Name: גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למד טכניקה כירורגית חדשנית להזרקה תוך-קנהיתית בעכברים עובריים. שיטה זו משפרת את מסירת סוכנים ביולוגיים לריאות העובר ומונעת דילול בנוזל השפיר בהשוואה להזרקה תוך-מיונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MC וAVdP הם דוקטורנטים נתמכים על ידי מענקים מהמכון לקידום החדשנות באמצעות מדע וטכנולוגיה בפלנדריה (IWT פלנדריה). JT מחזיק מלגה חלקית מחקר קלינית (כור) מUZ לובן. DV הוא דוקטורט בחור נתמך על ידי מענק מKU לובן, DBOF/10/062. MMdC הוא דוקטורט בחור נתמך על ידי מענק מConselho Nacional de Pesquisa הדואר Desenvolvimento (CNPq) וארסמוס מונדוס. מחקר מומן על ידי IWT פלנדריה, על ידי המענק מהקהילה האירופית דימי (LSHB-CT-2005-512146) ועל ידי בחי מולקולרי הדמית מחקר קבוצה (IMIR) מKU הלובן. ברצוננו להודות Core הווקטור UPenn נוסד על ידי ג&#39;יימס מ &#39;וילסון למתנת סוגם של AAV6.2 אריזת פלסמיד לייצור וקטור rAAV.

<ol><li>Willson, D. F., Notter, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+exogenous+surfactant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Care%22%5BJournal%5D)">The future of exogenous surfactant therapy.</a> Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).</li>
<li>Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+Clara+cell+secretory+protein+%28CCSP%29+administration+in+preterm+infants+with+or+at+risk+of+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+Syst.+Rev%22%5BJournal%5D)">Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome.</a> Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).</li>
<li>Thebaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+gene+therapy+increases+survival%2C+promotes+lung+angiogenesis%2C+and+prevents+alveolar+damage+in+hyperoxia-induced+lung+injury%3A+evidence+that+angiogenesis+participates+in+alveolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization.</a> Circulation. 112, 2477-2486 (2005).</li>
<li>Griesenbach, U., Alton, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+the+lung%3A+lessons+learned+from+more+than+2+decades+of+CF+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).</li>
<li>Aneja, M. K., Rudolph, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+surfactant+protein+B+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of surfactant protein B deficiency.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).</li>
<li>Flotte, T. R., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+alpha-1+antitrypsin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency.</a> Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).</li>
<li>Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+and+genetic+therapies+for+the+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Fetal+Neonatal+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell and genetic therapies for the fetus.</a> Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).</li>
<li>Peebles, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+marker+gene+expression+in+the+airway+epithelia+of+fetal+sheep+after+minimally+invasive+tracheal+application+of+recombinant+adenovirus+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero.</a> Gene Ther. 11, 70-708 (2004).</li>
<li>Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetoscopic+tracheal+occlusion+%28FETO%29+for+severe+congenital+diaphragmatic+hernia%3A+evolution+of+a+technique+and+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results.</a> Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).</li>
<li>Buckley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-amniotic+delivery+of+CFTR-expressing+adenovirus+does+not+reverse+cystic+fibrosis+phenotype+in+inbred+CFTR-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice.</a> Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).</li>
<li>Davies, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+utero+expression+of+CFTR+does+not+improve+survival+of+CFTR+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice.</a> Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).</li>
<li>Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+transfer+to+mouse+fetuses+with+recombinant+adenovirus+and+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors.</a> Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).</li>
<li>Henriques-Coelho, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+transfer+to+fetal+rat+lung+interstitium+by+ultrasound-guided+intrapulmonary+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection.</a> Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).</li>
<li>Toelen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+gene+transfer+with+lentiviral+vectors%3A+long-term+in+vivo+follow-up+evaluation+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model.</a> Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+phenotypic+correction+of+hemophilia+B+in+immunocompetent+mice+by+prenatal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy.</a> Blood. 104, 2714-2721 (2004).</li>
<li>Senoo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+utero+gene+transfer+in+mice+and+guinea+pigs%3A+tissue+distribution+of+recombinant+adenovirus+determined+by+quantitative+TaqMan-polymerase+chain+reaction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay.</a> Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).</li>
<li>Carlon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+mouse+lung+by+fetal+intratracheal+injection+of+rAAV2%2F6.2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2.</a> Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Schmiedl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+injury+is+more+pronounced+in+fetal+transgenic+ErbB4-deleted+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).</li>
<li>Buckley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+adenovirus-mediated+airway+transduction+in+fetal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice.</a> Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שלבים קריטיים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר הזן שבחרנו לעבוד עם עכברים הוא NMRI כי יש להם מספר שופע של גורים (גודל ממוצע המלטה 14.4 ± 1.8, נתונים שלו), תסבול התערבויות היטב ויש להם מאפיינים אימהיים טובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצבת מחרוזת הארנק דרך דופן הרחם והקרומים העובריים היא שלב קריטי כמו שאתה רק רוצה לחשוף את ראש העובר ולא את הכתפיים, אחרת מיצוב מחדש הוא כמעט בלתי אפשרי מבלי לגרום לט...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> עכברי NMRI </td><td> ז&#39;אנווייר, Le Genest סנט Isle, צרפת </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> Isoba, Intervet / Schering-Plough לבריאות בעלי חיים, מילטון קיינס, אנגליה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prolene 6-0 </td><td> Ethicon, גרוט Bijgaarden, בלגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vicryl 5-0 </td><td> Ethicon, גרוט Bijgaarden, בלגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מזרק 50 μl המילטון זכוכית, הדגם 1710.5 TLLX SYR </td><td> המילטון, רינו, NV, ארצות הברית </td><td> 5495-20 </td><td></td></tr><tr><td> מחט 30G חדה </td><td> המילטון, רינו, NV, ארצות הברית </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> 2% xylocaine </td><td> חברת AstraZeneca, Zoetermeer, הולנד </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

