Name: ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: למדו לייצר סיבי משי עכביש סינתטיים בקנה מידה מעבדתי באמצעות חיקוי תהליך הסיבוב הטבעי. השיטה כוללת ייצור חלבוני משי רקומניים בחיידקים, טיהור כרומטוגרפי וסיבוב לתוך אמבט אלכוהול מייבש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NSF רוי מענקים MCB-0950372 ו DMR-1105310 תחת הכותרת &quot;אפיון מולקולרית של שחור עכביש משי אלמנות התנהגות מכנית של משי עכביש דבק&quot;, בהתאמה.

<ol><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+design+of+spider+silks%3A+from+fibroin+sequence+to+mechanical+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).</li>
<li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoelix%2C+R+%22Biology+of+spiders%22">Biology of spiders</a>. , Oxford University Press. New York. (1996).</li>
<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+crystalline+spinning+of+spider+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid crystalline spinning of spider silk.</a> Nature. 410, 541-548 (2001).</li>
<li>Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+spider+silk+proteins+for+applications+in+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).</li>
<li>Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+fibers+self-assembled+from+recombinant+miniature+spider+silk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins.</a> Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).</li>
<li>Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Silk+Fibers+Spun+from+Soluble+Recombinant+Silk+Produced+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells.</a> Science. 295, 472-476 (2002).</li>
<li>Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+production+of+recombinant+spider+silk-like+proteins+for+artificial+fiber+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning.</a> Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).</li>
<li>Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnesa%2C+E+%22Biomacromolecules%22">Biomacromolecules</a>. , (2011).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypotheses+that+correlate+the+sequence%2C+structure%2C+and+mechanical+properties+of+spider+silk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Macromol%22%5BJournal%5D)">Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).</li>
<li>Xu, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+protein+superfiber%3A+Spider+Dragline+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+mechanical+characterization+of+aciniform+silk%3A+uniformity+of+iterated+sequence+modules+in+a+novel+member+of+the+spider+silk+fibroin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family.</a> Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).</li>
<li>Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+silk+fibers+spun+from+soluble+recombinant+silk+produced+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells.</a> Science. 295, 472-476 (2002).</li>
<li>Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+spider+silk+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).</li>
<li>Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+dragline+silk+proteins+in+transgenic+tobacco+leaves%3A+accumulation+and+field+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production.</a> Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).</li>
<li>Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+spider+silk+proteins+in+tobacco+and+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of spider silk proteins in tobacco and potato.</a> Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).</li>
<li>An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+beta-sheets+formation+in+synthetic+spider+silk+fibers+by+aqueous+post-spin+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching.</a> Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).</li>
<li>Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).</li>
<li>Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+spider+silk+proteins+in+tobacco+and+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of spider silk proteins in tobacco and potato.</a> Nature Biotechnology. 19, (2001).</li>
<li>Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+removal+during+synthetic+and+Nephila+fiber+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning.</a> Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).</li>
<li>Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+Black+Widow+Spider+Silk-producing+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands.</a> J. Vis. Exp. (47), e2382(2011).</li>
<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyriform+spidroin+1%2C+a+novel+member+of+the+silk+gene+family+that+anchors+dragline+silk+fibers+in+attachment+discs+of+the+black+widow+spider%2C+Latrodectus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus.</a> J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).</li>
<li>La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+minor+ampullate+silk+proteins+are+constituents+of+prey+wrapping+silk+in+the+cob+weaver+Latrodectus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus.</a> Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).</li>
<li>Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHsia%2C+Y+%22Metal%2C+Ceramic+and+Polymeric+Composites+for+Various+Uses%22">Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses</a>. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

סיבים סינתטיים הסתחרר מן המתודולוגיה זה הם מכנית על אותו סדר גודל לעומת סיבים טבעיים. על ידי הפחתת כמות טעויות אנוש על ידי mechanizing עקיפה ומסובב הודעה תהליכים לצייר, וריאציה ניסיוני בין דגימות נשלטים יותר פחותה בהרבה. המתודולוגיה שלנו מציעה את הפוטנציאל לחקור את תכונות מכניות של סיבים אחרים כי הם הסתחררו מן החלבונים המקודדים רקומביננטי מן cDNAs של בני משפחה אחרים הגן עכביש. פוטנציאלית, זה יכול לקבוע את התפקיד ...

