תיקון של דגם פגם Calvarial הקריטי בגודל תאי שומן באמצעות נגזרת סטרומה נקטפו מן Lipoaspirate
31 באוקטובר 2012
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של שומן הנגזר מתאי סטרומה lipoaspirate ויצירת 4 calvarial פגם קריטי בגודל מ"מ להעריך התחדשות שלד.
המטרה הכללית של הליך זה היא לאסוף תאי סטרומה רב-עוצמה מרקמת שומן לצורך גבירה אוסטאוגנית, תוך שימוש במודל של פגם בגולגולת (calvarial defect) במעכבד (in vivo) בעכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאי פרוגניטור מהשכבה הסטרומלית-וסקולרית של רקמת השומן, אותה ניתן להשיג לאחר הליך של שאיבת שומן (liposuction). השלב הבא הוא הכנת שלד תלת-ממדי ולאחר מכן זריעת התאים על גבי פיגום זה.
השלב הסופי הוא יצירת פגם בגודל קריטי בעצם הגולגולת (calvarial defect) במודל חולדה, שבו מוחדרים הפיגומים והתאים. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי לתאים סטרומליים רב-פוטנציאליים שבודדו מרקמת שומן יש פוטנציאל לרגנרציה של השלד in vivo. לטכניקה זו קייף קשת רחבה של יישומים קליניים אפשריים בשל המחסור ברקמות הזמינות לרגנרציה של השלד.
בעוד שהשתבכת עצם אוטולוגית נחשבת לסטנדרט הזהב, מחסור באתרי תרומה ותחלואה באתר התרומה מגבילים אפשרות זו. ניתן להשתמש באלוגרפטים ובחומרים זרים, אך אלו מוגבלים בשל עלות, אינטגרציה דלה וסיכון לזיהום.
השימוש הפוטנציאלי ברקמת שומן (adipose tissue) לצורך בידוד תאי פרוגניטור להנדסת רקמות שלד הוא מרגש. אני ומייקל צ'ונג ממעבדת long anchor נדגים את הפרוצדורה. ראשית, השג רקמת שומן תת-עורית אנושית מהליכים של שאיבת שומן (lipo aspiration) אלקטיבית.
שימו לב לשתי השכבות בתכשיר השאיבה השומנית. הנוזל העליון מכיל את מרבית החומר התאי שעבר עיבוד. השכבה התחתונה מורכבת בעיקר מתמיסת סליין שהוזרקה.
ניתן לאסוף תאי סטרומה ממקור רקמה שומנית מכל אחת מהשכבות, אך התפוקה גדולה בהרבה מהנוזל העליון. כדי לבודד את הפרקציה הווסקולרית הסטרומלית או ה-SVF, שטפו את השאיבה השומנית רחבה עם נפחים שווים של phosphate buffered saline בריכוז 1x או PBS המכיל 2.5% Betadine, ולאחר מכן שאבו נפח שווה של 1x PBS ללא Betadine. המתינו עד שהשטיפה תשקע.
הקפידו לשמור על טכניקה סטרילית לאורך כל התהליך כדי למנוע זיהום של רקמה אנושית מעובדת. לאחר מכן, שאבו את השכבה התחתונה והשליכו אותה לאחר כל שטיפה, ואז העבירו 15 milliliters של רקמה שומנית לתוך מבחנות Falcon קוניות בנפח 50 milliliter. לאחר מכן, עייכלו את הרקמה השומנית ב-15 milliliter של תמיסה מסוננת בריכוז 0.075%filtered.
הגבישו קולגנאז מסוג 2 בתוך תמיסת מלחים מאוזנת של הנק (Hank's balance salt solution או HBSS) בטמפרטורה של 37 °C במסבך מים למשך 60 דקות תחת ערבוב מתמיד, והקפידו לאוורר את המבחנות מדי 15 דקות. לאחר מכן, נטרלו את פעילות האנזים באמצעות 15 milliliters של PBS המכיל 10% סרום בקר עוברי (fetal bovine serum או FBS) ובצעו סנטריפוגה. כדי להשיג משקע SVF בצפיפות גבוהה, השג השקיעה תהיה תערובת של תאי גזע מופקים מרקמת שומן וכדורי דם אדומים.
ראשית, השליכו את שכבת השומן העליונה, ולאחר מכן השליכו את שכבת הנוזל העליונה מבלי להפריע למשקע. השביו את המשקע ב-10 milliliters של מצע גידול מסורתי. לאחר מכן, העבירו את התוכן משלוש מבחנות למבחנה קונוית נקייה אחת בנפח 50 milliliter דרך מסנן של 100 micron ובצעו צנטריפוגה.
