Name: ניתוח ספציפי של תא ארבידופסיס עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: למד שיטה לבידוד פרוטופלסטים מסוגי תאים ספציפיים בעלי Arabidopsis באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים ופרופילים מטבוליים בתאים מסומנים ב-GFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

לעבוד ביוקנן-ולאסטון המעבדה על תאים מסוג מסוים והתפתחותי פרופיל במה נתמכת על ידי אגרון-OMICS הפרויקט (מענק # LSHG-CT-2006-037704) במסגרת Progamme 6 שנים לנציבות האירופיות. העבודה במעבדת גיפורד באפיון ספציפי של תאים מהסוג נתמכת על ידי BBSRC ניו חוקר מענק (BB/H019502/1). את KC274 וKC464 קווי ארבידופסיס התקבלו מAAR ווב (אוניברסיטת קיימברידג&#39;).

1. Protoplast הדור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומרי קציר עלים ולחתוך לרצועות ברוחב 1 מ&quot;מ (איור 1) עם סכין גילוח. לדגימות המכילות יותר מעלים עד 15 עלים בודדים יכולות להיערם בקלות לפני החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להעביר רצועות עלים לתוך צלחת פטרי עגולה 9 סנטימטר המכיל 20 מיליליטר פתרון (400 המ&quot;מ מניטול, מימה 20 מ&quot;מ MES, 20 המ&quot;מ KCl, 10 mM CaCl 2, 2 המ&quot;מ MgCl 2, 0.1% BSA ו2.5 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, pH 5.7) כולל אנזימי protoplasting (צלולוזת R-10, 0.6% התאיים RS ו 0.4% macerozyme R-10 1.2%) וRNase ומעכבי תעתיק (1 × ProtectRNA ו10 מיקרוגרם / המ&quot;ל actinomycin D); עדינות להפריד את העלים ורצועות ואקום לחדור ל2 × 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי מקום בהקפה ייקרה להגדיר עד 90 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר וprotoplast עבור שעות 3-4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה את רצועות עלים צריכות להיות מופרדות אחד מהשני, על ידי שימוש בסט של פינצטה השטוחה, במחצית מרווחים לפי השעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 70 מיקרומטר תא מסננת (הפישר סיינטיפיק) בצינור מ&quot;ל 50 ועדינות לסנן פתרון protoplasting דרך. הפעולה זו תסיר את רצועות עלים, שתישארנה בידי המסננת ובמקביל לאפשר את protoplasts לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את רצועות עלים עם 4 פתרון מ&quot;ל ועדינות מסנן דרך אותה המסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבירו את protoplasts לתוך צינורות תחתונים עגולים וחובצה את פתרון protoplast ב 300 XG למשך 5 דקות לגלולה את protoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשאוב אותו במידה של supernatant ככל האפשר מבלי להפריע לprotoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את protoplasts עם פתרון 5 מ&quot;ל וצנטריפוגה XG ב 300 למשך 5 דקות. הסרת supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את protoplasts בנפח מתאים לפתרון, באמצעות פיפטה פסטר או טיפ P1000 חתך. </li></ol> 2. FACS של Protoplasts עלים </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני המיון, resuspend את protoplasts באמצעות (ללא חתך) P1000 קצה להימנע protoplasts clumping יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת protoplasts לצינור מיון 50 מיקרומטר filcon מסנן (BD Biosciences) ולדלל מתאימים כדי למנוע סתימת הנחיר של סדרן התא. את protoplasts מסודר באמצעות פיית מיקרומטר 100 בלחץ של 20 אטמוספרות (נדן) ו21-21.5 psi (מדגם), בתדר של 39.2 קילוהרץ ושיעור אירועים של &lt;4000 (הגדרות אלה הן אופטימליות על סדרן תא זרם BD . אופטימיזציה (BD Biosciences) על מכונות מיון תא אחרות ייתכן שתצטרך התאמות להגדרות אלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> protoplasts