גישה ניתוחית חדשנית למנהל intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

אספקת ריאתי בהריון של תאים, גנים או סוכנים תרופתיים יכולה לספק את הבסיס לאסטרטגיות טיפוליות חדשות למגוון רחב של מחלות גנטיות ונרכשות. חוץ ממומים מולדים או תורשתיים עם הדרישה לביטוי לטווח הארוך של הגן נמסר, כמה תנאים סביב לידה שאינן תורשתיים-, שבו ביטוי גנים לטווח קצר או התערבות תרופתית מספיק כדי להשיג השפעות טיפוליות, נחשבים כאינדיקציות עתידיות אפשריות לכך סוג של גישה. מחל מועמד ליישום של טיפול טרום לידתי לטווח קצר יכולות להיות מחסור בילוד הזמני של החלבון הפעיל השטח B גורם 1,2 יילודי מצוקה נשימתית תסמונת או פציעות hyperoxic של ריאות יילודי 3. מחל מועמד לתיקון טיפולי קבוע הן סיסטיק פיברוזיס (CF) 4, וריאנטים גנטיים של ליקויים פעילים שטח 5 ו חסר α1-antitrypsin 6. &lt;כיתת p = &quot;jove_content&quot;&gt; באופן כללי, יתרון חשוב של טיפול גנטי טרום לידתי היא היכולת להתחיל התערבות טיפולית בשלב מוקדם בפיתוח, באו אפילו לפני ביטויים קליניים של המטופל, ובכך למנוע ניזק בלתי הפיך לאדם. בנוסף, איברי עובר יש קצב תרבות תאים מוגבר בהשוואה לאיברים למבוגרים, אשר עלול לאפשר גנטי יעילים יותר או העברת תאי גזע לעובר. יתר על כן, במסירת גן הרחם מבוצע כאשר המערכת החיסונית של האדם היא לא לגמרי בוגרת. לכן, השתלה של תאים או בתוספי Heterologous של חלבון שאינו תפקודי או נעדר עם גרסה נכונה לא אמורה לגרום לרגישות חיסונית התא, הווקטור או מוצר transgene, שלאחרונה הוכח במקרה של טיפולים סלולריים והן גנטיים 7 . במחקר הנוכחי, חוקרים בחן את הפוטנציאל ישירות לקנה הנשימה למקד העוברי בעכבר מ &#39;אודל. הליך זה נמצא בשימוש במודלים של בעלי חיים גדולים יותר כגון ארנבות וכבשים 8, ואפילו בהגדרה קלינית 9, אך עד כה לא בוצע קודם לכן במודל עכבר. כאשר לומדים את הפוטנציאל של ריפוי גנטי עוברי לטיפול במחלות גנטיות כגון CF, מודל העכבר הוא מאוד שימושי כהוכחה של המושג ראשון בגלל הזמינות הרחבה של זנים שונים מהונדסים לעכבר, embryogenesis המתועדים היטב וההתפתחות עוברת, פחות מחמירים תקנות אתיות, הריון קצר וגודל ההמלטה גדול. דרכי גישה שונה כבר תאר למקד ריאות מכרסם העובריות, כולל הזרקה תוך 10-12 מי שפירה, הזרקה (אולטרסאונד מונחה) intrapulmonary 13,14 ועירוי לוריד לתוך כלי צק חלמון 15,16 או וריד טבור 17. הליך הכירורגים החדשני שלנו מאפשר לחוקרים להזריק את הסוכן של בחירה ישירה לקנה נשימת העכבר העוברי המאפשרלאספקה ​​יעילה יותר לדרכי הנשימה מטכניקות קיימות 18.

פתחנו גישה ניתוחית חדשנית לממשל intratracheal של סוכני יו לעובר העכבר. מסלול המשלוח הוא יעיל יותר במיקוד ריאות העכבר העובריות מהזרקה תוך מי השפירה בשימוש נפוץ. הליך זה עד כה לא תואר במודל של עכברים.

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

הגשה פרינטלית של תאים, גנים או חומרים פרמקולוגיים לריאות עשויה להוות בסיס לאסטרטגיות טיפוליות חדשות למגוון של מחלות גנטיות ו...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאפשר הזרקה של חומר בחירה ישירות לקנה הנשימה של עוף עכבר עוברי, מה שמאפשר הובלה יעילה יותר למסלקי הנשימה מאשר בטכניקות קיימות. דבר זה מושג על ידי הוצאת הראש העוברי אל מחוץ לרחם באמצעות היסטרוטומיה (חיתוך רחמי) וגישה לקנה הנשימה העוברי. לאחר מכן, מבוצע חיתוך אנכי בצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה, ומחט מוחדרת תחת הנחיה ויזואלית.לאחר מכן, מזריקים חרוצים פלואורסצנטיים או וקטור ויראלי לקנה הנשימה כדי להוביל ביעילות את החומר הנבחר לדרכי הנשימה העובריות. ניתוח מיקרוסקופי של חתכי רקמה מריאות מטופלות מראה כי הזרקה תוך-קנינשימתית מובילה להעברה יעילה יותר של מולקולות פלואורסצנטיות או וקטורים ויראליים לדרכי הנשימה העובריות בהשוואה למסלול ההעברה התוך-מיני השכיח ביותר. היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות, כגון הזרקה תוך-מינית עוברית, הוא מניעת דילול של החומר המוזרק במי השפיר.פעולה זו ממקסמת את השפעת כמות החלקיקים הנוכחים בריאת העובר של העכבר. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בטכנולוגיה זו ימצאו כי ביצוע הזרקה אנדוטרכאלית מושלמת הוא מאתגר ביותר. זאת מכיוון שהקנה של העובר שברירי ביותר, ועל כן ניתן לנקבו בקלות רבה.בעשותך זאת, תבצע הזרקה פרי-טרכאלית (per tracheal) ובשל כך, לא תגיע לריאה העוברית. אך כहमेशा, תרגול מוביל לשלמות. כהכנה להזרקה תוך-טרכאלית (intra tracheal) או IT, השתמשו בעכברות MRI הר pregnant. הן יהיו בהריון של 18 ימים במועד הניתוח, לפני ואחרי הניתוח.הם נשמרים בכלובי עם מכסה מסנן בטמפרטורת חדר רגילה ובאור יום רגיל, עם גישה חופשית למים ומזון. לאחר הרדמת העכבר באמצעות isof fluorine, הניחו אותו על משטח חימום ב-37 °C כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ובדקו את רמת ההרדמה באמצעות צביטה בבהו. חטאו את הבטן באמצעות povidone iodine ובצעו לפרוטומיה חצצית (median laparotomy) כדי לחשוף את הרחם ההרי, הוציאו החוצה את שתי קרני הרחם וספרו את מספר שקי ההיריון.מבצעים ניתוח בעובר אחד בכל קרן רחם, בהתבסס על המיקום האופטימלי לחשיפת ראשו של העובר. כדי לקבע את העובר בתוך הרחם, מעבירים תפר בשיטת purse string מחומר 6-0 proline, בקוטר של כסנטימטר אחד, מהכתפיים דרך דופן הרחם וקרומי העובר מעל האזור שבו ייחשף ראשו של העובר. לאחר מכן, מבצעים חתך בדופן הרחם בתוך ה-purse string באורך של כ-0.8 סנטימטרים באמצעות מספריים קטנים בעלי קצה חד.בשלב הבא, לחצו בעדינות על ראשו וצווארו של העובר דרך ה-hysterotomy. לאחר מכן, משכו בעדינות את תפר ה-purse string כדי להדCקו אותו סביב הצוואר והשתמשו בשתי מלקחי micro mosquito. כדי לקבע את המצב, השתמשו ב-five o poly actin.קיבעו תשעה תפרי 10 באמצעות שתי פינצטות בתוך הפה, מסביב ללסת העליונה, כדי לשמור על ראש העובר במצב של היפר-אקסטנזיה (hyperextension) תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. חשפו את הקנה באמצעות דיסקציה חדה וקהה על ידי ביצוע חתך אנכי בצוואר, והמשיכו בדיסקציה של הרקמה התשתיות כדי להגיע לקנה. באמצעות מזרק זכוכית Hamilton של 50 microliter עם מחט חדה בדרגת 30 gauge, מזריקו נפח כולל של 30 microliters מהחומר.זרימה מינימלית של הנוזל המוזרק בעת הוצאת המחט מבטיחה שההזרקה בוצעה כראוי. כדי להחזיר את הראש אל הרחם, הפעל לחץ עדין על האף. הצוואר חוזר תחילה אל הרחם ולאחריו הראש.ולבסוף, האף. הכניסו מחט המכילה תמיסת סלין לתוך החתך בתוך תפר ה-purse string. סגרו את ההיסטרוטומיה על ידי הידוק תפר ה-purse string והזרימו סך של כ-500 microliters של סלין אל חלל מי השפיר כדי למנוע Oligohydramnios.לאחר החזרת הרחם אל תוך חלל הבטן, השתמשו בתפר רץ מסוג Vicryl 5-0 בשתי שכבות נפרדות. כדי לסגור את דופן הבטן של האם, חללו את אזור החתך ב-0.2% Xylocaine להפגת כאבים לאחר הניתוח. השאירו את העכבר על פד חימום עד להחלמה מלאה לפני ביצוע הזרקה תו-שלייתית (intra amniotic) או הזרקה IA לעובר.לאחר הרדמת העכברה ההרה, השתמשו בפובידון יוד לחיטוי הבטן ובצעו לפרוטומיה חצצית (median laparotomy) כדי לחשוף את הרחם ההרה, הוציאו החוצה את שתי קרני הרחם וספרו את מספר שקי ההיריון. באמצעות מזרק זכוכית של Hamilton בנפח 50 microliter עם מחט חדה בכילייב 30, הכניסו את המחט לתוך השק, קרוב לפי העובר אך ללא מגע עמו, והזריקו 30 microliters של תמיסה אל תוך מי השפיר.לאחר שכל העוברים הוזריקו, החזירו את הרחם לבטן וסגרו את דופן הבטן והעור באמצעות תפר Vicryl 5-0. לאחר המתת נקבת האם, 36 שעות לאחר ההתערבות בעוברים, הוציאו את העוברים בניתוח קיסרי והעריכו את חיותם על ידי בדיקת קיומו של דופק, צבע עור ורוד ותנועות ספונטניות. הניחו את הגורים בקרבת מקור חמצן כדי לעודד נשימה וספיגת חמצן.