שפוך את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע, ולאחר מכן השהה שוב את המשקע. בחמישה מיליליטר של מצע גידול סטנדרטי, שלב שתי מבחנות קוניות של 50 מיליליטר עבור כל צלחת של 10 סנטימטר, או חמש מבחנות קוניות של חמישה מיליליטר עבור צלחת אחת של 15 סנטימטר. הקם תרביות ראשוניות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C עם 21% oxygen ו-5% carbon dioxide.
לאחר דגירה למשך לילה, שטפו את הצלחות ה-PBS כדי להסיר תאי דם אדומים שאינם דבקים. אוכלוסיות התאים שהתקבלו הן תאי סטרומה ממקור שומני. שמרו על התאים ברמות תת-סמיכות (sub confluent) כדי למנוע דיפרנציאציה ספונטנית.
בטמפרטורה של 37 °C, 21% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני. במצע גידול, יש בדרך כלל לפצל את התאים בכל שלושה עד ארבעה ימים במצע גידול רגיל. כאשר הם מגיעים ל-50% confluence, הכין את הפיגום (scaffold) כפי שהוסבר בכתב היד הנלווה.
כאשר התאים מגיעים לרמות של תת-משרה (sub confluence), שטפו את התאים עם PBS פעמיים ובצעו טריפסינציה. ספרו את התאים כדי לכמת אותם. לצורך זריעה, הכינו את התאים לזריעה על פיגומים חתומים מראש בקוטר 4 מילימטר עם 1.5 × 10⁵ תאים.
הניחו פיגום בודד לתוך באר אחת בלוח 96 בארות, ולאחר מכן השהו את התאים במצע גידול רגיל בריכוז של כ-1.5 × 10⁵ תאים ל-20 µL של מצע. זרעו את הפיגום על ידי העברה בפיפט של 20 µL מהתמיסה ישירות אל תוך הפיגום, והניחו זאת באינקובטור לתרביות תאים למשך 30 דקות.
לאחר 30 דקות, הוסיפו 200 µL של מצע גידול ואפשרו לתאים להתרגול על הפיגום למשך הלילה. לפני הניתוח, אין צורך לוודא את היצמדות התאים לפיגום כפי שנעשה בזריעה. מספר מספיק של תאים יבטיח שרובם ייצמדו לפיגום.
לאחר הרדמה של עכבר CD1 nude בוגר בן 60 יום, יש לחטא את אזור הניתוח עם Betadine ואלכוהול שלוש פעמים ולמרוח חומר סיכוך על עיני העכברים. לאחר מכן, בצע חתך סגיטלי קו-מרכזי בקרקפת העכבר כדי לחשוף את עצם הפריאטלית הימנית. הסר את הפריאנא (perran) מעצם הפריאטלית הימנית באמצעות גירוד עדין.
לאחר מכן, צרו פגם חד-צדדי בעומק מלא וברוחב ארבעה מילימטרים בעצם הפריטלית הימנית, באזור שאינו קשור לתפרים. בעת השימוש במקדח עם קצה מצופה יהלום, היזהרו מאוד שלא לפגוע בקרום המוח (dura mater) שמתחת, שכן עובי הגולגולת בעכבר הוא פחות מ-0.3 מילימטרים לפני ההשתלה. שטפו את פיגומים (scaffolds) ב-PBS סטרילי כדי למנוע מעבר של גורמי גדילה המופקים מהמצע.
מקם את הפיגום (scaffold) בתוך הפגם. לבסוף, תפר את העור לסגירה ועקוב אחר בעל החיים בהתאם לפרוטוקולים הפוסט-אופרטיביים המקובלים. בצע micro CT לעכבר והשג תמונה משוחזרת בתלת-ממד באמצעות תוכנת microview.
השתמש ב-Adobe Photoshop כדי להתאים את גודל התמונות לגובה סטנדרטי. בדרך כלל, אנו מבצעים מדידות של התחדשות גולגולת (calvarial regeneration) מדי שבועיים. העכברים מושהים תחת הרדמה במהלך הסריקה למעקב ארוך טווח ובסופו של דבר מורדמים (euthanized).
עבור ניתוח היסטולוגי, השתמשו בתכונת ה-magic wand כדי למדוד פיקסלים של הפגם בגולגולת (calvarial defect). קבעו את אחוז הריפוי של הפגם באמצעות סריקות CT עוקבות. לאחר מדידת שטח הפגם בגולגולת וקביעת מספר הפיקסלים וחילוקו במספר הפיקסלים המקורי של הפגמים, צבעו חתכים מרובים לאורך הפגם באמצעות צבעים היסטולוגים כגון aniline blue ו-Picro-sirius red כדי לציין יצירת עצם (osteo formation).
