ניתוח ספציפי של תא ארבידופסיס עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אוכלוסייה של פרוטופלסטים ספציפיים לסוג התא מעלה. זה מושג על ידי גידול ראשוני של צמחים המבטאים GFP בסוגי תאים ספציפיים בעלה. השלב השני הוא קצירת עלים ויצירת פרוטופלסטים באמצעות עיכול אנזימטי.

לאחר מכן, הפרוטופלסטים מסוננים וממוינים באמצעות מיון תאים או עובדות המופעלות על ידי פלואורסצנטיות. השלב האחרון הוא לאשר את דיוק המיון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפרוטופלסטים הממוינים לניתוח ביטוי גנים ספציפי לסוג התא, ניתוח פרוטאומי או פרופיל מטבולי.

מיון תאים מופעל פלואורסצנטי שימש בעבר בהצלחה לשורשים, אך הוא משמש לבידוד תאי עלים. תויג עם GFP לפני שיטה זו הוגבל עקב ההפרעה מהפלואורסצנטיות של כלורופיל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית באותה מידה, אך הכנת דגימה זהירה חיונית למזעור השינויים הפיזיולוגיים הנרחבים שיכולים להתרחש במהלך מיון התאים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם לא יהיו מודעים כיצד להגדיר את סדרן התאים או כיצד לאשר מיון מדויק. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של מערכות הצמח. הבעיה בזיהוי רשתות ויסות גנים באיברים רב-תאיים מורכבים כמו עלה, היא שסוגי תאים שונים מבטאים קבוצות שונות של גנים.

מידע גנטי זה הולך לאיבוד בניתוח הקטיף של עלה שלם המדגים את ההליך. לצידי יהיו אליסון אס וסנג'יב קומה, המספקים תמיכה טכנית לעבודה זו במעבדה שלנו. ראשית, מלאו צלחת פטרי עגולה ב-9 סנטימטרים ב-20 מיליליטר של תמיסה A המכילה אנזימי ציפוי פרוטו ומעכבי שעתוק ו-RNA.

לאחר מכן קצרו את חומר העלים הרצוי לדגימות המכילות יותר מעלה בודד כמו הדגימה המוצגת כאן. מסדרים את העלים בערימה של עד 15 עלים. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את העלים לרצועות ברוחב מילימטר אחד.

העבירו מיד את רצועות העלים לצלחת הפטרי בעזרת פינצטה שטוחה, הפרידו בעדינות את הרצועות ולאחר מכן הסתננו לדגימות פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על שייקר מסלולי המוגדר ל-90 סל"ד בטמפרטורת החדר ודגימות טיח פרוטו למשך שלוש עד ארבע שעות. במהלך הדגירה השתמשו בפינצטה כדי להפריד את רצועות העלים זו מזו במרווחים של חצי שעה.

לאחר העיכול, סנן בעדינות את תמיסת הפרוטופלסטים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לצינור של 50 מיליליטר. כדי להסיר את רצועות העלים, הרצועות יישמרו. הפרוטופלסטים יסוננו.

כעת השתמש בארבעה מיליליטר של תמיסה A כדי לשטוף בעדינות את רצועות העלים ולאסוף את הכביסה בצינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן העבירו את מתלי הפרוטופלסטים לצינורות תחתונים עגולים וצנטריפוגה את הפרוטופלסטים למשך חמש דקות בטמפרטורה של פי 300 G וטמפרטורת החדר. היזהר לא להפריע לגלולה, שאב בעדינות כמה שיותר מהנטנט שוכב, ואז שטוף את הפרוטופלסטים בחמישה מיליליטר תמיסה A באותם תנאי צנטריפוגה.

לבסוף, לאחר הסרת ה-natant שוכב, השתמש בקצה P 1000 חתוך כדי להשעות מחדש את ה-PROTOPLASTS בנפח מתאים של תמיסה A למיון מיד לפני המיון. השתמש בקצה P 1000 לא חתוך כדי לפרק את כל הגושים בתמיסת Protoplasts. לנתק עוד יותר את התאים על ידי סינון הפרוטופלסטים לתוך צינור מקור דרך מסנן פילון של 50 מיקרון.

לאחר מכן יש לדלל את תמיסת התא לפי הצורך כדי למנוע סתימת פיית מקור התאים. לאחר קביעת תנאי מקור התאים האופטימליים, זהה את ה-Proto plus החיובי של GFP עם לייזר ארגון 488 ננומטר בתוספת הפלט ממסנן המעבר 580 30 פס לעומת מסנן 530 40 פס. שימו לב שהפרוטופלסטים החיוביים של GFP יופיעו באוכלוסייה הגבוהה 530 ו-580 הנמוכה.

