חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד חומצות גרעין מוכנות ל-PCR וחלבון אימונו-ריאקטיבי מדגימה, ללא צורך בחשמל או בתשתית מעבדה. בידוד חומצות הגרעין והחלבונים מתחיל בערבוב הדגימה עם גואנידין ותיוציאנט כדי ל lysed את הדגימה, והעברת התערובת על הסורבנט בפיפטת ההוצאה. לאחר המעבר החמישי והסופי על הסורבנט, העבירו את התערובת לבאפר להוצאת חלבונים, והניחו בצד לצורך בידוד החלבון האימונו-ריאקטיבי.

בשלב הבא, הסופח וחומצות הגרעין הקשורות נשטפים על ידי העברת 95% ethanol על גבי הסופח. לאחר מכן, הסופח וחומצות הגרעין הקשורות מיובשים מספר פעמים על ידי העברת אוויר סביבתי על גבי הסופח למשך חמש דקות. השלב הסופי בבידוד חומצות גרעין המוכנות ל-PCR הוא השחרור של חומצות הגרעין מהסופח באמצעות 250 µL של tris או תמיסה מימית דומה אחרת לצורך בידוד החלבון האימונו-ריאקטיבי.

לאחר ערבוב הדגימה עם חוצץ חילוץ החלבון (protein extraction buffer), השתמש בפ pipette חילוץ שנייה והעבר את התערובת על גבי הסורבנט 15 פעמים. השלב הבא הוא שטיפת הסורבנט והחלבון הקשור על ידי העברת 95% ethanol על גבי הסורבנט מספר פעמים. לאחר מכן, הסורבנט והחלבון הקשור מיובשים על ידי העברת אוויר מסביב על גבי הסורבנט למשך חמש דקות.

השלב האחרון של הפרוטוקול הוא אלוציה של החלבון מהסורבנט. בסופו של דבר, פיפטת המיצוי המשמשת בהליך זה מאפשרת בידוד של חומצות גרעיניות המוכנות ל-PCR וחלבון אימונו-ריאקטיבי ללא צורך בחשמל. היי, שמי דייב פולובסקי.

אני מדען מחקר בכיר ב-Kubric Incorporated בבאפלו, ניו יורק, והיום נלמד טכניקה שתבודד הן חלבונים והן חומצות גרעיניות באופן סימולטני, ללא צורך בצנטריפוגה, בשייקר (vortex) או בכל ציוד מעבדה חיצוני אחר. לפני ליזיס של הדגימות, יש לוודא שהדגימות במצב נוזלי. אם הדגימה היא מוצקה, למשל מזון או צואה, יש להשעות את הדגימה במצע נוזלי כגון מים או תמיסת סליין בבופר פוספט (phosphate buffered saline).

ערבב 500 µL מהדגימה עם 500 µL של guine thiocyanate בריכוז 6 M בתוך פרוטובולה של 1.5 mL. לאחר מכן, לחץ על נורת הפפיפט של המיצוי כדי להוציא את האוויר. שאב את כל דגימת ה-1 mL אל תוך פפיפט המיצוי מעל החומר הסופג על ידי שחרור איטי של הנורת הפפיפט.

הפוך את כלי המיצוי כך שפיתי הסורבנט והדגימה יזרמו אל תוך הנורה. גרס את פיתי הסורבנט יחד עם הדגימה בתוך הנורה, תוך הקפדה שלא להוציא את הדגימה מחוץ לפפית המיצוי.

הפוך את פיפט ההפקה, והעבר את הדגימה חזרה אל המבחנה המקורית בנפח 1.5 מיליליטר. שאב את כל דגימת הנפח של 1 מיליליטר אל תוך פיפט ההפקה, כך שתעבור דרך הספיג (sorbent) בקצב בינוני. תוך הקפדה שהספיג יישאר בצוואר של פיפט ההפקה, רוקן את כל הדגימה אל תוך המבחנה בנפח 1.5 מיליליטר על ידי לחיצה על הפחס.

חזור על תהליך זה, והעבר את הדגימה על הסורבנט ארבע פעמים נוספות, לסך הכל חמישה מעברים. לאחר המעבר החמישי על הסורבנט, פרוק את כל דגימת ה-1 milliliter אל תוך 4 milliliter של באפר להפקת חלבונים בתוך מבחנה קונית של 15 milliliter. ערבב את המבחנה על ידי היפוך, לאחר מכן סגור את המבחנה והנח אותה בצד לשימוש מאוחר יותר.

שטפו את חומצות הגרעין המבודדות על ידי העברת מיליליטר אחד של 95% ethanol מעל הספיח שלוש פעמים, והחזירו את ה-ethanol למבחנה המקורית. לאחר המעבר האחרון, חזרו על השטיפה שלוש פעמים נוספות באמצעות מיליליטר שני של 95% ethanol. השלב הבא בפרוצדורה הוא ייבוש הספיח; שחזור חומצות הגרעין מהספיח מתבצע בצורה מיטבית כאשר הספיח יבש.