החיובי GFP מזוהה באמצעות 488 ננומטר ארגון ליזר והתוויית הפלט מ580 / 30 bandpass המסנן (כתום) לעומת מסנן bandpass 530/40 (ירוק). protoplasts החיובי GFP יהיה ב580 אוכלוסיית 530/low הגבוהה, עם protoplasts הלא GFP ב580 אוכלוסייה 530 הנמוכות / נמוכה ומת / protoplasts הגוסס ופסולת בגובה 580 popuרח (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת מיון protoplasts שממנו יהיה חילוץ רנ&quot;א, protoplasts יש למיין ישירות לתוך לפחות 4 כרכים של חיץ תמוגה מכיל סוכן צמצום (למשל β-mercaptoethanol). בנוסף, בפעם הסוג של מדגם יחיד צריכה להיות מוגבלת ל20-30 דקות, ועד למקסימום של 2-3 דגימות מעובד בכל זמן נתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה של protoplasts הממוין, את protoplasts יש למיין ישירות לתוך לפחות 8 כרכים של פתרון ושנאסף לאחר מכן על ידי צנטריפוגה לרכז את protoplasts. </li></ol></li></ol> 3. נציג תוצאות פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת protoplasts מעלי ארבידופסיס, המשמשים למיון תא הופעל פלואורסצנטי (איור 1). דור Protoplast בנוכחות RNase ומעכבי תעתיק מונע f התאיםrom הרכבת תגובת תעתיק. זה עושה לי תוצאה מהוליד רב protoplasts המת והגוסס, אשר יש רמה משמעותית של autofluorescence. כשממיין את protoplasts הוכן בשיטה זו לכן זה מאוד נפוץ לראות כמה אוכלוסיות שונות בגרפים של 580 ננומטר לעומת קרינת ננומטר 530 שמש למיון. דוגמאות לכך, יחד עם שערי המיון השתמשו בפרוטוקול זה מוצגות באיור 3. Protoplasts ניתן למיין ל8 כרכים של פתרון ונאסף להדמיה כדי לאמת את ההעשרה. האיור 2G מראה דוגמה לכך באמצעות קו TP382, המבטא GFP בתאי השמירה. דוגמאות לתשואות שהשיגו בשיטה זו, היא לפני והן אחרי ההגברה, מוצגים בטבלת 1. הסכומים שהתקבלו מספיקים להגברת שימוש במערכת Ovation פיק WTA (500 pg-50 ng) ולכן זה<html> ניתוח ubsequent ידי אחד qPCR (איור 4), רצף הדור הבא או microarray. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" /> איור 1. עבודה כוללת לניסוי. 1) הקציר מותיר ריבית מלהביע GFP קו ארבידופסיס. 2) לחתוך במהירות לתוך ~ 1 רצועות רחבות מ&quot;מ ולהעביר באופן מיידי את אלה לפתרון והוואקום protoplasting לחדור. 3) דגירה עבור שעות 3-4. 4) בעדינות פתרון תסנין protoplast דרך מסנן מיקרומטר 70, להעביר לעגל צינורות תחתונים וprotoplasts גלולה ידי צנטריפוגה. 5) מייד לפני המיון, protoplasts resuspend והעברה לצינור מיון דרך 50 מיקרומטר מסנן. 6) protoplasts קיימא שלילי GFP מיין GFP חיובי ו. 7) Protoplasts כעת ניתן לנתח אם באופן חזותי או באמצעות טכניקות כגון qPCR, רצף הדור הבא או microarray. together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig2.jpg" /> איור 2. את KC464, KC274 וTP382 הקווים השתמשו במחקר זה. א) סעיף רוחבי של KC464 עלה מראה ביטוי של GFP באפידרמיס adaxial. B) Protoplasts נגזר מKC464 עלים. ג) סעיף רוחבי של KC274 עלה מראה ביטוי של GFP בכלי הדם. ד) Protoplasts נגזר מKC274 עלים. E) עלה TP382 מראה ביטוי של GFP בתאי השמירה. F) Protoplasts נגזר מTP382 עלים. ז) דוגמה להעשרה הושגה על ידי FACS של GFP להביע תאי שמירה ברקע המורכב של תאי עלים, מראה GFP המכיל protoplasts מ580 אוכלוסיית 530/low הגבוהה של protoplasts נגזר מTP382 עלים. AF: תמונות confocal מיקרוסקופ; G: תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ברי קנה מידה בתוך תמונות הם 50 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" /><html> איור 3. FACS חלקות נקודת רכישה אופייניות של הפלט מ580 / 30 ננומטר (כתום) לעומת ננומטר 530/40 (ירוק) מסנני bandpass (סדרן תא זרם BD). את שערי המיון המוצג הם