לאחר מכן, סמנו את הגורים בבסיס הזנב. בשימוש בדיו סיני, ניתן להעריך הצלחה של ההזרקה על ידי ביצוע המתת חסד לעובר שעבר פרוצדורה וניתוח של הריאות כדי להעריך באופן מקרוסקופי את נוכחותו של הצבע הנראה בריאות בהשוואה לריאות של קבוצת ביקורת שלא קיבלה הזרקה. לאחר מכן, כסו את שאר הגורים העומדים בקריטריוני החיוניות.השתמשו בחומר מצע המכיל צואה ושתן מאם מחליפה עם גורים בני יום אחד, והניחו את הגורים יחד עם השגר של האם המחליפה. השאירו לא יותר מ-10 גורים בסך הכל בשגר של האם המחליפה. לאחר מכן, הניחו את הכלוב בסביבה שקטה ללא הפרעות למשך 12 שעות והעריכו את שיעור ההישרדות של האימוץ כדי לקבוע את הנפח האופטימלי עבורו.נבחרו באופן אמפירי נפחי הזרקה של 10, 20 ו-30 microliter של מולקולות פלואורסצנטיות אדומות בגודל 100 nanometer. מוצגים כאן תמונות קונפוקליות של חתכי ריאה מקובעים עם צביעת גרעינים. למרות שבזמן הניתוח העוברי זוהה זרימה חוזרת רק לאחר הזרקה של 30 microliter, מה שמעיד על עודף של נוזלים שהוזרקו, נפח של 30 microliter הניב את כמות אות הפלואורסצנציה הגבוהה ביותר בפארנכימת הריאה כפי שקוונטה על ידי מדידת הפלואורסצנציה היחסית כפי שמוצג כאן; הזרקה זו גרמה למסירה גבוהה משמעותית של fluorospheres לריאה העוברית בהשוואה לנתיב ה-I A.המערכת הגסטרו-אינטסטינלית הייתה חיובית גם בבעלי החיים שקיבלו הזרקה ב-IT וב-IA. לא נצפתה פלורסצנציה אדומה ברקמות אחרות מעוברים מטופלים או בבעלי החיים של ביקרת השלילה. כדי להעריך את יעילות הטרנסדוקציה הוויראלית לאחר ההזרקה, בוצעו הזרקות IT ו-IA עם וקטורי RAAV המקודדים ל-firefly luciferase תחת בקרת ה-promoter של chicken beta actin בגיל שבוע. שטף הפוטונים הכולל עבור קבוצת ה-IT היה גבוה באופן משמעותי מאשר עבור גורי ה-IA ובביקרת השלילה.כדי להבחין בין הזרקה נכונה לשגויה לתוך הטרכאה (IT), בוצע שילוב של דימות תהודה מגנטית (MRI) ודימות ביו-לומנסי (BLI) כדי לקבל תמונת שכבות המשלבת את אות ה-BLI מהשטח עם ויזואליזציה של המבנים האנטומיים העמוקים יותר מדימות ה-MR, כפי שמוצג כאן. בגיל שבוע, דימות BL חשף אות הבוקע מאזור הצוואר והבית (חזה).רישום משותף של MRI עם BLI מיקם את ביטוי הגן של הלוסיפראז באזור הריאות לאחר הזרקה נכונה, אך באזור הצוואר והבטן לאחר הזרקה שגויה. ניתוח היסטולוגי באמצעות צביעת ex gal אישר את הרישום המשותף in vivo. לאחר שליטה מלאה, ניתן לבצע את כל הליך ההזרקה התוך-רחמית בחצי שעה, מהחתך ועד לסגירה של בעל החיים האם.זמן ניתוח קצר יוביל להישרדות עוברית טובה יותר ולמספר רב יותר של בעלי חיים שניתן יהיה לחקור לאחר הלידה.