אני יודע ששלב זה הוא מייגע. עם זאת, אם תבצעו שלב זה בלוח הזמנים המומלץ, תוצאותיכם יהיו טובות יותר. לחצו ושחררו את הנורה במשך חמש דקות.

העבירו אוויר סביבתי דרך פיפטת המיצוי כדי לייבש את חומצות הגרעין ואת שכבת הסופח, ונגבו שאריות אתנול מקצה פיפטת המיצוי. באמצעות נייר ניגוב מסוג Kim wipe, השCיבו את חומצות הגרעין על ידי העברה של 250 µL של Tris בריכוז 10 mM על פני הסופח חמש פעמים. ניתן להחליף את באפר ה-Tris בכל תמיסה מימית מתאימה אחרת, כגון PBS.

התמיסה המתקבלת מכילה את החומצות הגרעיניות שהופקו; כדי לבצע תחילה הפקת חלבונים, ערבב את הדגימה בבפר חלבונים שהופרש מראש על ידי הפיכת המבחנה. העבר בפיפטה כ-2 עד 3 מיליליטר מתוך דגימה זו של 5 מיליליטר על הסורבנט של פיפטת הפקה חדשה. רוקן את כל הדגימה אל תוך אותה מבחנה קונית של 15 מיליליטר, תוך הקפדה לשמור את הסורבנט בצוואר של פיפטת ההפקה.

חזור על תהליך זה. העבר את הדגימה על הסורבנט 15 פעמים. שטוף את הסורבנט ואת החלבון הקשור על ידי העברת מיליליטר אחד של 95%Ethanol על פני מצע הסורבנט שלוש פעמים, תוך ריקון האתנול למבחנה המקורית; שטוף שלוש פעמים נוספות באמצעות מיליליטר שני של 95%ethanol.

השלב הבא של הפרוצדורה הוא ייבוש חוזר של הסורבנט. בדומה לחומצות גרעיניות, התאושש protein יעיל ביותר כאשר הסורבנט מיובש. למשך פרק זמן ממושך יותר.

לחצו ושחררו את הפפיפיט (bulb) במשך חמש דקות, כדי להעביר אוויר מהסביבה דרך פיפט ההפקה. כדי לייבש את מצע סופח החלבון, נגבו את שאריות האתנול מקצה פיפט ההפקה. בעזרת נייר Kim wipe, השיבו את החלבון על ידי העברה של 250 µL של PBS על גבי הסופח חמש פעמים.

ניתן להחליף את באפר ה-PBS בכל תמיסה מימית מתאימה אחרת, כגון tris 10 millimolar, pH 6.8. התמיסה המתקבלת מכילה את תכולת החלבון של הדגימה. גני ה-shiga toxin הקשורים לשבט E DL 9 33 של entero hemorrhagic e coli oh 1 5 7 H seven הועשרו מהליך הפקת חומצות גרעין וחלבונים באמצעות פיפטת ההפקה.

הגנים של רעלן השיגה (Shiga toxin), רעלן שיגה אחת ורעלן שיגה שתיים, נמצאים על פאגים בקטריאליים ממותנים דמויי למבדה ועל פאגים בקטריאליים פגומים תחת השליטה של מקדם ה-PR. הפעלת תגובת ה-SOS ב-e coli מובילה לאינדוקציה של פרו-פאג ו/או לייצור רעלן. במקרה זה, קיימת עלייה משמעותית בהגברה של הגן של רעלן שיגה שתיים כאשר תגובת ה-SOS מושרית על ידי mitomycin C, בהשוואה לבקרת הביקורת שלא טופלה.

דבר זה מרמז על השראת פרופאג' (pro phage) ושכפול גנום הפאג'. החלבון שהופק בניסויי בידוד חלבון וחומצות גרעין המתוארים בסרטון הוא אימונוראקטיבי. פרקציית החלבון המבודדת הועברה לפסי בדיקה מהירה מסוג lateral flow assay עבור e coli O 1 57.

הבקרה מראה זיהוי חיובי בכל הדגימות הנושאות e coli oh 1 5 7 עם או בלי השראה של shiga toin, כפי שנראה בנוכחות של שני פסים אדומים. הנתונים מראים גם תוצאות חיוביות עבור אותן דגימות הנושאות e coli oh 1 5 7 שעובדו לחילוץ חומצות גרעין וחלבונים באמצעות פיפטת החילוץ. נתונים אלו מוכיחים כי החלבון שהבודד מכל דגימה הוא אימונו-אקטיבי, ובכך הוא מעורר תגובה חיובית.

החלבון המבודד מתאים לאלקטרופורזה, כפי שמוצג כאן בג'ל 8%Acrylamide שצבעו kumasi ונטען עם BSA שבודד באמצעות שש מולר gudina isothiocyanate. באמצעות שימוש בשיטת המיצוי, בפיפט ובפרוטוקול הנלווה, ניכר כי הניידות האלקטרופורטית של החלבון המבודד זהה לזו של דגימות הביקורת. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך פחות מ-20 דקות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה ברורה של אופן בידוד חלבונים וחומצות גרעין מהמכשיר הפשוט. תודה שהקדשתם מזמנכם לצפייה בסרטון שלנו.