עם הפרוטופלסטים שאינם GFP באוכלוסיית 530 הנמוכה, 580 הנמוך, הפרוטופלסטים המתים והפסולת מופיעים באוכלוסיית 580 הגבוהה להדמיה של הפרוטופלסטים הממוינים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מיין את הפרוטופלסטים ישירות לשמונה כרכים לפחות של תמיסה A לאחר מיון תרכיז, ניתן למיין את הפרוטופלסטים על ידי פרוטופלסטים צנטריפוגה לשמונה כרכים של תמיסה A ולאסוף אותם להדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את ההעשרה. תמונה ראשונה זו מציגה דוגמה להעשרה של קו התאים TP 382, המבטא GFP בתאי השמירה. דוגמאות לתשואות המתקבלות בשיטה זו לפני ואחרי ההגברה מסוכמות בטבלה זו.

הכמויות המתקבלות בין 500 פיקוגרם ל-50 ננוגרם מספיקות להגברה על ידי מערכת PICO WTA וניתוח לאחר מכן על ידי PCR כמותי, ריצוף מהדור הבא או מיקרו-מערך. סדרת התמונות הבאה מציגה קווי תאים שונים של פרוטופלסטים מבודדים וממוינים בשיטה שתוארה זה עתה. הפרוטופלסטים הראשונים הללו נגזרו מ-KC 2 74, משאיר חתך רוחבי של KC 2 74.

עלה מראה שה-GFP מתבטא בכלי הדם. פרוטופלסטים אלה בודדו מעלי KC 4 64 וחתך רוחבי של עלה KC 4 64 מראה שביטוי GFP נמצא באפידרמיס A dal. לבסוף, פרוטופלסטים אלה נגזרו מ-TP 3 82 דפים ב-TP 3 82 דפים.

ה-GFP מתבטא בתאי השמירה כאן. מוצגים תרשימי נקודות קליטת פקס טיפוסיים הממחישים את הפלט מ-5 80 30 ננומטר לעומת מסנני מעבר פס 5 30 40 ננומטר. שער המיון המוצג הוא אלה המשמשים בדרך כלל במהלך המיון.

חלקת עצירה ראשונה זו של פרוטופלסטים שמקורם בפחם ארבעה עלים מטויחים בהיעדר מעכבים מציגה אוכלוסייה אחת נמוכה של 530, 580 נמוכה. בעוד שתרשים נקודות זה מפחם מסוג בר פרוטופלסטים שמקורם בארבעה עלים מטויחים בנוכחות מעכבים מדגים את השינוי בפלואורסצנציה 580 המתרחש עקב הלחץ והצביעה הנגרמים על ידי המעכבים. חלקות נקודות אלה הן של פרוטופלסטים שמקורם בעלים מקווי KC 7 4, KC 4 64 ו-TP 3 82 בהתאמה.

דגימות אלה היו גם מטויחות בנוכחות מעכבים המראים שה-GFP מוכל באוכלוסיות הגבוהות של 530 580 נמוכות. עבור נציג זה, התקבלו תחילה דגימות ניסוי PCR כמותיות עבור כל סוג שבר. לאחר מכן הדגימות הוגברו באמצעות מערכת OVETATION PICO WTA ו-PCR כמותי.

בוצע שימוש בפריימרים ספציפיים ל-GFP. הערכים המוצגים הם הגבוהים ביותר באדום והנמוכים ביותר בממוצע ירוק או ערכים בודדים המשתמשים באקטין 2 כגן ייחוס מסומנים על ידי הפסים הצהובים האופקיים. התוצאות הן אימות מחדש של ההערכות האופטיות של תכולת תאי ה-GFP בשברים הממוינים.

האוכלוסייה הגבוהה של 530 580 נמוכה הציגה את הרמות הגבוהות ביותר הניתנות למדידה של ביטוי GFP. בעוד שאוכלוסיית 530 הגבוהה 580 הגבוהה הציגה ביטוי GFP נמוך פי 1000, האוכלוסיות הנמוכות 530, 580 הנמוכות ו-530 הגבוהות 580 הראו רמות נמוכות של ביטוי GFP שהיו דומות לאלו של אוכלוסיות הביקורת של עלה שלם ואוכלוסיות פרוטופלסטים לא ממוינות לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבע עד חמש שעות מצמח לאוכלוסיית תאים ממוינת אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה חשוב לזכור לעקוב כל הזמן אחר סדרן התאים ולכייל אותו מחדש במידת הצורך על מנת לשמור על דיוק המיון.

מצאתי את ההליך הזה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ניתוח מיקרו-קרניים על מנת להשוות ולהבדיל בין רמות ביטוי גנים בסוגי תאים שונים. כעת, לאחר שטכניקה זו פותחה, אנו מנתחים את ביטוי הגנים בסוגי תאי עלים ספציפיים בשלבי התפתחות שונים, ונשווה זאת לנתונים מהעלה השלם שנוצר בפרויקט האגרונומיה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד סוגי עלים של תאים בודדים באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות.