Name: חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למד שיטה לבידוד חומצות גרעין וחלבונים ללא חשמל באמצעות ספיחה בפיפטה. שיטה זו מאפשרת בידוד PCR וחלבונים אימונוריאקטיביים בחוץ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מימון לפיתוח פיפטה החילוץ נמסר בחלקו על ידי מחקר פנימי מענק פיתוח הוענק DRP.

1. לדוגמא תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות צריך להיות במצב נוזלי. אם המדגם הוא מוצק, מזון למשל, או שרפרף, המדגם צריך להיות תלוי מדיה נוזל כמו מים או פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 500 μL המדגם עם μL 500 של Thiocyanate Guanidine 6M (pH 6.5) בצינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדכא את הנורה של פיפטה חילוץ, לגרש את האוויר הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המדגם כל 1 מ&quot;ל לתוך פיפטה חילוץ, על החומר הסופג, בכך שהוא מאפשר הנורה לאט להרחיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את כלי החילוץ כך את החרוזים sorbent ומסננים מדגם לתוך הנורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את החרוזים sorbent עם מדגם של הנורה נזהרים שלא לגרש את המדגם מתוך פיפטה החילוץ. </li></ol> 2. חומצה הפקת גרעין (איור 1, לוח) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פיפטה חילוץ (פתיחה כלפי מטה) ולגרש את המדגם לתוך הצינור המקורי 1.5 מ&quot;ל. </li> &lt;li&gt; משוך את המדגם כל 1 מ&quot;ל לתוך פיפטה חילוץ, חולפת על פני sorbent, בשיעור מתון, נזהרת לשמור sorbent בצוואר של פיפטה החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את המדגם כולו לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל מדכא את הנורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2 ו -2.3, עובר את המדגם על פי ארבעה sorbent יותר עבור סכום כולל של 5 כרטיסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המעבר על פני 5 sorbent, לגרש את המדגם כל 1 מ&quot;ל לתוך 4mL מאגר חלבון החילוץ (בצינור מ&quot;ל 15 חרוטית), לסגור את הצינור, ומניחים בצד לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את חומצות גרעין מבודדים על ידי העברת 1 מ&quot;ל של אתנול 95% במהלך שלוש פעמים sorbent, חוזר אתנול לצינור המקורי על המעבר הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.6 באמצעות מ&quot;ל 2 1, לשטוף אתנול 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ושחרר את הנורה במשך 5 דקות, עובר באוויר הסביבה ברחבי פיפטה החילוץ לייבש את חומצות גרעין / מיטה sorbent. נגב אתנול שיורית מקצה פיפטה החילוץ uלשיר Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את חומצות גרעין על ידי העברת 250 μL של 10 mM Tris (pH 6.8) במהלך חמש פעמים sorbent. מאגר טריס יכול להיות מוחלף על ידי פתרון אחר כל מימית מתאים כגון PBS. הפתרון שהתקבל מכיל את חומצות גרעין שחולצו. </li></ol> 3. הפקת חלבון (תרשים 1, לוח ב &#39;) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדגם והפקת חלבון צינור המאגר משלב 2.5 ידי היפוך ולהעביר כ 2-3 מ&quot;ל של מדגם זה 5 מ&quot;ל מעל sorbent של טפטפת החילוץ החדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את המדגם כולו לתוך הצינור אותו חרוטי 15 מ&quot;ל נזהר לשמור sorbent בצוואר של פיפטה החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1 ו -3.2, עובר את המדגם על פי 15 sorbent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף sorbent ואת החלבון מחויב להעביר 1 מ&quot;ל של אתנול 95% מעל המיטה sorbent שלוש פעמים, אתנול ולהוציא לתוך הצינור המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.4 באמצעות מ&quot;ל 2 1, לשטוף אתנול 95%. </li><html><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ושחרר את הנורה במשך 5 דקות, עובר באוויר הסביבה ברחבי פיפטה החילוץ לייבש את החלבון / המיטה sorbent. נגב אתנול שיורית מקצה פיפטה החילוץ באמצעות kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את החלבון על ידי העברת 250 μL של PBS על פי חמישה sorbent. מאגר PBS יכול להיות מוחלף על ידי פתרון אחר כל מימית מתאים כגון 10 mM Tris (pH 6.8). הפתרון שהתקבל מכיל את תכולת החלבון של המדגם. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="איור 1 א" /> באיור 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="איור 4" /> באיור 4. תוכן &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5.