קורי עכביש בעל תכונות מכאניות יוצאות דופן, כי את מבצעת חומרים מעשה ידי אדם, ובהם פלדה גבוהה מתיחה, Kevlar ניילון. 1 עכבישים לטוות לפחות 6-7 סוגי סיבים שונים המציגים תכונות מכניות שונות, כל אחת מעוצבת עם כמויות משתנות של עוצמה הרחבה מתיחה כדי לבצע משימות ביולוגיים ספציפיים. 2 מדענים מחקר הם במהירות רודף את השימוש של משי עכביש כמו biomaterials הדור הבא בגלל תכונות מכאניות יוצאות דופן שלהם, biocompatibility שלהם, והטבע רעיל ירוק החומר שלהם. 3,4 בגלל קניבלית ו הטבע ארסית של Arachnids, קציר משי עכביש באמצעות חקלאות היא לא אסטרטגיה מעשית על מנת לעמוד בדרישות הנחוצות לייצור בקנה מידה תעשייתי. לכן, מדענים פנו לייצור חלבונים רקומביננטיים משי של האורגניזם המהונדס יחד עם במבחנה ספינינג של סיבים סינתטיים מse חלבונים מטוהרים. 5-8 Expression של באורך מלא חלבונים משי רקומביננטי עכביש כבר קשה מבחינה טכנית נתון את המאפיינים הפנימיות של רצפי גנים שלהם, אשר כוללים הטבע חוזר על עצמו ביותר שלהם ואת אורכי פיזיים (&gt; 15 kb), GC-עשיר תוכן ו מוטה אלאנין ו גליצין השימוש קודון. 9-11 כדי תאריך, רוב Labs התמקדו להביע את צורות חתוכים של משי את החלבונים העיקריים ampullate MaSp1 או MaSp2 תוך שימוש רצפים cDNA חלקיים או גנים סינתטיים. 12-15 טוויה סינתטי עכביש בדי משי הוא תהליך מאתגר כי דורש מאסטריות ואת הידע ב דיסציפלינות מדעיות כמה, ו המורכבויות של תהליך ספינינג שלא היה חשף באופן מלא לציבור הרחב על ידי ייצוג וידאו. למעשה, רק קומץ של Labs על פני הגלובוס יש את המומחיות להביע את את cDNAs משי עכביש, לטהר את את החלבונים משי, ספין סיבים סינתטיים ולבצע המשתמש הודעה-ספין תיקו ולאחר מכן סוף סוף לבדוק על מאפיינים ביולוגי שלהם. 8,16,17 גישות שונות של סיבים סינתטיים ספינינג לא הקיפה ספינינג רטובה ויבשה כמו גם שיטות electrospinning 16,18,19 הליכי כל יש מטרה אחת משותפת -. פיתוח פרוטוקול שמייצר קורי עכביש סינתטי בעל תכונות מכאניות כי הנושאים טבעיים יריבות עבור בקנה מידה גדול תהליכי ייצור מסחריות. כאן אנו מתארים את ההליך להפקת משי עכביש מלאכותיים בקנה מידה במעבדה באמצעות מתודולוגיה רטוב ספינינג. לעומת שיטות אחרות ספינינג, ספינינג רטובים הפיק את התוצאות העקביים ביותר לניתוח סיבים. אנחנו מתווה זה תחילת ההליך עם ביטוי של חלבונים משי רקומביננטי בחיידקים, ואחריו טיהור שלהם, ולאחר מכן לתאר את שלבי הכנת חלבון ספינינג, כולל מתודולוגיה שלאחר ספין תיקו ליישם סיבי &quot;כפי הסתחרר&quot; כי התשואות האשכולות עם חומר מאפיינים להתקרב איכות משי עכביש טבעי. שלנו methodology נועד מקרוב לחקות את התהליך הטבעי של ספינינג סיבי משי היא שואבת במידה רבה על המומחיות שלנו הארכיטקטורה והתפקוד של משי לייצור בלוטות מ-Orb ו-קלח אריגה עכבישים. 20-22 יתר על כן, אנו מגיעים למסקנה עם צורך השלבים הבאים כדי לקבוע את תכונות החומר של סיבים סינתטיים באמצעות tensometer להתוות ללחץ ומתח עקומות, המאפשרים לחוקרים לחשב את הכוח האולטימטיבי, זן האולטימטיבי, וקשיחות של סיבים. לבסוף, אך בעל ערך משמעותי, מנגנוני ספינינג, עקיפה, ציור יכול להיות בית נבנה באמצעות חלקים זמינים מסחרית, יותר מאשר רכישת ציוד מותאם אישית משוכלל ויקר.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> pBAD / Topo הביטוי ThioFusion Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K370-01 </td><td></td></tr><tr><td> תא FastBreak מגיב תמוגה, 10x </td><td> Promega </td><td> V857C </td><td></td></tr><tr><td> Ni-agarose נ.ת. ע </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td> כולל הוראות עבור מאגרים </td></tr><tr><td> ProteoSilver כסף הכתם Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PROTSIL1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> FreeZone Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7960041 </td><td> FreeZone 12Plus </td></tr><tr><td> Hexafluoroisopropanol (HFIP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52512 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק </TD&gt; <td> המילטון </td><td> 7657-01 </td><td> 250 μL </td></tr><tr><td> מחט </td><td> המילטון </td><td> 7780-01 </td><td> מד 26s, בלאנט מחט נשלף סוף </td></tr><tr><td> מזרק משאבה </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 702208 </td><td> 11Plus </td></tr><tr><td> Digital Caliper </td><td> קררה </td><td> CP5906 </td><td> 0-150 מ&quot;מ טווח </td></tr><tr><td> נירוסטה מלקחיים </td><td> Precision של מכשירים בעולם </td><td> 501764 </td><td> מיני דומון # M5S </td></tr><tr><td> מנוע </td><td> טבע מיל </td><td> 7090529 </td><td> 12VDC, 2 סיבובים לדקה מהירות </td></tr><tr><td> ליניארי מפעיל </td><td> וורנר החשמל </td><td> 01-D024-0050-A06-LP-IP65 </td><td> 24VDC, 6 אינץ&#39; טווח </td></tr><tr><td> לנתח מיקרוסקופ </td><td> Leica Microsystems </td><td> לייקה MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> Digital microscאופ המצלמה </td><td> Leica Microsystems </td><td> DFC320 </td><td> תוכנה: Leica Application Suite v2.8.1 </td></tr><tr><td> Vannas מספריים </td><td> Precision של מכשירים בעולם </td><td> 500260 </td><td></td></tr><tr><td> Microtensometer </td><td> אורורה מדעי </td><td> 310C </td><td> 5N-Dual Mode מערכת </td></tr></tbody></table>