השתמש ב-adobe Photoshop כדי לחתוך את כל האזורים שאינם נמצאים בתוך הפגם בגולגולת (calvarial defect), והשתמש בכלי ה-magic wand כדי לקבוע את מספר הפיקסלים של היווצרות עצם de novo באזור הפגם, והשווה זאת לקבוצות ביקורת או למשתנים אחרים. מוצג כאן סקירה כללית של קציר ויישום של שאיבת שומן (lipo aspirate), החל מבידוד תאי סטרומה הגזורים מרקמת שומן (adipose-derived stromal cells) ועד להרחבתם, התמיינותם ושימוש בהם in vitro ו-in vivo. כאן מוצגת תמונת micro CT המראה ריפוי in vivo של פגם בגולגולת בגודל קריטי עם יישום של ASCs באמצעות פיגום הידרוקסיאפטיט, כפי שנראה בשורה התחתונה.
הביקרים, הנראים בשורה העליונה, כוללים קבוצה ללא פיגום וקבוצת פגם. השורה האמצעית מראה פגם עם השמה של הפיגום ללא תאים. ה-LS המוצג כאן הוא הכמת של הריפוי העצמי מה-micro ct, המראה ריפוי מוגבר באופן מובהק בקבוצת ה-A SC.
זוהי תמונה היסטולוגית המראה יצירה מוגברת של עצם בקבוצת ה-A SC באמצעות andal. בכחול וב-pen צביעת AROM עבור al. בכחול, האוסטאואיד נצבע בכחול כהה עבור pen arom.
צביעות האוסטאואיד בצהוב המוצגות כאן הן תאי גזע אלובולריים (ASCs) אנושיים המסומנים ב-GFP, אשר נזרעו על פיגום והוקרבו לאחר שבועיים. הצביעה בוצעה באמצעות נוגדן המסומן ב-GFP כדי להדגים את תרומתם של התאים האנושיים לרגנרציה באזור הפגם. מוצגת כאן אימונוכימיה של אנטיגן גרעיני אנושי המראה את שכיחות התאים האנושיים באזור הפגם לאחר שבועיים.
לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את עיבוד רקמת השומן בתוך ארבע שעות, וההליך הכירורגי עשוי להימשך כ-10 דקות לכל עכבר. חשוב לזכור כי עצם הפריאטלית היא עגולה בעוד שהמקדח שטוח, ולכן יש להקפיד על קידוח לאורך כל ההיקף של הפגם בגודל ארבעה מילימטרים. זכרו לעבוד באיטיות כדי למנוע פגיעה בקרום העמי (dura mater) במוח.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאי פרוגניטור מרקמת שומן. זרעו תאים אלו על פיגום והחדירו אותם לעכבר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את בידודן של תאי סטרומה ממקור שומני מנשיבת שומן (lipoaspirate) ויצירת פגם גולגולתי בגודל קריטי של 4 mm להערכת התחדשות שלדית. המחקר מדגים את הפוטנציאל של תאים אלו לדיפרנציאציה אוסטאוגנית במודל in vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- הנדסת רקמות
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- תאי סטרומה המופקים מרקמת שומן הם רב-פוטנציאליים ויכולים להפוך לסוגים שונים של תאים.
- קיים מחסור ברקמות הזמינות ל재גנרציה של השלד.
- פגמים בעצם הגולגולת (Calvarial defects) הם קריטיים למחקר של התחדשות עצם.
- שאיבת שומן מספקת מקור של רקמת שומן לצורך בידוד תאים.
מטרת המחקר
- לאסוף תאי סטרומה רב-עוצמה (multipotent stromal cells) מרקמת שומן.
- להעריך את הפוטנציאל האוסטאוגני של תאים אלו במודל של פגם בגולגולת (calvarial defect).
- לבחון יישומים קליניים לרגנרציה של השלד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תאי פרוגניטור מהשכבה הווסקולרית הסטרומלית של רקמה שומנית.
- הכנת פיגום תלת-ממדי לזריעת תאים.
- יצירת פגם בגולגולת (calvarial defect) בגודל קריטי במודל של עכבר.
- השתלת הפיגום והתאים אל תוך הפגם לצורך הערכה.
תוצאות עיקריות
- תאי סטרומה רב-פוטנציאליים שבודדו מרקמת שומן הראו פוטנציאל להחדשה של השלד.
- המודל in vivo הדגים שילוב מוצלח של התאים והפיגום (scaffold).
- התוצאות מעידות על גישה מבטיחה לטיפול במחסור ברקמות בהחדשה של השלד.
- פוטנציאל ליישומים קליניים רחבים ברפואה רגנרטיבית.
מסקנות
- תאי סטרומה מהרקמה שומנית יכולים לתרום ביעילות לה regeneration של העצם.