<ol><li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries%2C+1984-2005%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li>
<li>Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample%5BTitle%5D)+AND+%22United+States+Patent+and+Trademark+Office%22%5BJournal%5D)">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li>
<li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li>
<li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li>
<li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+Genetic+Switch%3A+Phage+Lambda+Revisited%22">A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited</a>. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).</li>
<li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

, הכלי chemistries והפרוטוקול המתוארים בדוח זה מייצגים את הדוגמה הידועה הראשונה של מערכת החשמל ללא רב מקרומולקולה, חילוץ, כי יכול להיות מנוצל בתחום מבוססות, הצבע של טיפול יישומים. שני הסוגים מקרומולקולה ניתן ליישם במספר מכשירי אבחון אנליטי או במורד הזרם. כך, למשל, חומצות גרעין בודדים הם בעלי איכות PCR (תרשים 2 ו - 3) ואילו מרכיב החלבון של המדגם הוא immunoreactive (איור 4). ניצול של מערכת זו החילוץ באזורים מוגבלים צנועים או משאב של העולם יכול להפחית באופן דרסטי את נטל המחלה על אוכלוסיות המתגוררות שם. מערכת השאיבה יכולה גם לסייע מעקב תוכניות מחלות ברחבי העולם על ידי מתן השיטה היעילה חזקים עדיין מהיר עלות עיבוד המדגם במקומות צנועים או מרוחק. היבט אחד חשוב שיטת החילוץ שתואר לעיל הוא כיזה יכול להיות שונה על ידי המשתמש. לדוגמה, במקרים שבהם גודל מדגם גדול יותר או פחות מ -500 μLs הראשונים (שלב 1.2), המשתמש יכול להתאים את כמויות של חומרים כימיים בהתאם. כלומר, היחס בין נפח של ריאגנטים את גודל המדגם צריך להישאר קבוע, בעוד כמויות מוחלטות ניתן לשנות. כמו כן, התאמות במספר קטעים מ sorbent יכול להיות גם על פי שיקול דעתו של המשתמש. לדוגמה, אם נפח דגימה גדול יותר משמש, להעביר את המדגם על פני יותר פעמים מאשר sorbent הרשומים (שלבים 2.4 &amp; 3.3) יגדיל את הסיכוי של סוג מקרומולקולה (חומצת גרעין או חלבון) קשר sorbent. הגידול קטעים צריך להגדיל את יעילות ללכוד עד רוויה sorbent הוא הגיע. מצאנו כי הכלי כריה chemistries הקשורים יש מספר מגבלות, המשמעותי ביותר מהם הוא כי כימיה מיצוי החלבון אינה יעילה להחלמה של glycosylated ביותרחלבונים. במקרה של אבחון במורד מטרות חלבון glycosylated, מערכת זו לא יכול להיות אידיאלי עבור זיהוי. בנוסף, הגבולות העליונים והתחתונים של יעילות מיצוי לאף חומצות גרעין או חלבונים עדיין נקבע, ואופטימיזציה מתנהלת על מנת למקסם את יעילות השיקום. פיתוח נוסף של הכלי יהיה להתגבר על פערי ידע הנוכחיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Guanidine Thiocyanate </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109827-1 ליטר </td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

