ניתוח ספציפי של תא ארבידופסיס עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי
4 באוקטובר 2012
שיטה להפקה ארבידופסיס Protoplasts עלים התואמים את מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS), המאפשר ללימודים של אוכלוסיות תאים ספציפיות. שיטה זו תואמת לכל ארבידופסיס קו שמבטא GFP בתת קבוצה של תאים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אוכלוסייה של פרוטופלסטים ספציפיים לסוג תא מסוים מעלה. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול צמחים המבטאים GFP בסוגי תאים ספציפיים בעלה. השלב השני הוא קצירת עלים ויצירת פרוטופלסטים באמצעות עיכול אנזימטי.
בשלב הבא, הפרוטופלסטים מסוננים וממוינים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting) או FACS. השלב הסופי הוא אישור דיוק המיון באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפרוטופלסטים הממוינים לניתוח ביטוי גנים ספציפי לסוג התא, לניתוח פרוטאומי או לאפיון מטבולי.
מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) שימש בעבר בהצלחה עבור שורשים, אך כאן הוא משמש לבידוד תאי עלה. סימון ב-GFP לפני ביצוע שיטה זו היה מוגבל בשל הפרעות מפלואורסצנציית כלורופיל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת דגימה מהירה אך קפדנית חיונית לצמצום השינויים הפיזיולוגיים הנרחבים שעלולים להתרחש במהלך מיון התאים.
בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, כיוון שלא יהיו מודעים לאופן הגדרת מיון התאים או לאופן אישור דיוק המיון. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה המערכתית של צמחים. הבעיה בזיהוי רשתות ויסות גנים באיברים רב-תאיים מורכבים, כגון עלה, היא שסוגים שונים של תאים מבטאים קבוצות שונות של גנים.
מידע גנטי זה אובד בניתוח הקצירה של עלה שלם המדגים את הפרוצדורה. לצידי יהיו Ellison As ו-Sanjeev Kuma, המספקים תמיכה טכנית לעבודה זו במעבדה שלנו. ראשית, מלאו צלחת פטרי עגולה בקוטר תשעה סנטימטרים ב-20 milliliters של תמיסה A המכילה אנזימי proto plating ומעכבים של transcriptional ו-RNAs.
לאחר מכן, קצרו את חומר העלה הרצוי עבור דגימות המכילות יותר מעלה בודד, כפי שמוצג בדגימה כאן. סדרו את העלים בערימה של עד 15 עלים. לאחר מכן, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את העלים לרצועות ברוחב של 1 millimeter.
העבירו מיד את רצועות העלה אל צלחת הפטרי באמצעות פינצטה שטוחה, הפרידו בעדינות את הרצועות ולאחר מכן בצעו חלחול בוואקום לדגימות פעמיים, למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על מנער אורביטלי המכוון ל-90 RPM בטמפרטורת החדר והשריו את דגימות הפרוטופלסט למשך שלוש עד ארבע שעות. במהלך הדגירה, השתמשו בפינצטה כדי להפריד בין רצועות העלה במרווחים של חצי שעה.
לאחר העיכול, סננו בעדינות את תמיסת הפרוטופלסטים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך מבחנה של 50 מיליליטר. רצועות העלה ייבלעו במסננת ויוסרו, בעוד הפרוטופלסטים יעברו דרכה.
כעת השתמש בארבעה milliliters של תמיסה A כדי לשטוף בעדינות את רצועות העלה, תוך איסוף מי השטיפה למבחנה בנפח 50 milliliters. לאחר מכן, העבר את תרחיף הפרוטופלסטים למבחנות בעלות תחתית עגולה וסבב את הפרוטופלסטים בצנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות של 300 times G ובטמפרטורת החדר. תוך זהירות לא להפריע למשקע, שאב בעדינות כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן שטוף את הפרוטופלסטים עם חמישה milliliters של תמיסה A תחת אותם תנאי צנטריפוגה.