אלה משמשות בדרך כלל במיון. א) עלילת דוט של Col-4 protoplasts עלים נגזרים, protoplasted בהיעדר מעכבים, מראה 580 אוכלוסיית 530/low יחידה ונמוכה. B) עלילת דוט מWT protoplasts Col-4 עלים נגזר, protoplasted בנוכחות מעכבים, מראה שינוי ב580 פלואורסצנטי בשל לחץ וצביעה על ידי המעכבים. הספירה) דוט חלקות protoplasts נגזר עלים מKC74, KC464 וTP382 קווים, בהתאמה, protoplasted בנוכחות מעכבים, מראים GFP המכיל אוכלוסיות ב530/low הגבוה 580 אוכלוסיות. את האחוזים של האירועים בGFP (הגבוה 530/low 580) אוכלוסיות נתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> e_content &quot;fo: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" /> איור 4. ביטוי של GFP בשברי האוכלוסייה המגודרים היציגים כפי שמוצג באיור 3. שתיים ביולוגיים משכפל התקבלו לכל סוג חלקיק, מוגבר באמצעות Ovation פיק WTA המערכת וqPCR באמצעות פריימרים ספציפיים GFP (טבלה 2) אז בוצע. ערכים המוצגים הם (אדום) את הערכים הגבוהים ביותר, הנמוכים ביותר (ירוק) וממוצע יחסית. 580 האוכלוסייה הגבוהה הייתה במקרה זה נחצה לשניים, נמוך 530/low 580 ו530/low גבוה 580, שללשכפל ביולוגי יחיד היה בשימוש, כך שרק הערך היחיד שהיא מוצגת. Act2 (At3g18780) שמש כתקן עבור כל המדגמים. עלים: כל עלה. לא ממוין: protoplasts לא ממוין. GFP1: 530/low גבוה 580 וRest1: 530/low הנמוך 580, GFP2: 530/high הגבוה 580 וRest2: 530/high הנמוך 580, כפי שמתואר באיור 3 והוספה. התוצאות הן אימות of הערכות אופטיות של תוכן תא ה-GFP בשברים הממוינים (למשל 2G איור). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מדגם </td><td> מספר עלים </td><td> מספר תאים </td><td> RNA תשואה (נ&quot;ג) </td><td> RNA תשואה (מוגבר; ng) </td></tr><tr><td> עלה שלם B עלה השלם </td><td> 1 1 </td><td> - - </td><td> 8001 10525 </td><td> 4623 *** 4572 *** </td></tr><tr><td> protoplasts לא ממוין B protoplasts Unsorted </td><td> 5 5 </td><td> - - </td><td> 2433 2625 </td><td> 1152 *** 3321 *** </td></tr><tr><td> GFP1 Rest1 </td><td> 15 </td><td> 6039 (0.39% *) 55389 (6.40% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 861 489 </td></tr><tr><td> GFP1 B Rest1 B </td><td> 15 </td><td> 10783 (0.63% *) 57040 (7.49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 537 420 </td></tr><tr><td> GFP2 Rest2 </td><td> 15 </td><td> 18337 (1.49% *) 62405 (73.49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 360 411 </td></tr></tbody></table> לוח 1. דוגמאות שנאספו ונותחו בעזרת FACS עם qPCR כדי לקבוע איזה חלק הכיל protoplasts החי GFP להביע-. כמו כן, נכללת בטבלה זו היא מוחלטת תשואת RNA בng לפני ואחרי ההגברה עם Ovation פיק WTA המערכת (NuGEN). GFP1, GFP2, Rest1 וRest2 שברים כמוצגים בעלון באיור 4. * אחוז מהתאים של טווח סוג התא הכולל ניתן בסוגריים ליד מספר התאים בשבריר. אחוזים אלה אינם קשורים לאחד את השני לכל דגימה כסוג FACS פועל לשברים &quot;לנוח&quot; נעצרו מוקדם יותר לשברי GFP עקב המספר הגדול בהרבה של תאי מנוחה שנאספו. ** 50 ng משמש כקלט להגברת תגובות, לפי הפרוטוקול של היצרן. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תחל </td><td> רצף </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.fw </td><td> GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.rv </td><td> TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT </td></tr><tr><td> ACT2.fw </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr><tr><td> ACT2.rv </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr></tbody></table> לוח 2. פריימרים qPCR.