פתוגנים מסורתיים ומתפתחים כגון Escherichia coli Enterohemorrhagic (EHEC), pestis Yersinia, או הפריון מבוססי מחלות הם דאגה משמעותית עבור ממשלות, תעשיות ואנשי מקצוע רפואיים ברחבי העולם. לדוגמה, EHECs, בשילוב עם Shigella, אחראים למותם של כ 325,000 ילדים בכל שנה, והם נפוצים במיוחד בעולם המתפתח בו מעבדה מבוססי זיהוי, נפוץ בארצות הברית, אינו זמין 1. פיתוח והפצה של עלות נמוכה, בתחום מבוססות, הצבע של טיפול כלים כדי לסייע בזיהוי מהיר ו / או אבחון של פתוגנים או סמני המחלה יכולים לשנות באופן משמעותי את התקדמות המחלה ואת הפרוגנוזה לחולה. פיתחנו כלי לבודד חומצות גרעין וחלבונים ממדגם על ידי מיצוי מוצק שלב (SPE) ללא חשמל או הקשורים ציוד מעבדה 2. מקרומולקולות את מבודדות יכול לשמש diagnoSIS או במעבדה קדימה או באמצעות מבוססי בשדה נקודות של טיפול פלטפורמות. חשוב לציין כי שיטה זו מספקת לצורך השוואה ישירה של חומצות גרעין חלבון נתונים ממדגם בלתי מפוצלת, מציע ביטחון דרך אישורו של ניתוח גנטי ו proteomic. כלי הבידוד שלנו מנצל את תקן התעשייה עבור בידוד מוצק בשלב חומצות גרעין, הטכנולוגיה בום, המבודד חומצות גרעין מפתרון מלח chaotropic, בדרך כלל isothiocyanate guanidine, באמצעות קשירה סיליקה מבוססי חלקיקים או מסננים 3. מוצק בשלב כימיה הקניינית של CUBRC החילוץ משמש לטיהור חלבונים מפתרונות מלח chaotropic, במקרה זה, מפסולת או זרימת-thru בעקבות בידוד חומצות גרעין 4. לפי האריזה היטב מאופיין chemistries לפלטפורמה קטן, זול ופשוט, אנו יצרו מערכת ניידת של חומצות גרעין להפקת חלבון זה יכול להתבצע תחת variety של תנאים. חומצות גרעין מבודדים יציבים יכול להיות מועבר למצב שבו הכוח זמין עבור הגברה PCR בעוד תכולת החלבון יכול להיות מנותח באופן מיידי על ידי כף יד או אחרים של מערכת החיסון מבוסס מבחני. זיהוי מהיר של סמני המחלה בתחום יכול לשנות באופן משמעותי את התוצאה של המטופל על ידי הפניית כמובן נכון של הטיפול בשלב מוקדם יותר של התקדמות המחלה. כלי בשיטה המתוארת מתאימים לשימוש עם כל גורם כמעט זיהומיות ולהציע למשתמש יתירות של רב מקרומולקולה ניתוחים מסוג תוך צמצום הנטל הלוגיסטי שלהם.

בידוד חומצות גרעין: חומצות גרעין הן מבודדות PCR amplifiable וללא זיהום חלבון. דוגמה 1: חומצות גרעין שנמצאו מתאימים לשימוש ב PCR יישומים מבוססי. לדוגמה, תרשים 2 מציג הגברה של גנים Shiga הרעלן הקשורים Enterohemorrhagic א &#39; coli O157: H7 המתח אדי-933 (ATCC # 35150) מההליך חומצה / חלבון גרעין החילוץ באמצעות פיפטה החילוץ. גנים את הרעלן Shiga stx 1 ו 2 stx נמצאים על bacteriophage למבדה כמו ממוזג ופגום bacteriophage זו ואחרות Enterohemorrhagic א &#39; קולי זנים הנתון לשליטתו של היזם P R 5 6 7 8. ההפעלה של התגובה SOS ב א coli גורם prophage ואינדוקציה / או ייצור הרעלן 9. שמנו מנוצל גירסה שונה של assay PCR מרובב על ידי פנג et al. 11 לזהות stx 1 ו - 2 גנים stx בתרבות והן דגימות שפכים חדים. מסלולים A ו-B באיור 2 מראים את התוצאות של הגברה PCR מדגם תרבות מעובד (מסלול) ו מדגם תרבות מעובד (מסלול ב &#39;). תוצאות אלו משמעות זהה כמעט אין אובדן הנאמנות של חומצות גרעין מעובדים או מבודד. אנו מוגבר הבא ביוב גולמי המחודד (נתיב ד &#39;) או חומצות גרעין מבודדים מן הביוב המחודד (נתיבי E &amp; F). נתונים אלו מעידים כי חומצות גרעין בודדים הביא הגברה גדולה יותר לעומת הלא מבודדים חומצות גרעין מ דגימות שפכים חדים. לפיכך, אנו מסיקים כי בין אם מעכבי ה-PCR נמצא באופן טבעי הביוב הוסרו על בידוד או חומצות גרעין רוכזו על הבידוד. השילוב של שני אלה השערות הוא גם אפשרי. ספקטרוסקופיה אולטרה סגול שימש הבא כדי להראות את חומצות גרעין בודדים היו חופשיים יחסית Oחלבון ו מזהם. איור 3 מציג את ספקטרום UV של 2 א ​​&#39; coli O157: H7 גרעין חומצה עקירות, בידוד שכותרתו א &#39;וב&#39; בידוד, לעומת הספקטרום מנורמל של התרבות חיידקים, שכותרתו בידוד מראש. ספקטרום UV של חומצות גרעין מבודדים דומה את הספקטרום של חומצות גרעין טהור, בעל היחס מחושב של ספיגת בין 260 ננומטר ו -280 ננומטר המתקרבים 1.8 10. נתונים אלו מראים כי יש מעט מאוד חלבון זיהום בשבריר חומצות גרעין התאושש תוך שימוש בטכניקה המתוארת. בידוד חלבון: חלבון התאושש הניסוי חומצה / חלבון גרעין הבידוד הוא immunoreactive וזהה electrophoretically לחלבון טהור. דוגמא 2: חלק החלבון המבודד היה מוחל על ה RapidChek קולי O157 לרוחב תזרים assay רצועות (SDIX, Inc). בקרת להראות הזדהות חיובית בכל דגימות מחסה א &#39; coli<html> O157, עם או בלי אינדוקציה STX (איור 4, נתיבי B ו-C, בהתאמה). הנתונים גם מראים איור 4 תוצאות חיוביות עבור אותם דגימות מחסה א &#39; coli O157 שעובדו על חומצות גרעין ולאחר מכן חלבון בעזרת פיפטה החילוץ. נתונים אלו מראים כי חלבון מבודד מכל מדגם הוא immunoreactive ובכך מפעילה תגובה חיובית. הגברה PCR (כמתואר דוגמה 1) בוצע על דגימות חלבון להראות כי חלק החלבון המבודד היה נטול זיהום חומצות גרעין. את התוצאות של ניסויים אלה היו שליליות על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה. לכן, אנו מגיעים למסקנה כי תכולת החלבון המדגם הופרד זיהום חומצות גרעין. תוצאות אלו, נלקח עם כל אלה תיאר את המופע צעד בידוד גרעין חומצה כי חומצות גרעין ותוכן חלבון מבודדים צעדים שהכינו. t &quot;&gt; דוגמה 3:. חלבון מבודד מתאים אלקטרופורזה 10 איור 5 מתאר coomassie מוכתם ג&#39;ל acrylamide 8% עמוסה BSA (איור 5, נתיבי &amp; C) BSA מבודד isothiocyanate guanidine 6M באמצעות מיצוי פיפטה הקשורים פרוטוקול. ניידות electrophoretic של חלבון מבודד זהה לזה של דגימות בקרה. כך אנו מסיקים כי תהליך החילוץ אינו משנה את מבנה קוולנטי של חלבון מבודד. <img alt="איור 1 א" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> איור 1, פאנל: תיאור של הליך מיצוי טיפוסי גרעין חומצה המדגם הוא מעורבב עם thiocyanate guanidine 6M בצינור המדגם עברו במהלך חמש פעמים sorbent.. לאחר המעבר האחרון, מדגם מתווסף למאגר מיצוי חלבון. חומצות גרעין sorbent ואת כפות נשטפים פעמיים עם אתנול. המדגם הוא אז באוויר DRied ו eluted מ sorbent. <img alt="איור 1 ב" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> תרשים 1, לוח ב &#39;: תיאור של הליך חלבון אופייני החילוץ מדגם מעורבב עם מאגר חלבון במנותק שלב 1, איור 1, פאנל הוא חלף על פני sorbent של טפטפת ממוצא 2 15 פעמים.. המשך התהליך זהה לזה של פרוטוקול חומצות גרעין החילוץ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> איור 2:. תמונה שלילית של ברומיד צבעונית ethidium agarose ג&#39;ל מרובב Shiga רעלן 1 ו 2 הגברה ניסוי גנטי בוצע באמצעות דגימות תרבות נתיבים (A ו-B) או דוגמאות שפכים גולמיים מעוטרות א &#39; coli O157: H7 (נתיבי D, E ו-F). הדגימות היו או להוסיף ישירות לצינור התגובה PCR (נתיבי A ו-D) או את הדוגמאות עובדו באמצעות proces בידודs ואת חומצות גרעין שחולצו נוספו צינור התגובה PCR (דוגמאות B, E ו-F). פרוטוקול ה-PCR היא שינוי של 1 תיאר פנג ואח&#39; 11. שינוי שלנו ממוקד רק אלה מוגבר על ידי stx 1 (הלהקה התחתון) ו stx 2 (הלהקה העליון) זוגות פריימר, שומטת את כל זוגות פריימר אחרים. ליין C הוא סולם מ 1KB BioRad. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> איור 3: תוצאות ספקטרוסקופיה UV של א &#39; coli O157: H7 חומצות גרעין בודד באמצעות פיפטה החילוץ דיווחו על חומצות גרעין בודדים מסומנים בידוד A ו-B בידוד.. ספקטרום UV של המדגם נבדק גם לפני מיצוי חומצות גרעין מתויג מראש בידוד. ספקטרום התקבלו באמצעות U3010 Hitachi ספקטרופוטומטר חבילת הקשורים תוכנה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; איור 4:. צילום צבע של רצועות הבדיקה RapidChek תוכן החלבון של דגימות בשימוש בתרשים 2 היה מבודד באמצעות פיפטה החילוץ ונבדקו על תגובתיות-חיסונית על ידי assay הזרימה לרוחב. נתיבי AC הם פקדים לא מעובדים, כלומר, תרבית תאים זה התווסף פס הבדיקה ללא חומצות גרעין או מיצוי חלבון. ליין הוא ה קולי BL21 DE3 pLysS כביקורת שלילית, Lanes B ו-C הצג E. coli O157: H7, כי היה מטופל (ב), או שטופלו mitomycin C למשך 4 שעות (C). מסלולים ד עד h להראות את התוצאות של הוספת חלבון המופק על מקלוני הבדיקה לרוחב הזרימה. נתיבי D ו-E נבדקו באמצעות תמצית חלבון מן ה coli BL21 DE3 pLysS או בלי (ד &#39;) או עם mitomycin C טיפול (ה) לצורך ביקורת שלילית. נתיבי FH להציג את התוצאות כאשר חלבון המופק מן ה coli O157: H7 היה בשימוש. חלבון היה שחולצו מן מטופל (F), או משעה 2 (ג) או 4 שעות (H) mitomycin תרבויות ג שטופלו.תוצאות חיוביות לייצר קו אדום כפול. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> איור 5:. צילום צבעונית Coomassie SDS-PAGE BSA היה מבודד מן הפתרון באמצעות פיפטה החילוץ ופרוטוקולים המתוארים. מסלולים A ו-C הם נתיבים שליטה של ​​250 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - 500 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בהתאמה. נתיבי B ו-D מתארים BSA התאושש פתרונות המכילים ריכוז זהה בקרות בהתאמה.

כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.

פתוגנים מסורתיים ומגיעים, כגון Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, או מחלות מבוססות פריונים, מעוררים דאגה משמעותית...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד חומצות גרעין מוכנות ל-PCR וחלבון אימונו-ריאקטיבי מדגימה, ללא צורך בחשמל או בתשתית מעבדתית. בידוד חומצות הגרעין והחלבונים מתחיל בערבוב הדגימה עם גואנידין ותיוציאנט כדי ללוות את הדגימה, והעברת התערובת על פני הסורבנט בפיפטת המיצוי. לאחר המעבר החמישי והסופי על פני הסורבנט, העבירו את התערובת למסייד חלבונים (protein extraction buffer) והפרידו אותה לצורך בידוד החלבון האימונו-ריאקטיבי.בשלב הבא, שוטפים את הסופח ואת החומצות הגרעיניות הקשורות אליו על ידי העברת 95% ethanol על הסופח. לאחר מכן, מייבשים את הסופח ואת החומצות הגרעיניות הקשורות מספר פעמים על ידי העברת אוויר בטמפרטורת החדר על הסופח למשך חמש דקות. השלב האחרון בבידוד חומצות גרעיניות המוכנות ל-PCR הוא אלוציה של החומצות הגרעיניות מהסופח באמצעות 250 µL של tris או תמיסה מימית דומה אחרת לבידוד החלבון האימונוריאקטיבי.לאחר ערבוב הדגימה עם בופר מיצוי החלבון, השתמש בפפיטה מיצוי שנייה והעבר את התערובת על הסורבנט 15 פעמים. השלב הבא הוא שטיפת הסורבנט עם החלבון הקשור על ידי העברת 95% ethanol על הסורבנט מספר פעמים. לאחר מכן, מייבשים את הסורבנט ואת החלבון הקשור על ידי העברת אוויר בטמפרטורת החדר על הסורבנט למשך חמש דקות.השלב האחרון של הפרוטוקול הוא אלוציה של החלבון מהסורבנט. בסופו של דבר, פפיטת המיצוי המשמשת בהליך זה מאפשרת בידוד של חומצות גרעיניות מוכנות ל-PCR וחלבון אימונו-ריאקטיבי ללא שימוש בחשמל. היי, שמי דייב פולובסקי.אני מדען מחקר בכיר ב-Kubrick Incorporated בבאפלו, ניו יורק, והיום נלמד טכניקה שתבודד הן חלבונים והן חומצות גרעיניות באופן מקוון, ללא צורך בצנטריפוגה, בוורטקס או בכל ציוד מעבדה חיצוני אחר. לפני ליזיס של הדגימות, ודאו שהדגימות הן בצורה נוזלית. אם הדגימה מוצקה, לדוגמה, מזון או צואה, יש להשעות את הדגימה במצע נוזלי כגון מים או תמיסת סליין עם בופר פוספט (phosphate buffered saline).ערבבו 500 µL מהדגימה עם 500 µL של guanidine thiocyanate בריכוז 6 M בתוך מבחנה של 1.5 mL. לאחר מכן, לחצו על נורת השאיבה של פיפטת ההפקה כדי להוציא את האוויר. שאבו את כל נפח הדגימה (1 mL) אל תוך פיפטת ההפקה מעל החומר הסופג על ידי שחרור איטי של נורת השאיבה.הפוך את כלי המיצוי כך שחרוזי הסופח והדגימה יזלגו אל תוך הנורה. גרס את חרוזי הסופח יחד עם הדגימה בתוך הנורה, תוך הקפדה לא להוציא את הדגימה מחוץ לפיפט המיצוי.הפכו את פיפטת החילוץ, והשליכו את הדגימה חזרה אל תוך המבחנה המקורית בנפח 1.5 מיליליטר. שאבו את כל הדגימה בנפח מיליליטר אחד אל תוך פיפטת החילוץ, תוך מעבר על הסורבנט בקצב בינוני. תוך הקפדה להשאיר את הסורבנט בצוואר פיפטת החילוץ, השליכו את כל הדגימה אל תוך המבחנה בנפח 1.5 מיליליטר על ידי לחיצה על הפחה.חזור על תהליך זה, והעבר את הדגימה מעל הסורבנט ארבע פעמים נוספות, לסך הכל חמישה מעברים. לאחר המעבר החמישי מעל הסורבנט, רוקן את כל דגימת ה-1 milliliter לתוך 4 milliliter של בופר חילוץ חלבונים בתוך מבחנה קונית של 15 milliliter. ערבב את המבחנה על ידי הפיכה, ולאחר מכן סגור את המבחנה והשאר אותה בצד לשימוש מאוחר יותר.שטפו את החומצות הגרעיניות המבודדות על ידי העברת מיליליטר אחד של 95%ethanol על הסופח שלוש פעמים, תוך החזרת ה-ethanol למבחנה המקורית. לאחר המעבר האחרון, חזרו על השטיפה שלוש פעמים נוספות באמצעות מיליליטר שני של 95%ethanol לשטיפה. השלב הבא בפרוצדורה הוא ייבוש הסופח; שחזור החומצות הגרעיניות מהסופח מתבצע בצורה מיטבית כאשר הסופח יבש.