- שיטה זו מספקת חלופה חיונית ליישומים של הנדסת רקמות.
- נדרש מחקר נוסף כדי לאפטמי את הטכניקות לשימוש קליני.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
פרוטוקול זה מבסס מודל פרה-קליני להערכת טיפולים מבוססי תאי פרוגניטורה ברגנרציה של השלד, במטרה לגשר על הפער התרגומי בהנדסת רקמות עצם. באמצעות הדגמת פוטנציאל אוסטאוגני של תאי סטרומה מהשומן במודל של פגם בגודל קריטי, הוא מספק מערכת הניתנת לשחזור לצמצום סיכונים של מועמדים לטיפול תאי לפני מחקרים המאפשרים הגשת IND. גישה זו תומכת בתעדוף פורטפוליו על ידי הפקת נתונים כמותיים של ריפוי, המנחים החלטות המשך (go/no-go) במסלולי פיתוח של רפואה רגנרטיבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של רב-פוטנציאליות (multipotency) של תאי סטרומה ויכולת התמיינות אוסטאוגנית במודל של פגם רלוונטי פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מספק מדד in vivo סטנדרטי להערכת התפקוד של תאי פרוגניטור ללא צורך בגורמי גדילה אקסוגניים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נקודות קצה כמותיות של micro-CT והיסטולוגיה להשוואה בין מבני תאים-פיגומים ממקורות תורמים שונים או ממשתני עיבוד שונים.
- ערך תפעולי: מבסס תהליך עבודה הניתן לשחזור לזריעה של תאים ממקור רקמת שומן על פיגומים של הידרוקסיאפטיט, ובכך תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה עבור סריקה פרה-קלינית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים בניית עצם בתתווך תאים במודל עם מערכת חיסונית מוחלשת, ובכך תומך בהכללה ליישומים בבני אדם.
- ערך תפעולי: מגדיר פרמטרי תהליך קריטיים הכוללים מינון תאים (1.5×10⁵ cells/scaffold), חומר הפיגום (HA-PLGA), וגודל הפגם (4 mm) לצורך סקילביליות והעברה טכנולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבידוד תאי פרוגניטור ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך היא מאפשרת שיפור איטרטיבי של שילובי תאים-פיגומים לפני בחירת המועמד המוביל.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי הפוטנציאל האוסטאוגני של תאי סטרומה על ידי קישור בין הרחבה in vitro לתיקון פגמים in vivo.
- סריקה: מספק מערכות ביולוגיות מוכנות לבדיקה עם פלטים כמותיים (נפח micro-CT, צביעה היסטולוגית) להערכה השוואתית של מקורות תאים או שינויים בפיגומים.
- אנליטיקה: מספק פלטים סטטיסטיים, כולל הפחתה בשטח הפגם ומדדי השכרה של יצירת עצם מבוססי פיקסלים, המאפשרים השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין איסוף רקמת שומן לבין רגנרציה תפקודית של עצם, תוך ביסוס נתיב לרצף פרה-קליני באסטרטגיות לתיקון שלד.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את תהליך הבידוד וההזריעה כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת סוגי תאי פרוגניטור 다양한 או וריאנטים של חומרי ביו-מטריאל ברגנרציה של עצם.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חזוי ביכולת האוסטאוגנית של תאי אב, הפחתת עמימות מכניסטית ביצירת עצם המתווכת על ידי תאים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בידוד פרקציה וסקולרית סטרומלית, זריעה של פיגומים ויצירת פגמים בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) לקידום טיפול תאי, הפחתת סיכון ביולוגי בפיתוח פרה-קליני.
- השפעה על פורטפוליו: תיעוד ותיעדוף מותאם סיכון של טיפולים תאיים המופקים מרקמת שומן, בהסתמך על יעילות ריפוי כמותית במודל רלוונטי קלינית.
שיקולי יישום
- מומחיות בעיבוד רקמת שומן, תרביות תאים סטריליות וטכניקות ניתוח בעכברים.
- מכשור לעיכול באמצעות קולגןז, צנטריפוגה, דימות ב-micro-CT ואנליזה היסטולוגית.
- סטנדרטיזציה של פרוטוקולים לבידוד SVF, שיטות לכימות תאים והכנת פיגומים (scaffolds) בין צוותים.
- שיקולי התאמה עבור מקורות שומן שונים, מינים שונים או מודלים של פגמים, תוך שמירה על פרמטרים קריטיים של גודל.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בתשואת התאים הסטרומליים משאיבות שומן (lipoaspirate) והצורך במודלים עם דיכוי חיסוני למניעת דחייה של השתלה זרה (xenograft).