<ol><li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves%3A+A+Critical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li>
<li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gene+Expression+Map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gene Expression Map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Tissue-+and+Organ-specific+Phytochrome+Responses+using+FACS-assisted+Cell-type+Specific+Expression+Profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. (39), e1925(2010).</li>
<li>Beal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+For+Gene+Expression+and+Chromatin+Profiling+of+Individual+Cell+Types+Within+a+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue.</a> Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li>
<li>Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> PNAS. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Root+Expression+Patterns+Revealed+in+a+High-Resolution+Spatiotemporal+Expression+Map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> PNAS. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+identity+mediates+the+response+of+Arabidopsis+roots+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.</a> Science. 320, 942-945 (2008).</li>
<li>Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
<li>Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li>
<li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li>
<li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it%27s+potential+as+a+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6(2008).</li>
<li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

כבר תארנו שיטה המאפשרת שימוש בצמחי ארבידופסיס מבטאים GFP את העלים לדור protoplast ומיון התא הבא באמצעות FACS. שיטה זו מניבה כמויות מספיקות של רנ&quot;א שישמש להגברה ולכן לאחר ניתוח על ידי אחד או qPCR microarray. השברים הממוינים מועשרים לתאי GFP המכיל, כפי שהוכיחו qPCR (איור 2). כדי להשיג תשואות גבוהות של protoplasts חיות זה הוא קריטי לעבודה במהירות במהלך השלבים הראשונים של התהליך, עד שרצועות העלים היו ואקום הסתנן עם פתרון protoplast מעכב המכיל. בנוסף, בעת יצירת רצועות עלי 1 מ&quot;מ זה מאוד חשוב לחתוך או לחתוך את העלים ולא &quot;צ&#39;ופ&quot; או לכתוש אותן, כפי שזה מוביל לפגיעה מוגזמת ובכך תשואת protoplast נמוכה יותר. הבדל קריטי בין השיטה המתוארת כאן וpublishe האחרשיטות d היא השימוש במעכבי RNase ומעכבי תעתיק. רוב השיטות שפותחו לשורשי ארבידופסיס, שממנו ניתן להפיק protoplasts בקלות רבה יותר. עם זאת, כשעובד עם עלים, למעט mesophyll, יש צורך להגדיל את זמן דור protoplast. לכן חשוב לכלול מעכבים אלה כדי להגן מפני שינויים בביטוי גנים כתוצאה מטיפול protoplast הדור עוצמה (מידע לא מוצג). עם זאת, נוכחותם של המעכבים מובילה לחוסר יכולת לפתח תגובת שעתוק, או על ידי החלפת גנים או לבטל, העשוי להפוך את protoplasts פגיע יותר כמו זה מוביל לאובדן הגמישות שבה כדי לאזן את הלחצים של protoplasting הליך. יש לנו להשתמש בשיטה המתוארת כאן בהצלחה עם מספר GFP-לבטא קווי ארבידופסיס. חשוב מכך, יש לנו להשתמש בשיטה זו עם קווי GFP להביע GFP באופן חזק בהגרעין, או הרבה יותר חלש באופן cytosolic non-localized/diffuse, כפי שקורה עם KC464 וKC274 קווים המשמשים כאן. שני הסוגים של קווים תואמים את השיטה ואת תשואת שברים מועשרים ברמה גבוהה של protoplasts GFP להביע-(איור 2 ו 3). השיטה יכולה להתאים בקלות לfluorophores האחר, אם כי יש לבחור fluorophore לניאון שהוא שונה באופן משמעותי מautofluorescence של תאים מתים / למות כדי לשמר את היכולת לבחור בתאים חיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> Cellulase R-10 </td><td> Melford </td><td> C8001 </td></tr><tr><td> Cellulase RS </td><td> Melford </td><td> C8003 </td></tr><tr><td> Macerozyme R-10 </td><td> Melford </td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> R7397 </td></tr><tr><td> Actinomycin D </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A1410 </td></tr><tr><td> מסננת תא 70 מיקרומטר </td><td> דיג </td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50 מיקרומטר filcon מסנני כוס מסוג </td><td> BD Biosciences </td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