אני יודע ששלב זה הוא מייגע. עם זאת, אם תשלים שלב זה במסגרת הזמן המומלצת, תוצאותיך יהיו טובות יותר. לחץ ושחרר את הפומפית במשך חמש דקות.העבירו אוויר סביבתי דרך פיפטת המיצוי כדי לייבש את חומצות הגרעין ואת שכבת הסופח, ונגבו שאריות אתנול מקצה פיפטת המיצוי. באמצעות נייר Kim wipe, השחילו חזרה את חומצות הגרעין על ידי העברה של 250 µL של TRIS בריכוז 10 mM על פני הסופח חמש פעמים. ניתן להחליף את בופר ה-TRIS בכל תמיסה מימית מתאימה אחרת, כגון PBS.התמיסה המתקבלת מכילה את החומצות הגרעיניות המופרשות. כדי לבצע תחילה הפקת חלבונים, ערבב את הדגימה בבפר חילוץ חלבונים שהופרש מראש על ידי היפוך השפופרת. העבר בפיפטה כ-2 עד 3 מיליליטר מתוך דגימה זו בת נפח 5 מיליליטר על פני הסורבנט של פיפטת חילוץ חדשה. רוקן את כל הדגימה אל תוך אותה שפופרת קונית בנפח 15 מיליליטר, תוך הקפדה לשמור על הסורבנט בצווארה של פיפטת החילוץ.חזור על תהליך זה. העבר את הדגימה על הסורבנט 15 פעמים. שטוף את הסורבנט ואת החלבון הקשור על ידי העברת מיליליטר אחד של 95%Ethanol מעל מיטת הסורבנט שלוש פעמים, תוך ריקון האתנול אל תוך המבחנה המקורית; שטוף שלוש פעמים נוספות באמצעות מיליליטר שני של 95%ethanol.השלב הבא בפרוצדורה הוא ייבוש הסורבנט שוב. בדומה לחומצות גרעיניות, השחזור של חלבונים מתבצע בצורה מיטבית כאשר הסורבנט מיובש למשך פרק זמן ממושך יותר.לחץ ושחרר את הפפיפטה במשך חמש דקות, כדי להעביר אוויר סביבתי דרך פיפטת ההוצאה. כדי לייבש את מצע סורבנט החלבון, נגב את שאריות האתנול מקצה פיפטת ההוצאה. בעזרת נייר Kim wipe, השג את החלבון על ידי העברת 250 microliters של PBS על הסורבנט חמש פעמים.ניתן להחליף את תחליל ה-PBS בכל תמיסה מימית מתאימה אחרת, כגון tris בריכוז 10 millimolar, pH 6.8. התמיסה המתקבלת מכילה את תכולת החלבון של הדגימה. הגנים של רעלן השיגה (shiga toxin) הקשורים לשבט E DL 9 33 של entero hemorrhagic e coli oh 1 5 7 H seven הועשרו מתוך הליך הפקת חלבוני חומצות גרעין באמצעות פיפטת הפקה.הגנים של רעלן השיגה (shiga toxin), רעלן שיגה 1 ורעלן שיגה 2, נמצאים על פאגים חיידקיים מיתונים דמויי למבדה (lambda) ועל פאגים חיידקיים פגומים תחת בקרתו של הקידום PR. הפעלת תגובת ה-SOS ב-e coli מובילה לאינדוקציה של פרו-פאג (pro phage) ו/או לייצור רעלן. במקרה זה, קיימת עלייה משמעותית בהגברה של הגן של רעלן שיגה 2 כאשר תגובת ה-SOS מושרית על ידי mitomycin C בהשוואה לבקרת הביקורת שלא טופלה.דבר זה מרמז על אינדוקציה של פרו-פאג'ים (prophages) ושכפול גנום הפאג'. החלבון שהופק מניסויי בידוד חלבון וחומצות גרעין המתוארים בסרטון הוא אימונו-ריאקטיבי. פראקציית החלבון המבודדת הועברה לפסי בדיקה מסוג lateral flow assay למשם זיהוי מהיר של e coli O 1 57.הבקרות מראות זיהוי חיובי בכל הדגימות הנושאות את e coli oh 1 5 7 עם או ללא השראת shiga toin, כפי שנראה בנוכחותן של שני פסים אדומים. הנתונים מראות גם תוצאות חיוביות עבור אותן דגימות הנושאות את e coli oh 1 5 7 שעובדו להוצאת חומצות גרעין וחלבון באמצעות פיפטת המיצוי. נתונים אלו מראים כי החלבון שבודד מכל דגימה הוא אימונו-אקטיבי, ובכך הוא מעורר תגובה חיובית.החלבון המבודד מתאים לאלקטרופורזה, כפי שמוצג כאן בג'ל 8%Acrylamide שצבעו ב-kumasi ובו BSA שבודד מ-six molar gudina isothiocyanate. באמצעות שיטת המיצוי, הפיפט והפרוטוקול הנלווה, ניידות האלקטרופורזה של החלבון המבודד זהה לזו של דגימות הביקורת. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך פחות מ-20 דקות.לאחר צפייה בסרטון זה, תגייעו להבנה ברורה של האופן שבו ניתן לבודד חלבונים וחומצות גרעיניות מהמכשיר הפשוט. תודה שהקדשתם מזמנכם לצפייה בסרטון שלנו.