a-novel-surgical-approach-for-intratracheal-administration-bioactive

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר גישה תוך-סימפונית למתן חומר ניסיוני באופן סלקטיבי לתוך ריאה ימנית ושמאלית דיסטלית. בפרוטוקול המוצג, אנו ננהל בלומיצין תוך סימפוני לתוך עכבר כדי לקבל מודל טוב יותר עבור פיברוזיס ריאתי.

משלוח תוך סימפונות: טכניקה לניהול סוכן ניסיוני באופן סלקטיבי לתוך ריאה עכבר

מקור: Venuprasad, K., et al. מתן תוך-קנה של המופילוס אינפלואנזה במודלים של עכברים לחקר דלקת בדרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את האספקה התוך-קנה של חיסון חיידקי פתוגני ריאתי לעכבר מורדם כדי להדגים זיהום בדרכי הנשימה התחתונות.

ביצוע אספקת חיידקים תוך קנה הנשימה במודל עכבר

סרטון זה מדגים את הליך חסימת קנה הנשימה הטרנס-רחמי של עובר עכבר בעכברה הרה. מודל זה יכול לשמש לחקר ההשפעה של קנה נשימה חסום על התפתחות הריאות.

דוגמנות חסימת קנה הנשימה של העובר במודל מורין: הליך כירורגי לקשירת קנה הנשימה העוברי בתוך עכברה בהריון

אנחנו פיתחנו שיטה פשוטה, אמינה, וזולה יחסית לאינטובציה endotracheal בעכברים באמצעות laryngoscopy הישיר באמצעות אוטוסקופ עם ספקולום 2.0 מ"מ. טכניקה זו היא atraumatic ויכולה לשמש למדידות חוזרות בניסויים כרוניים. אנחנו מוצאים את זה מעולה להנשמה או בעבר דיווח טכניקות נזקקה לניתוח.

Endotracheal אינטובציה בעכברים<em&gt; דרך</em&gt; ישיר laryngoscopy באמצעות אוטוסקופ

השימוש במודל המחקה את המצב של מחלות ריאה בבני האדם הוא קריטי ללימוד הפתופיזיולוגיה ו / או אטיולוגיה של מחלה מסוימת ולפתח התערבות טיפולית. הנה שיטת אינטובציה intratracheal לא פולשנית שיכול ישירות לספק חומרים אקסוגניים לריאות עכבר מוצגת.

פולשנית Intratracheal אינטובציה ללמוד פתולוגיה והפיזיולוגיה של עכבר ריאות

מאמר זה מציג שיטה מהירה ופשוטה לניהול בליאומיצין ישירות לתוך קנה הנשימה העכבר באמצעות אינטובציה. יתרונות עיקריים של שיטה זו הם כי הוא מאוד לשחזור, קל לשלוט, ואינו דורשים ציוד מיוחד או פעמי החלמה ממושכות.

שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

Intratracheal (IT) המינהל של סוכנים ניסיוניים בעכברים לעתים קרובות מביא משלוח אסימטרי הריאות המרוחק.  בדוח זה, אנו מתארים גישה ישירה בלתי-מרורונצ'יאל (ליברות) כדי לאגור כל ריאה בעכברים חיים שאינם מבצעית.  גישה זו יכולה לשמש באופן סלקטיבי לניהול סוכנים לריאה אחת או להתאים כדי לשפר את מסירת הסוכן הסימטרי לשתי הריאות.

מינהל הארגון הישיר כדי לשפר את הסוכן הסלקטיבי התצהיר בתוך הריאה של העכבר

טכניקה זו של החדרת תרופות ישירות לקנה הנשימה של מכרסמים יילודים חשובה לחקר ההשפעה של תרופות או ביולוגים מקומיים על מחלות ריאה בילודים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש גם לגרימת פגיעה בריאה במודלים של בעלי חיים.

שיטה זעיר פולשנית להחדרת תרופות תוך-רחמיות במכרסמים יילודים לטיפול במחלות ריאה

מודלים שונים של בעלי חיים של שבר דיאפרגמטי מולד וחסימת קנה הנשימה העוברי מציגים יתרונות וחסרונות לגבי סוגיות אתיות, עלות, קושי כירורגי, גודל, שיעורי הישרדות וזמינות של כלים גנטיים. מודל זה מספק כלי חדש כדי ללמוד את ההשפעה של חסימת קנה הנשימה והלחץ המואצני המוגבר על התפתחות הריאות.

מודל חסימת קנה הנשימה העוברי הטרנס-רחמי בעכברים

כאן, אנו מציעים פרוטוקול להעברת ליפופוליסכריד תוך טרכאלי (LPS) באמצעות אינטובציה אנדוטרכאלית אורופרכאלית לא פולשנית. שיטה זו ממזערת את הטראומה של ההליך הכירורגי עבור החיה ומעבירה LPS מדויק לקנה הנשימה ולאחר מכן לריאות.

החדרת ליפופוליסכריד תוך טרכאלי לא פולשני בעכברים

פרוטוקול זה מציג כיצד מיקום אופטימלי של עכבר והחדרת אוטוסקופ מבוסס מצלמה באופן טרנסאורלי מאפשר הדמיה של הגלוטיס, אינטובציה מהירה עם טראומה מינימלית לרקמות ואספקת נוזלים עקבית לריאות.

מתודולוגיה משופרת לאספקת נוזלים לריאת העכבר: אינטובציה באמצעות אוטוסקופ צרכני

למד טכניקה כירורגית חדשנית להזרקה תוך-קנהיתית בעכברים עובריים. שיטה זו משפרת את מסירת סוכנים ביולוגיים לריאות העובר ומונעת דילול בנוזל השפיר בהשוואה להזרקה תוך-מיונית.

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

גלה סרטונים נוספים