לאחר תחילת primordium העלה, הצטברות ביומסה נשלטת בעיקר על ידי תרבות של תאים והתרחבות העלים 1. עם זאת, עלה ארבידופסיס הוא איבר מורכב מורכבים מסוגים רבים ושונים של תאים וכמה מבנים. במקביל, עלה הגידול מכיל תאים בשלבים שונים של פיתוח, עם תאים הרחוקים מהפטוטרת להיות הראשון לעצור את ההרחבה ולעבור הזדקנות 1. תאים שונים בתוך העלה, אפוא, חלוקה, מאריכים או מבדל; פעיל, לחוץ או מת; ו / או להגיב לגירויים בתת קבוצות של הסוג הסלולרי שלהם בכל זמן נתון. זה עושה את המחקר הגנומי של מאתגר עלה: למשל בעת ניתוח נתוני ביטוי מעלים שלמים, אותות מרשתות גנטיות הפועלות באזורים ברורים סלולריים תגובה או סוגי תאים יהיה מבולבל, וכתוצאה מפרופיל מדויק שנוצר. לכתובת זו, שלשיטות everal כבר תאר המאפשרות לימודים של ביטוי גני התא ספציפי. אלה כוללים microdissection ליזר לכידה (LCM) 2 או צמחים המבטאים GFP משמשים למיון לאחר פלואורסצנטי הופעל תא (FACS) 3,4, המערכת השלמה שתוארה לאחרונה למשקעים גרעיניים 5 ו immunoprecipitation של 6 polysomes הדור וprotoplast. FACS שמש בהצלחה במשך מספר מחקרים, כולל ההצגה שזהות התא והמרחק מקצה השורש הייתה השפעה משמעותית על פרופילי הביטוי של מספר רב של גנים 3,7. FACS של קווי GFP יש גם שמש כדי להדגים בקרת שעתוק תא ספציפי בתגובות חנקן שורש ופיתוח לרוחב שורש 8, מתח מלח הפצת אוקסין 9 בשורש 10 וליצור מפה של ביטוי גני meristem הקודקוד לירות ארבידופסיס 11. למרותFACS יש בעבר נהג למיין protoplasts נגזר העלה ארבידופסיס מבוסס על autofluorescence 12,13, עד כה השימוש בFACS על קווי ארבידופסיס מבטאים GFP בעלים כבר מאוד מוגבל 4. בפרוטוקול הבא אנו מתארים שיטה לקבלת protoplasts העלה ארבידופסיס התואמים FACS תוך מזעור ההשפעה של משטר דור protoplast. אנחנו מדגימים את השיטה באמצעות קו ארבידופסיס KC464, שמביע GFP באפידרמיס adaxial 14, KC274 הקו, אשר מביעים GFP ברקמת כלי הדם 14 וקו ארבידופסיס TP382, שמבטא GFP כפול לבנות צמוד לאות לוקליזציה גרעינית ב את תאי שמירה (מידע לא מוצג; איור 2). כרגע אנחנו משתמשים בשיטה זו כדי ללמוד גם ביטוי תא מסוג מסוים במהלך פיתוח ומתח, כמו גם אוכלוסיות תאים הטרוגניים בשלבים שונים של הזדקנות.