לבסוף, לאחר הסרת השכבה העליונה הצפה, השתמשו בטיפ P 1000 קטום כדי לתלות מחדש את ה-PROTOPLASTS בנפח מתאים של תמיסה A לצורך מיון, רגע לפני תחילת המיון. השתמשו בטיפ P 1000 לא קטום כדי לפרק גושים בתמיסת ה-Protoplasts.בצעו דיסוציאציה נוספת של התאים על ידי סינון ה-protoplasts אל תוך מבחנת איסוף דרך מסנן fillon של 50 micron.
לאחר מכן, דללו את תמיסת התאים כנדרש כדי למנוע סתימה של פיית שאיבת התאים. לאחר קביעת תנאי שאיבת התאים האופטימליים, זהו את ה-Proto plus החיוביים ל-GFP באמצעות לייזר Argonne של 488 ננומטר, תוך השוואת הפלט ממסנן Band pass 580/30 אל מול מסנן Band pass 530/40. שימו לב כי הפרוטופלסטים החיוביים ל-GFP יופיעו באוכלוסייה בעלת ערכים גבוהים ב-530 ונמוכים ב-580.
במדגם של פרוטופלסטים שאינם מביעים GFP באוכלוסייה של 530 נמוך ו-580 נמוך, פרוטופלסטים מתים, גוססים ושאריות מופיעים באוכלוסייה של 580 גבוה. לצורך ויזואליזציה של הפרוטופלסטים המומיפים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, יש למיין את הפרוטופלסטים ישירות לתוך לפחות שמונה נפחים של תמיסה A; לאחר המיון, רכז את הפרוטופלסטים באמצעות צנטריפוגציה. ניתן למיין את הפרוטופלסטים לשמונה נפחים של תמיסה A ולאסוף אותם לצורך ויזואליזציה במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לאמת את ההעשרה. תמונה ראשונה זו מציגה דוגמה להעשרה של קו התאים TP 382, המבטא GFP בתאי השמירה. דוגמאות לבציר שהושג בשיטה זו, הן לפני והן אחרי הגברה, מסוכמות בטבלה זו.
כמויות הנעות בין 500 picograms ל-50 nanograms מספיקות להגברה באמצעות מערכת ovation PICO WTA ולניתוח עוקב באמצעות quantitative PCR, רצף דור הבא (next generation sequencing) או מיקרו-מערך (microarray). סדרת התמונות הבאה מציגה קווי תאי פרוטופלסטים שונים שבודדו ומוינו בשיטה שתוארה זה עתה. הפרוטופלסטים הראשונים הללו הופקו מ-KC 2 74, עלים, חתך רוחבי של KC 2 74.
העלה מראה כי ה-GFP מתבטא בכלי ההובלה. פרוטופלסטים אלו בודדו מעלי KC 4 64, וחתך רוחב של עלה KC 4 64 מראה כי ביטוי של GFP נמצא באפידרמיס של A dal. לבסוף, פרוטופלסטים אלו הופקו מעלי TP 3 82 בעלי TP 3 82.
ה-GFP מתבטא כאן בתאי השמירה. מוצגים תרשימי פיזור של רכישת נתונים טיפוסית הממחישים את הפלט ממסנני פס-מעבר של 530/30 ננומטר לעומת 580/30 ננומטר. שערי המיון המוצגים הם אלו המשמשים בדרך כלל במהלך המיון.
תרשים פיזור (dot plot) ראשון של פרוטופלסטים שהופקו מעלי col4 אשר עברו פרוטופלסטציה בהיעדר מעכבים, מראה אוכלוסייה אחת עם רמה נמוכה של 530 ורמה נמוכה של 580. לעומת זאת, תרשים פיזור זה של פרוטופלסטים מסוג wild type שהופקו מעלי col4 ועברו פרוטופלסטציה בנוכחות מעכבים, מדגים את ההסחה בפלואורסצנציית ה-580 המתרחשת כתוצאה מהעקה והצביעה שנגרמו על ידי המעכבים. תרשימי פיזור אלו הם של פרוטופלסטים שהופקו מעלים של הקווים KC74, KC464 ו-TP382, בהתאמה.