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Isotachophoresis (ITP) היא הפרדה electrokinetic חזקים בטכניקה preconcentration עם יישומים החל איתור הרעלן הכנת המדגם. אנו בודקים את עקרונות פיסיקליים של ITP ו המתודולוגיה של יישום טכניקה זו שני יישומים דוגמה ספציפית: הפרדה וזיהוי של מולקולות קטנות וטיהור של חומצות גרעין מ lysate תרבית תאים.

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

מקור: .Dembowski, J. A ואחריםטיהור של DNA נגיפי לצורך זיהוי חלבונים נגיפיים ותאיים נלווים. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים את בידודם של קומפלקסים של חלבון-DNA ויראלי מגרעיני תאים באמצעות כימיית קליק (click chemistry) וטיהור באמצעות חרוזי מגנט. הפרוטוקול כולל סימון של גנומים ויראליים באמצעות נוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה של אלקין, ביוטינילציה באמצעות תגובת קליק, וקישור לחרוזי מגנט מצופים בסטראפטווידין. לאחר שטיפה ואלוציה תרמית, הקומפלקסים המטוהרים נאספים, עוברים הקפאה מהירה ומאוחסנים לצורך...

בידוד חלבונים מקומפלקסים של DNA ויראלי-חלבון

TruTip הוא טכנולוגית מיצוי חומצות גרעין פשוטה לפי מטריצה ​​נקבובית, מונוליטי מחייבת מוכנסת לתוך קצה פיפטה. כתוצאה מכך, את תבנית הכנת המדגם תואמת למכשירי טיפול הנזילים ביותר, וניתן להשתמש בו למדיום רבים ליישומים קליניים תפוקה גבוהה וסוגי מדגם.

הפקת תפוקה גבוהה, אוטומטית של DNA ו-RNA מדגימות קליניות באמצעות הטכנולוגיה TruTip על רובוטים טיפול נוזל נפוצים

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

אנו מתארים כאן שיטה להפקת DNA פשוטה ומהירה מבוססי נייר של HIV proviral דנ"א שלם דם זוהה על ידי PCR כמותי. פרוטוקול זה יכול להתארך לשימוש באיתור סמנים גנטיים אחרים או בשיטות הגברה חלופיות.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

המטרה של פרוטוקול זה היא במיוחד לתייג באופן סלקטיבי לבודד את ה-DNA הנגיפי של תאים נגועים על האפיון של גנום ויראלי הקשורים חלבונים.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

כאן אנו מציגים גישה חדשה לזיהוי וירוסים עם כפול-גדיל DNA הגנום. אנו משתמשים בשיטות הרגילות כדי לחלץ DNA ו- RNA עלים נגועים ולבצע רצף הדור הבא. כלים Bioinformatic להרכיב רצפים לתוך contigs, לזהות contigs המייצג את הגנום של וירוס והקצה הגנום לקבוצות בטקסונומיה.

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

מתואר כאן פרוטוקול מיצוי DNA באמצעות חרוזים מגנטיים כדי לייצר עקירות DNA באיכות גבוהה יתושים. עקירות אלה מתאימות לגישת רצף של הדור הבא במורד הזרם.

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

מוצג כאן פרוטוקול להכנה וכיול חיץ של תמציות תאים מזני נוקאאוט אקסונוקלאז V של Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD ו- ΔrecB). זוהי גישה מהירה, קלה וישירה לביטוי במערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים באמצעות תבניות דנ"א ליניאריות.

סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות DNA ליניאריות

פרוטוקול קצר מכתים חלבון עם Coomassie מבריק כחול (CBB) G-250 ב ג'לים polyacrylamide מתואר ללא שימוש בממיסים אורגניים או חומצה אצטית כמו הנהלים מכתים קלאסית עם CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

למד שיטה לבידוד חומצות גרעין וחלבונים ללא חשמל באמצעות ספיחה בפיפטה. שיטה זו מאפשרת בידוד PCR וחלבונים אימונוריאקטיביים בחוץ.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

גלה סרטונים נוספים