכוב-recrystallization הקרח והבידוד הבא של IBPs המקורית באמצעות טיהור זיקה-קרח.

זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה

פרוטוקול לקביעת צפיפות השלב הזגוגי של טיפות בגודל של מיקרו-פיקו-ליטר מתוארות בטמפרטורות קריוגניות.

מדידת צפיפות של משקפיים מימיים בטמפרטורות קריוגניות

פרוטוקול זה מתאר גישה ללא כיול עבור לכימות חלבון ההומו-oligomerization במבחנה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אור מסחרי. שיטות ניתוח וההגדרות רכישה נכונה מוצגים.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאפיון ביופיזיקלי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה המכוונת לכימרות (PROTACS) המערבות את ליגאזות היוביקוויטין, Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) ו-Cereblon (CRBN).  שיטות ביופיזיקליות המודגמות כאן כוללות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC).

פיתוח ויישום של בדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה מכוונת כימרות (PROTACS)

מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.

ניתוח אינטראקציות DNA-חלבון עם אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין

אנו מתארים שיטה לpassivating משטח זכוכית באמצעות פוליאתילן גליקול (PEG). פרוטוקול זה מכסה ניקוי פני השטח, functionalization פני השטח, וציפוי PEG. אנחנו מציגים את האסטרטגיה חדשה לטיפול במשטח עם מולקולות PEG יותר משני סיבובים, אשר מניב איכות מעולה של פסיבציה בהשוואה לשיטות קיימות.

פסיבציה משטח ללימודי חלבון מולקולה בודדת

חקור היסטרזיס תרמי של חלבונים מקשרי קרח באמצעות אוסמומטר ננוליטר מבוקר LabVIEW. השיטה מאפשרת בקרת טמפרטורה מדויקת לניתוח התנהגות קרח ומהירות גידולו במסחי חלבון.

Osmometer Nanoliter הרומן LabVIEW המופעל לחקירות חלבון מחייב קרח

גלה סרטונים נוספים