דגימות אלו עוברו גם בנוכחות מעכבים, מה שהראה כי ה-GFP כלוא באוכלוסיות עם רמה גבוהה של 530 ונמוכה של 580. עבור ניסוי qPCR מייצג זה, הושגו תחילה דגימות עבור כל סוג של פракציה. לאחר מכן, הדגימות הועשרו באמצעות מערכת ovation PICO WTA ו-qPCR.
בוצע שימוש בפרימרים ספציפיים ל-GFP. הערכים המוצגים הם הגבוהים ביותר באדום והנמוכים ביותר בירוק; ערכי ממוצע או ערכים בודדים תוך שימוש ב-actin two כגן ייחוס מסומנים על ידי הפסים הצהובים האופקיים. התוצאות מהוות אימות מחדש של ההערכות האופטיות של תכולת ה-GFP בתאים בפרקציות הממוינות.
האוכלוסייה עם רמה גבוהה של 530 ונמוכה של 580 הראתה את רמות ביטוי ה-GFP הגבוהות ביותר שניתן למדוד. בעוד שהאוכלוסייה עם רמה גבוהה של 530 וגבוהה של 580 הראתה ביטוי GFP נמוך פי 1000 בערך, האוכלוסיות עם רמה נמוכה של 530 ונמוכה של 580, ורמה נמוכה של 530 וגבוהה של 580, הראו רמות נמוכות של ביטוי GFP שהיו דומות לאלו של ביקורת העלה השלם ואוכלוסיות הפרוטופלסטים שלא עברו מיון. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך ארבע עד חמש שעות מהצמח ועד לאוכלוסיית התאים הממוינת, אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לנטר את ממיין התאים באופן רציף ולכייל אותו מחדש במידת הצורך כדי לשמור על דיוק המיון.
פרוצדורה זו נמצאה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אנליזת microray, על מנת להשוות ולהבדיל בין רמות ביטוי גנים בסוגי תאים שונים. כעת, לאחר שטכניקה זו פותחה, אנו מנתחים ביטוי גנים בסוגי תאי עלה ספציפיים בשלבים התפתחותיים שונים, ונשווה זאת לנתונים מהעלה השלם שהופקו בפרויקט האגרונומיקה.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד סוגי תאים בודדים מעלים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לבידוד פרוטופלסטים מעלי Arabidopsis התואמת למיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS). הטכניקה מאפשרת לחקור אוכלוסיות תאים ספציפיות המבטאות GFP, ובכך מקלה על ניתוחים שונים בביולוגיה של מערכות צמחים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של הצמח
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- בידוד פרוטופלסטים הוא קריטי לחקר ביטוי גנים בסוגי תאים ספציפיים.
- שיטות קודמות התמודדו עם אתגרים עקב הפרעות של כלורופיל במהלך גילוי פלואורסצנציה.
- FACS יושם בהצלחה על תאי שורש, אך לא באופן נרחב על תאי עלה.
- הבנת רשתות ויסות של גנים באיברים רב-תאיים כמו עלים היא מורכבת.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לבידוד פרוטופלסטים המבטאים GFP מעלים של Arabidopsis.
- מתן אפשרות לניתוח מפורט של ביטוי גנים ספציפי לסוגי תאים ואפיון מטבולי.
- מתן הדגמה ויזואלית של הפרוצדורה להבנה טובה יותר.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- קציר עלים מצמחי Arabidopsis המבטאים GFP.
- עיכול אנזימטי של רקמת עלים ליצירת פרוטופלסטים.
- סינון ומיון של פרוטופלסטים באמצעות FACS.
- אישור דיוק המיון באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של פרוטופלסטים מקווי Arabidopsis שונים.
- הוכחת העשרה של סוגי תאים ספציפיים המבטאים GFP.
- תנובת פרוטופלסטים המספיקה לניתוחים המשכיים כגון quantitative PCR.