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

כחברה מתקדמת ומשאבים להיות נדיר, הוא הופך חשוב יותר ויותר לטפח טכנולוגיות חדשות הקרובות מהנדס הדור biomaterials עם תכונות ביצועים גבוהים. פיתוח של חומרים אלה מבניים חדשים חייבת להיות מהירה, יעילה וחסכונית, הכרוכה שיטות עיבוד מוצרים ידידותיים לסביבה בת קיימא. עכבישים לטוות רב של סוגי סיבים שונים עם תכונות מכניות שונות, מציע מקור עשיר של הנדסת חומרים הדור הבא של ביומימטיקה כי יריבות חומרים מעשה ידי אדם וטבעי ביותר. מאז אוסף של כמויות גדולות של משי עכביש טבעי אינו מעשי, ייצור משי סינתטי יש את היכולת לספק למדענים גישה אספקה ​​בלתי מוגבלת של נושאים. לכן, אם תהליך ספינינג יכול להיות יעיל שלמות, סיבי עכביש מלאכותיים יש שימוש פוטנציאלי במגוון רחב של יישומים החל שריון הגוף, תפר כירורגיים, חבלים וכבלים, צמיגים, מחרוזות עבור כלי נגינה, וחומרים מרוכבים עבור טכנולוגיות תעופה וחלל. על מנת לקדם את תהליך ייצור משי סינתטי להניב סיבים המציגים שונות נמוכה תכונות החומר שלהם לטוות ספין, פיתחנו פרוטוקול רטוב ספינינג המשלבת ביטוי חלבונים רקומביננטיים עכביש המשי של טיהור, חיידקים וריכוז החלבונים , ואחריו שחול סיבים טיפול מכני שלאחר ספין. זהו ייצוג חזותי 1 החושף תהליך צעד אחר צעד להסתובב ולנתח סיבי משי מלאכותי בקנה מידה מעבדתי. הוא גם מספק פרטים כדי למזער הכנסת השונות בין סיבים שנטוו בין סמים ספינינג אותו. באופן קולקטיבי, שיטות אלה יניע את התהליך של ייצור המשי המלאכותי, המוביל סיבים באיכות גבוהה יותר כי יעלה משי עכביש טבעי.