שיטה להפקה<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; Protoplasts עלים התואמים את מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS), המאפשר ללימודים של אוכלוסיות תאים ספציפיות. שיטה זו תואמת לכל<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; קו שמבטא GFP בתת קבוצה של תאים.

לאחר תחילת התפתחות הנבט של העלה (leaf primordium), הצטברות הביומסה נשלטת בעיקר על ידי התרבות והתרחבות תאים בעלים1. עם זאת, ה...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד אוכלוסייה של פרוטופלסטים ספציפיים לסוג תא מסוים מעלה. הדבר מושג תחילה על ידי גידול צמחים המבטאים GFP בסוגי תאים ספציפיים בעלה. השלב השני הוא קצירת עלים ויצירת פרוטופלסטים באמצעות עיכול אנזימטי.בשלב הבא, הפרוטופלסטים מסוננים וממוינים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting) או FACS. השלב האחרון הוא אישור דיוק המיון באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפרוטופלסטים הממוינים לניתוח ביטוי גנים ספציפי לסוג התא, ניתוח פרוטאומי או פרופיל מטבולי.מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (Fluorescent activated cell sorting) שימש בעבר בהצלחה עבור שורשים, אך כעת הוא משמש לבידוד תאי עלה. סימון באמצעות GFP לפני שיטה זו היה מוגבל בשל הפרעות מפלואורסצנציה של כלורופיל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת דגימות מהירה אך זהירה היא חיונית לצמצום שינויים פיזיולוגיים נרחבים שעלולים להתרחש במהלך מיון התאים.באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה מכיוון שלא יהיו מודעים לאופן הגדרת ממיין התאים או לאופן אישור דיוק המיון. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של מערכות הצמחים. הבעיה בזיהוי רשתות ויסות גנים באיברים רב-תאיים מורכבים, כגון עלה, היא שסוגי תאים שונים מבטאים קבוצות שונות של גנים.מידע גנטי זה הולך לאיבוד בניתוח איסוף של עלה שלם המדגים את הפרוצדורה. לצדי יהיו Ellison As ו-Sanjeev Kuma, המספקים תמיכה טכנית לעבודה זו במעבדה שלנו. ראשית, מלאו צלחת פטרי עגולה בקוטר תשעה סנטימטרים ב-20 milliliters של תמיסה A המכילה אנזימי proto plating ומעכבי transcriptional ו-RNAs.לאחר מכן, אספו את חומר העלה הרצוי עבור דגימות המכילות יותר מעלה אחת, בדומה לדגימה המוצגת כאן. סדרו את העלים בערימה של עד 15 עלים. לאחר מכן, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את העלים לרצועות ברוחב של 1 millimeter.העבירו מיד את רצועות העלים אל צלחת הפטרי באמצעות פינצטה שטוחה, הפרידו בעדינות בין הרצועות ובצעו חלחול בוואקום (vacuum infiltrate) לדגימות פעמיים, למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על מנער אורביטלי המכוון ל-90 RPM בטמפרטורת החדר והספיגו את דגימות הפרוטופלסט למשך שלוש עד ארבע שעות. במהלך האינקובציה, השתמשו בפינצטה כדי להפריד בין רצועות העלים במרווחי זמן של חצי שעה.לאחר העיכול, סננו בעדינות את תמיסת הפרוטופלסטים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך מבחנה של 50 מיליליטר. רצועות העלה יישארו במסננת לצורך הסרתן, בעוד הפרוטופלסטים יעברו דרכה.