- אישור ויזואלי של הפרוטופלסטים הממוינים באמצעות מיקרוסקופיה.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חסונה לחקר אוכלוסיות תאים ספציפיות ב-Arabidopsis.
- היא נותנת מענה למגבלות קודמות בבידוד פרוטופלסטים מעלים.
- טכניקה זו יכולה לקדם באופן משמעותי את המחקר בביולוגיה של מערכות צמחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח ספציפי לתאים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) בעלי Arabidopsis נותן מענה לאתגר של אותי ביטוי גנים מעורבבים ברקמות רב-תאיות מורכבות. שיטה זו מאפשרת ניתוח ברמת ביטחון גבוהה של רשתות רגולטוריות ספציפיות לסוגי תאים, ובכך תומכת בביולוגיה חזויה ומפחיתה סיכונים בהחלטות בשלבי הגילוי המוקדמים. הגישה משפרת את הרלוונטיות של הפורטפוליו על ידי כך שהיא מאפשרת פרופיל מולקולרי מדויק ברמת התא הבודד, דבר הקריטי לביולוגיה מערכתית תרגומית של צמחים ולגנומיקה השוואתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של רשתות ויסות גנים בסוגי תאי עלה נפרדים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות ספציפיות לתאים על ידי בידוד אוכלוסיות טהורות.
- משפר את רמת הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת הפרעות באות הנובעות מרקמות הטרוגניות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים במערכות מודל של צמחים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין אוכלוסיות פרוטופלסטים שעברו תיקוף לצורך בדיקות ביטוי גנים ובדיקות פרוטאומיקה בהמשך התהליך.
- מנstandardize אסטרטגיות מיון תאים וסינון (gating) לקבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- מאפשר תהליכי עבודה ניתנים להרחבה לסריקה בשפיות גבוהה של תגובות ספציפיות לסוג התא.
- תומך בהערכה מהימנה של הפרעות גנטיות או כימיות באוכלוסיות תאים מוגדרות.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- מתאים פרופילים מולקולריים ספציפיים לסוג תא עם סמנים ביולוגיים של התפתחות ותגובה למעיקות.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני בביולוגיה של מערכות צמחים.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים של גנים או מסלולים מועמדים על בסיס נתונים ספציפיים לתא.
- תומך במחקרים השוואתיים בין שלבי התפתחות ותנאים סביבתיים שונים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו, המבוססת על FACS, משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי מטרות מונחה-היפותזה ועד לאישור פרה-קליני במודלים של צמחים.
- ביולוגיה של גילוי: מנתחת ביטוי גנים ומסלולים רגולטוריים ברזולוציה של תא בודד, ובכך מבהירה מנגנונים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת תוצרי מיון תאים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח מבחנים (assays) חסונים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ברמת דיוק גבוהה להשוואת ביטוי גנים בין סוגי תאים ותנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין חתימות מולקולריות ספציפיות לתא לבין פנוטיפים של התפתחות ומעקה (stress).
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור ניתוח ספציפי לסוגי תאים על פני קווי צמחים מגוונים והקשרים ניסויים שונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומצמצם עמימות מכניסטית במחקרי תפקוד גנים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בידוד ומיון תאים עבור זרימות עבודה הניתנות לשחזור וניתנות להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך התקדמות (go/no-go) והקצאת משאבים יעילה מבחינה הונית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומסלולים לפיתוח נוסף.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהכנת פרוטופלסטים מצמחים ובתפעול מכשירי FACS.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ולתשתית של qPCR או רצף גנומי.
- נדרש תקינון קפדני של שערי המיון (sorting gates) ופרוטוקולי תיקוף בין צוותים שונים.
- עשוי לדרוש התאמה עבור קווי צמחים שונים או סמנים ספציפיים לסוגי תאים.
- מהירות ודיוק בהכנת הדגימות הם קריטיים כדי למזער שינויים פיזיולוגיים במהלך המיון.