למרות תכונות מכניות ביוכימי הבולטים של משי עכביש, חומר זה לא ניתן לקצור בכמויות גדולות באמצעים קונבנציונליים. כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה לטוות קורי עכביש מלאכותיים סיבי, שהוא תהליך חשוב עבור החוקרים הלומדים ייצור עכביש המשי ואת השימוש בהם הדור הבא של biomaterials.

ככל שהחברה מתקדמת והמשאבים הופכים למעטים יותר, גוברת החשיבות של פיתוח טכנולוגיות חדשות להנדסת הדור הבא של...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לייצר משי ספיידר סינתטי על ידי חיקוי תהליך הטריפה הטבעי של העכביש, כדי לשחזר את תהליך טריפת המשי במעבדה. כמויות גדולות של חלבון משי רקומביננטי מופקות בחיידקים, לאחר טהרה באמצעות כרומטוגרפיה וריכוז באמצעות ליופיליזציה. החלבון מומס, ותמיסת הטריפה (spinning dope) נדחפת דרך מזרק עם מחט בעלת קוטר קטן לתוך אמבט אלכוהול מייבשת.לבסוף, הסיבים הסינתטיים כפי שנקצרו עוברים מתיחה לאחר הטריקה (post spin draw) כדי להגביר את האוריינטציה המולקולרית של שרשראות החלבון. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טריקה חשמלית (electro spinning) או טריקה יבשה (dry spinning), הוא העלות הנמוכה, קלות התפעול והפוטנציאל להרחבת ההליך לפורמט של ייצור רחב היקף. ההשלכות של טכניקה זו נפרסות לעבר פיתוח של מחלקה חדשה של ביו-חומרים.ניתן להשתמש בחומרים אלו למגוון רחב של יישומים שונים, כגון תפרים כירורגיים, מיגון גוף, וכן מיתרים לכלי נגינה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התכונות החומריות של משי עכביש, ניתן להחיל אותה גם על חקר סוגים אחרים של ביופולימרים המיוצרים מחלבונים רקומביננטיים. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בטכניקה זו יתקלו בקשיים, כיוון שהיא דורשת מומחיות במספר דיסציפלינות, כולל הנדסה ביו-רפואית, ביופיזיקה, ביולוגיה תאית ומולקולרית וביוכימיה.הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר נדרשנו לחקות את תהליך הטריגה הטבעי של העכביש בניסיון לייצר סיבים סינתטיים. כדי להפיק את הפלסמיד שישמש לייצור משי עכביש, ה-CDNA הרצוי של משי העכביש מוגבר באמצעות סטים ספציפיים של פריימרים ומולחם לתוך וקטור ביטוי פרוקריוטי, כגון PBA topo thio fusion. וקטור זה כולל תג thio redoxin קצהי-טרמינלי כדי להקל על המסות חלבון המשי, ותג six x his קצהי-C לטיהור החלבון.לאחר הליגציה, מוצרים ששולבתו מוחדרים לתאי e coli כשירים, ומוגדלת מושבה המכילה פלסמיד. ביטוי חלבון משי עכביש מושרה לאחר מכן על ידי הוספת aose, והתאים נסובים ונשמרים בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד לשימוש. כדי ללייז את התאים הבקטריאליים, יש להוסיף 20 milliliters של one x lysis buffer למשקע התאים ולערבב עד להסספנסיה מלאה של התאים, כדי לקדם ליזיס נוסף של התאים. הוסף lysozyme לריכוז של one milligram per milliliter כדי לעכל DNA כרומוזומלי, פעולה המפחיתה את צמיגות התמיסה ב-100 micrograms של DNA.לאחר מכן, הניחו את הדגימה על מנער אורביטלי ונערו בעדינות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בצעו סוניקציה לתמיסה למשך דקה אחת בהגדרה 19 כדי להבהיר את התמיסה, ולאחר מכן צנטריפוגו ב-16,000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב, בדקו שהנוזל העליון (supernatant) אינו צמיגי והוא צלול; אם התמיסה צמיגית ועכורה, הוסיפו עוד DNAs, בצעו סוניקציה שנית ואספו שוב את הנוזל העליון.ברגע שהנוזל העליון (supernatant) צלול, העבירו אותו לעמודת BioRad poly prep נקייה בנפח 25 milliliter לצורך כרומטוגרפיית ספיחה של nickel NTA. כדי לטהר את חלבון היתוך (fusion protein), הוסיפו לעמודה מיליליטר אחד של תרחיף nickel NTA המכיל 0.5 milliliter של חרו지를, סגרו היטב את הפקק ואת הברז, ולאחר מכן הניחו את העמודה על מכשיר rocker למשך שעה אחת כדי להגיע לשיווי משקל ולאפשר את קישור ה-six X his tag לחרוזי ה-nickel NTA. הניחו את העמודה במצב אנכי על מעמד והמתינו כד שחרוזי ה-nickel NTA ישקעו למשך כשתי דקות.כאשר החרוצים שוקעים לחלוטין, ניתן לראות שכבה תכולה בהירה בתחתית. הסר את הפקק ואפשר לתמיסה לזרום דרך הברז. אסוף את התמיסה למבחנה קונית של 15 milliliter.לצורך ניתוח נוסף, הוסף 20 milliliters של wash buffer בריכוז one x ואפשר לסלקית השטיפה לשקוע. פתח את הברז ואסוף את ה-flow through לארבעה aliquots של five milliliter. לצורך ניתוח נוסף, אחסן את ה-aliquots בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius או minus 80 degrees Celsius לאחסון לטווח קצר או ארוך, בהתאמה.שימו לב שניתן להשתמש בנפחי שטיפה נוספים כדי להפחית חלבונים מזוהמים, אולם הדבר עלול להפחית את תנובת החלבון הכוללת. לאחר מכן, הוסיפו 20 milliliters של elution buffer בריכוז one x והמתינו עד שהשרף ישקע; פתחו את ברז העצירה ואפשרו לתמיסה לזרום. אספו תמיסה זו, הכוללת 20 milliliters, בארבע מנות של five milliliters לצורך ניתוח נוסף.יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C לאחסון לטווח קצר, או במינוס 80°C לאחסון לטווח ארוך. שים לב שניתן לאסוף נפחי אלוציה נוספים משרף הניקל NTA במידת הצורך. לאחר מכן, הפרד את החלבונים על בסיס המסה המולקולרית שלהם.באמצעות ניתוח SDS page, ויזואליזציה של החלבונים תבוצע באמצעות כסף או kumasi brilliant blue R 250; רק פרקציות טהורות יש להשתמש בשלבים הבאים. יש לאשש את זהות החלבון המטוהר באמצעות ניתוח Western blot; כדי להסיר מלחים ולרכז את החלבון, יש לבצע דיאליזה ולייבש את הדגימה בהקפאה (lyophilize) בהתאם להוראות במסמך הנלווה, ולאחסן את הדגימות המיובשות בהקפאה בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. מטרת השלבים הבאים היא להכין את התמיסה (dope) והמזרק לתהליך הטהירה (spinning), תוך עבודה תחת מנדף בטיחות.הוסיפו בזהירות את הכמות המתאימה של hexafluoroisopropanol או HFIP לכל מבחנה של אבקת חלבון מיובשת כדי להגיע לריכוז של 200 milligrams per milliliter עד 500 milligrams per milliliter, או 20% עד 50% משקל לנפח. סגרו את המבחנה עם פקק בהקדם האפשרי לאחר הוספת ה-HFIP, עטפו את המבחנות ב-Parafilm והניחו אותן על רוקר (rocker) כדי להמיס את החלבון; השתמשו בוורטקס (vortex) כדי להקל על ההמסה. תהליך זה עשוי להימשך עד יומיים.לאחר ההמסה, סובב את הדגימה בצנטריפוגה ב-16,000 Gs למשך שתיים עד שלוש דקות. כאשר החלבון נמצא בתמיסה, הוא מכונה spinning dope. התמיסה תהיה צמיגית מאוד.יש לוודא שאין צברים (aggregates), שכן אלו עלולים לסתום את המזרק. בשלב הבא, טענו בזהירות לפחות 25 µL של תמיסת הפולימר (spinning dope) לתוך מזרק Hamilton Gast tight, המצויד במחט בעלת קוטר פנימי של 127 micron, כאשר המזרק מוחזק עם המחט כלפי מעלה כדי ללחוץ על הבוכנה. להסרת בועות אוויר, חשוב מאוד להסיר את בועות האוויר מכיוון שהן יגרמו לחוסר אחידות בסיב.