כעת השתמש בארבעה מיליליטר של תמיסה A כדי לשטוף בעדינות את רצועות העלה, תוך איסוף מי השטיפה לשפופרת של 50 מיליליטר. לאחר מכן, העבר את תרחיף הפרוטופלסטים לשפופרות בעלות תחתית עגולה וסבב את הפרוטופלסטים בצנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות של 300 ×g ובטמפרטורת החדר. תוך הקפדה שלא להפר את המשקע, שאב בעדינות כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן שטוף את הפרוטופלסטים עם חמישה מיליליטר של תמיסה A תחת אותם תנאי סבב בצנטריפוגה.לבסוף, לאחר הסרת השכבה העליונה הצפה, השתמשו בטיפ P 1000 קטום כדי לערבב מחדש את ה-PROTOPLASTS בנפח מתאים של תמיסה A לפני המיון באופן מיידי. השתמשו בטיפ P 1000 לא קטום כדי לפרק גושים בתמיסת ה-Protoplasts. בצעו דיסוציאציה נוספת של התאים על ידי סינון ה-protoplasts לתוך מבחנה למיונים דרך מסנן fillon של 50 micron.לאחר מכן, דללו את תמיסת התאים כראוי כדי למנוע סתימה של פיית שאיבת התאים. לאחר קביעת תנאי שאיבת התאים האופטימליים, זהו את ה-Proto plus החיוביים ל-GFP באמצעות לייזר Argonne של 488 nanometer, תוך השוואת הפלט ממסנן Band pass 580/30 לעומת מסנן Band pass 530/40. שימו לב כי הפרוטופלסטים החיוביים ל-GFP יופיעו באוכלוסייה בעלת ערכי 530 גבוהים ו-580 נמוכים.במקרה של פרוטופלסטים שאינם מביעים GFP באוכלוסיית low 530, low 580, הפרוטופלסטים המתים או הגוססים והשברים מופיעים באוכלוסיית high 580; לצורך הדמיה של הפרוטופלסטים הממוינים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מיינים את הפרוטופלסטים ישירות לתוך שמונה נפחים לפחות של תמיסה A, ולאחר המיון מרכזים את הפרוטופלסטים באמצעות סבוב (centrifugation). ניתן למיין את הפרוטופלסטים לתוך שמונה נפחים של תמיסה A ולאסוף אותם להדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את ההעשרה. תמונה ראשונה זו מציגה דוגמה להעשרה של השורה התאית TP 382, המבטאת GFP בתאי השמירה. דוגמאות לתשואות שהושגו בשיטה זו, הן לפני והן אחרי הגברה, מסוכמות בטבלה זו.הכמויות שהתקבלו, שנעו בין 500 picograms ל-50 nanograms, מספיקות להגברה באמצעות מערכת ovation PICO WTA ולניתוח עוקב באמצעות quantitative PCR, next generation sequencing או microarray. סדרת התמונות הבאה מציגה קווי תאים שונים של פרוטופלסטים שבודדו ומוינו לפי השיטה שתוארה לעיל. הפרוטופלסטים הראשונים הופקו מ-KC 2 74, עלים, חתך רוחבי של KC 2 74.העלה מראה כי ה-GFP מבוטא במערכת הכליים. פרוטופלסטים אלו בודדו מעלי KC 4 64, וחתך רוחב של עלה KC 4 64 מראה כי ביטוי של GFP נמצא באפידרמיס של A dal. לבסוף, פרוטופלסטים אלו הופקו מעלי TP 3 82 בעלי TP 3 82.כאן מבוטא ה-GFP בתאי השמירה. מוצגים תרשימי פיזור (dot plots) טיפוסיים של רכישת נתונים ב-FACS, הממחישים את הפלט ממסנני פס-מעבר של 580 ± 30 ננומטר לעומת 530 ± 40 ננומטר. שערי המיון המוצגים הם אלו המשמשים בדרך כלל במהלך המיון.תרשים פיזור ראשון זה של פרוטופלסטים שהופקו מעלי col4 אשר עברו פרוטופלסטציה בהיעדר מעכבים, מראה אוכלוסייה אחת של 530 נמוך, 580 נמוך. לעומת זאת, תרשים פיזור זה של פרוטופלסטים מסוג wild type שהופקו מעלי col4 אשר עברו פרוטופלסטציה בנוכחות מעכבים, מדגים את ההסטה בفلורסצנציית ה-580 המתרחשת עקב העקה והצביעה שנגרמו על ידי המעכבים. תרשמי פיזור אלו הם של פרוטופלסטים שהופקו מעלים מהקווי KC 74, KC 4 64 ו-TP 3 82, בהתאמה.דגימות אלו עוברו גם בנוכחות מעכבים, מה שהראה כי ה-GFP נמצא באוכלוסיות עם ערכים גבוהים של 530 ונמוכים של 580. עבור ניסוי quantitative PCR מייצג זה, השגנו תחילה דגימות עבור כל סוג של פראקציה. לאחר מכן, הדגימות הועשרו באמצעות מערכת ovation PICO WTA ו-quantitative PCR.בוצעו בדיקות באמצעות פריימרים ספציפיים ל-GFP. הערכים המוצגים הם הערכים הגבוהים ביותר באדום והנמוכים ביותר בירוק; ערכים ממוצעים או ערכים בודדים המשתמשים ב-actin two כגן ייחוס מסומנים על ידי הפסים הצהובים האופקיים. התוצאות מהוות אימות מחדש של ההערכות האופטיות של תכולת ה-GFP בתאים בפרקציות הממוינות.האוכלוסייה בעלת ערכי high 530 low 580 הראתה את הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי GFP שניתן למדוד. בעוד שהאוכלוסייה בעלת ערכי high 530 high 580 הראתה ביטוי GFP נמוך פי כ-1000, האוכלוסיות בעלות ערכי low 530, low 580 ו-low 530 high 580 הראו רמות נמוכות של ביטוי GFP שהיו דומות לאלו של קבוצת הביקורת של עלה שלם ואוכלוסיות פרוטופלסטים לא ממוינות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע עד חמש שעות מהצמח ועד לאוכלוסיית תאים ממוינת, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנטר ללא הרף את ממייין התאים ולכייל אותו מחדש במידת הצורך כדי לשמור על דיוק המיון.נוהל זה נמצא. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח microray, כדי להשוות ולבחון הבדלים ברמות הביטוי הגנים בסוגי תאים שונים. כעת, לאחר שטכניקה זו פותחה, אנו מנתחים ביטוי גנים בסוגי תאי עלה ספציפיים בשלבי התפתחות שונים, ונשווה זאת לנתונים מהעלה השלם שהופקו בפרויקט האגרונומיה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד סוגי תאים בודדים מעלים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting).

cell-specific-analysis-arabidopsis-leaves-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת...

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק...

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד התנהגות גידול הצמח, במיוחד פנוטיפים באופן לשחזור. אנו מראים כיצד לספק משתנה ועל הזמן אותו יציבים לתנאי תאורה. ניתוחים נכונה תלויה מספיקים מדגם והערכות סטטיסטיות בתוקף.

ניתוח התנהגות גדילה תודרנית לבנה באיכויות שונות אור

אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

למד שיטה לבידוד פרוטופלסטים מסוגי תאים ספציפיים בעלי Arabidopsis באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים ופרופילים מטבוליים בתאים מסומנים ב-GFP.

ניתוח ספציפי של תא

גלה סרטונים נוספים