בשלב הבא, נעל את המזרק למכשיר Harvard, משאבת מזרקים מדגם 11 plus. הנח ביקר של 400 milliliter ממולא ב-95% isopropanol על מעמד נייד, כך שקצה המזרק רק יחדור את פני השטח של האלכוהול. הגדר את משאבת המזרקים ל-15 microliters לדקה ולחץ על start.סחיטת הסיב. הפעולה צריכה להימשך כדקה עד שתי דקות, תלוי בנפח ההתחלתי של תמיסת השטירה (spinning dope). לאחר שכל התמיסה נשטרה לסיב, יש להשאיר את הסיב בתוך האיזופרופנול למשך 20 דקות להגעה לשיווי משקל מלא.בשלב הבא, הדגימה נאספת באמצעות התקן סלילה (spooling device). התקן הסלילה שנעשה בו שימוש כאן נוצר על ידי הדבקת מסרקי מתכת לקליבר דיגיטלי. כפי שמוצג בתמונה זו, יש להדביק סרט דו-צדדי על שני צדדיו של המסרק שבהתקן הסלילה.לאחר מכן, חברו את התקן הסלילה למנוע. הגדירו את המנוע לסלילת החוטים במהירות של 2 RPM. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, תפסו בעדינות קצה אחד של הסיב ומשכו אותו באיטיות אל מחוץ לאיזופרופנול.חברו אותו לקצה של אחת מזרועות המסרק על הסליל. השתמשו בסרט ההדבקה הדו-צדדי; את השלבים הבאים יש לבצע ללא הפסקה כדי למנוע מהסיבים להתייבש. הפעילו את המנוע והשתמשו במוט זכוכית כדי להוביל בעדינות את הסיב אל מכשיר הסלילה.אין לאפשר לסיב להכפיל את עצמו ולהיערם. הסרט הדו-צדדי אמור למנוע את החלקתו של הסיב כולו ולאפשר מתיחה סלקטיבית של מקטעי הפנים של הסיבים בתוך זרועות הקליבר.לאחר שכל הסיב נכרך, נתק את הסpool מהמנוע ומרח דבק על קצהו של כל סיב משי על הסרט דו-הדבקי. פעולה זו מקבעת את משי העכביש למכשיר. חבר את ה-spool למפעיל הליניארי (linear actuator) כדי לבצע את מתיחת לאחר הסיבוב (post spin draw).קבע את האורך ההתחלתי של הסיבים באמצעות ה-C. זהו האורך הפנימי של הסיב. הוא אינו כולל את האורך שהודבק ונכרך סביב הסpool. הנמך את ה-spool לתוך אמבט של 75% isopropanol.יש להמתין 10 דקות לאיזון של הסיבים. הגדירו את מהירות המפעיל הליניארי ל-1.5 millimeters per second. על בסיס האורך ההתחלתי, חשבו את האורך הסופי עבור יחס המתיחה הרצוי לאחר השליפה.ניתן לשלוט במידת המתיחה בהתבסס על המהירות או האורך, תלוי בהגדרות המערכת. לדוגמה, עבור אורך התחלתי של 15 millimeters ויחס מתיחה רצוי לאחר השליפה של three x, האורך הסופי צריך להיות 45 millimeters. ניתן לחשב זאת גם על ידי הפעלת המפעיל הליניארי למשך 20 seconds בקצב של 1.5 millimeters לשנייה.שנית, לאחר השלמת השליפה של סלסילת הדגימות, הרם לאט את הסליל מתוך האיזופרופנול. המתן דקה אחת להתאיידות טיפות האיזופרופנול לצורך איסוף הדגימות. ראשית, גזור קצה אחד של הסיב תוך כדי החזקת הקצה השני בעזרת פינצטה.גזרו את הקצה הזה והצמידו את הסיב למסגרות של בריסטול או רדיד לצורכי בדיקה. אם נדרשים יחסי מתיחה נוספים לאחר שלב המיכל, הורידו את הסליל בחזרה לאמבט ה-75%isopropanol. המתינו 10 דקות להשגת שיווי משקל של הסיבים, ולאחר מכן עברו למיכל הבא.יחס מתיחה. רשמו את הלחות והטמפרטורה, העלולות להשפיע על הסיבים. תכונות מכניות.יש לאפשר לדגימות שנאספו להגיע לשיווי משקל עם סביבת המעבדה הסטנדרטית. לחות של 40% וטמפרטורה של 25 degrees Celsius הן תנאים אידיאליים למשך שעה אחת לפחות לפני הבדיקה המכנית. כאשר הסיב מורכב על מסגרת הבריסטול, יש למרוח דבק מהיר (super glue) על קצוות הבריסטול או הרדיד כדי לקבע את הסיב על המסגרת.שימו לב לגודל הפתח של המסגרת. זהו האורך ההתחלתי של הסיב הנבדק. מוצגת כאן מסגרת עם פתח של one inch; השתמשו במיקרוסקופ אור בהגדלה של 100 x ומעלה כדי למדוד קטרים לאורך הציר האורכי של הסיב.יש לתעד לפחות שלוש מדידות. ככל שההגדלה המשמשת גבוהה יותר וככל שנלקחות יותר מדידות, כך הדיוק יהיה טוב יותר. הצמדו את מסגרת הבריסטול למסגרת העמסה מכנית של מכשיר tenter.לאחר מכן, חתכו את המסגרת משני הצדדים כך שהמתיחה תפעיל כוח רק על הסיב. קרעו את הדגימה ואספו את הנתונים. מומלץ להשתמש בקצב מאמץ סטנדרטי של 2% לשנייה.הליך איסוף הנתונים המכניים עשוי להשתנות בהתאם למותג מכשיר המתיחה (tenter) שבו נעשה שימוש במחקרים. באמצעות הנתונים שנאספו עבור הקוטר הממוצע, ניתן לשרטט עקומת מאמץ-מעוות בתוכנת Microsoft Excel. כעת ניתן להניח את הסיב השבור תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) לצורך ניתוח מורפולוגי ומדידות של קוטר נקודת השבירה.ניתן להשתמש במקטע הסיב הרחוק מנקודת השבירה כדי להעריך ולבדוק את הקוטר הראשוני שנמדד באמצעות מיקרוסקופ אור. חלבון משי העכביש MASP one בוטא וטוהר מחיידקים כדי לקבוע את טהרת החלבון לפני טוויית הסיב; החלבונים עברו הפרדה לפי גודל. באמצעות ניתוח SDS page ולאחריו ויזואליזציה באמצעות צביעת כסף כפי שמוצג כאן, שש התמיסות חושפות כי מרבית הדגימה משתחררת בארבע הפראקציות הראשונות.חלבון משי העכביש TUSP one יוצר גם הוא בהתאם לפרוטוקול המוצג כאן, ונטווה לסיבים כדי לקבוע את התכונות המכניות של סיבי משי סינתטיים בצורה צינורית. סיבי המשי נטווחו ובוצעו יחסי מתיחה לאחר הטוויה (post-spinning draw ratios) עולים. הצבעים בתמונה זו מראים סיבים שהוכפפו ליחסי מתיחה שונים לאחר הטוויה, בטווח שבין 2.5x ל-6x. הסיבים מראים שונות נמוכה בתוך קבוצת היחס שלהם.ככל שיחסי המתיחה של המכונה עולים, חוזקה של הסיב גדלה בעוד שהנתיב פוחת. עם זאת, הסיבים הראו רמות שקולות של קשיחות. כדי להעריך את המבנה העל-מיקרוסקופי של הסיבים, נרכשו תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים סורק של סיבים שנוסלו מחלבונים רקומביננטיים של tsp one, כפי שניתן לראות כאן. ניתן לראות את הפני השטח החלקים בהגדלה של 500x וב-5,000x.ניתן להבחין בליבה הפנימית הצפופה משבירה טבעית של הסיב. עובדה זו מצביעה על כך שהחלבונים הרקומיננטיים עוברים הרכבה ואריזה תקינה במהלך תהליך האקסטרוזיה. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה בתוך 10 ימים במידה ובוצעה כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להסיר את כל המלח מהחלבון הרקומבננטי המטוהר לפני שלב הייבוש בהקפאה (lyophilization), וכן לוודא כי נעשה שימוש בריכוז נכון של תמיסת הסיבון (dope) כדי למנוע סתימה של המחט במהלך תהליך האקסטרוזיה. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לטוות פיברואינים אחרים, כגון mes, P one TUSB one ו-P ysb one, לסיבים בודדים או כחומרים מרוכבים כדי להפיק מגוון רחב של ביו-חומרים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי הביו-הנדסה ומדע החומרים לבחון את השימוש במשחית עכביש סינתטי ליישומים בעלי השלכות בתחומי הרפואה הצבאית, האמנות, הספורט ותעשיית הרכב.לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם בנוגע לאופן טביבּת סיבי משי סינתטיים או חומרים מרוכבים באמצעות חלבונים שזוהרו מחיידקים. זכרו כי עבודה עם AFib עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להקפיד תמיד על נקיטת אמצעי זהירות, כגון עבודה תחת מנדף כימיים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

synthetic-spider-silk-production-on-a-laboratory-scale

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה להסיר את משי לייצור בלוטות מהבטן של הנקבה עכבישים אלמנה שחורה. הליך זה מאפשר בידוד מהיר של משי לייצור שבע ברורים בלוטות באופן מטוהרים, תהליך חשוב עבור החוקרים ללמוד ייצור והרכבה עכביש המשי סיבים.

Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות

סיבי משי עכביש להציג תכונות מכאניות יוצאות דופן. תכנון...

התקנים כוללים מסנן אוויר משתלב לא ארוג של חלבונים קורי עכביש רקומביננטי electrospun

פרוטוקול microfluidic ספינינג, מיקרו אפיון מחדש fibroin משי monofilament מוצג.

Microfluidic יבש-ספינינג ואפיון של סיבי Fibroin משי מחדש

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מסיסים במים רקומביננטי עכביש משי פתרונות חלבון וצורות חומרים שניתן ליצור מאותם פתרונות.

היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית Solvation באמצעות חום ולחץ

תוספות תרבית רקמה עם ממברנות פלסטיק הן תקן הזהב במעבדות תרביות תאים כתומכות חדירות לביסוס שכבות תאים ומודלים של רקמות מחסום. במאמר זה אנו מציגים שיטה פשוטה להחלפת קרום הפלסטיק בקרום רלוונטי יותר מבחינה ביולוגית העשוי מחלבון משי עכביש רקומביננטי מתפקד.

חיקוי קרום מרתף ננופיברילרי עשוי ממשי עכביש פונקציונלי רקומביננטי בתוספות תרבית רקמה בהתאמה אישית

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות...

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

מיזוג הוא גישה יעילה ליצירת חומרים ביולוגיים עם מגוון רחב של מאפיינים ותכונות משולבות. על ידי חיזוי האינטראקציות מולקולריות בין חלבוני משי טבעי השונים, פלטפורמות סגסוגת חלבון חדשות משי משי עם גמישות מתכונן מכאנית, תגובה חשמלית, שקיפות אופטית, processability הכימי, פריקות ביולוגית, או יציבות תרמית יכולות להיות מתוכננות.

עיצוב פרוטאין משי משי חומרי סגסוגת עבור יישומים ביו

אנו מספקים הוראות מפורטות להכנת נקודות קוונטיות ממוקדות חד-ערכיות (mQDs) מ-DNA זרחני באורך מוגדר. עטיפת DNA מתרחשת בתשואה גבוהה, ולכן מוצרים אינם דורשים טיהור. אנו מדגימים את השימוש בתג SNAP כדי למקד mQDs לקולטני פני התא ליישומי הדמיה של תאים חיים.

ייצור ומיקוד של חד-אנרגיה קוונטית נקודות

מוצג פרוטוקול ליצירת וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה החסרים את כל רצפי הקידוד הוויראליים. שיבוט של טרנסגנים הכלולים בגנום הווקטור מבוסס על אנדונוקלאזות ביות. הגברת הנגיף בתאי יצרן הגדלים כתאים נצמדים ובתרחיף מסתמכת על וירוס עוזר המספק גנים נגיפיים בטרנס.

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

למדו לייצר סיבי משי עכביש סינתטיים בקנה מידה מעבדתי באמצעות חיקוי תהליך הסיבוב הטבעי. השיטה כוללת ייצור חלבוני משי רקומניים בחיידקים, טיהור כרומטוגרפי וסיבוב לתוך אמבט אלכוהול מייבש.

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

גלה סרטונים נוספים