Name: גירוי מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: חקור את השפעת העומס המכאני הדינמי על מטבוליזם של כונדרוציטים בהידרוג'ל אגרוז דו-ממדי. השיטה מאפשרת הערכת סינתזת קולגן ופרוטאוגליקנים בתרביות תלת-ממדיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. בידוד של כונדרוציטים במפרק ראשי קציר 10-15 פרוסות סחוס בעובי מלאה ממשטחי המפרקים של מפרקים בבעלי חיים (למשל משותף מסרק-phalangeal של פרות בשלות כשלד המתקבלות מabbatoir מקומי). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות סחוס מניח בתבנית 100 מ&quot;מ פטר ודגירה ב20 מ&quot;ל של פרוטאז 0.5% בשינקין של F-12 (w / v) עבור 2 שעות ב 37 ° C. יש לשטוף שלוש פעמים בF-12 תקשורת התרבות של שינקין, ודגירה עם 20 מ&quot;ל של collagenase 0.15% בF-12 התקשורת של שינקין תרבות הלילה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן השעית התא דרך מסנן מסך רשת 200 לתוך צלחת נקיה. שטוף את המסנן עם 5 מ&quot;ל של Ham של F-12 ולהוסיף לתבשיל. להעביר את השעית התא לצינור 50 מיליליטר חרוטים. לשטוף את צלחת פטרי עם 10 מ&quot;ל של Ham של F-12 ולהוסיף לצינור החרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב600-800 RCF במשך 6-8 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, ומבטיח לא להפריע הדואר תא גלולה ומחדש להשעות ב40 מ&quot;ל של F-12 תקשורת התרבות של שינקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב600-800 RCF במשך 6-8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.4 ו 1.5 פעמים יותר עבור סכום כולל של 3 פעמים. לפני צנטריפוגה בפעם השלישית, resuspend הגלולה באמצעות התססה ולקבל aliquot μl 500 לספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי קיימא בשיטת ההדרה הכחולה Trypan 9 עם hemacytometer ומיקרוסקופ אור הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות את הגלולה בהיקף של התקשורת של שינקין F-12 להכפיל את צפיפות הזריעה הרצויה (למשל 20 x 10 6 תאים / מ&quot;ל לריכוז סופי של 10 x 10 6 תאים / מ&quot;ל אחרי אנקפסולציה). </li></ol> 2. Encapsulation Hydrogel Chondrocyte-agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום 0.8 גרם autoclaved סוג השביעי agarose ב20 מ&quot;ל של 1x PBS סטרילי (pH 7.4) על צלחת חמה להגדיר עד 120 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה. ברגע מומס, מנמיך את האש עד 60 ° C כמו טמפרטורות גבוהות will להשפיע כדאיויות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 50 מיליליטר חרוטים, יסודיות לערבב כמויות שווות של השעית התא עם הריכוז הכפול הרצוי של agarose (למשל 4% להשעית agarose 2% הידרוג agarose סופי). הימנע מיצירת הבועות גדולות כפי שהם יכולים להשפיע על כדאיויות תא ולבנות חיים עייפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות 10 מיליליטר aliquot של תערובת chondrocyte-agarose לתוך צלחת פטרי קוטר 60 מ&quot;מ, תוך הימנעות מיצירת בועות גדולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר עד gelled. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג כמה שיותר דגימות הידרוג chondrocyte-agarose לפי הצורך (בדרך כלל 20-30) באמצעות 4 מ&quot;מ ביופסית אגרוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ולתעד את הממדים הפיסיים (קוטר וגובה) של מדגמים מייצגים באמצעות מיקרומטר. מבנים צריכים להיות כ 5 מ&quot;מ הגובה, לבטל את כל דגימות שהתקבלו מאזור שבו דגימת שונות הגובה הייתה גדול מ 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות לצלחת פטרי 60 מ&quot;מ טריה ותוספתעם 10 מ&quot;ל של מדיה מלאה (20% בסרום למשל עוברים מבקר בF-12 תקשורת התרבות של שינקין עם 20 HEPES מ&quot;מ, 100 מיקרוגרם חומצה / מ&quot;ל אסקורבית ואנטיביוטיקה / antimycotics 2x). </li></ol> 3. גירוי וRadiolabelling מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי הרכיבים המתכתיים של מתקן הדחיסה. לעקר את רכיבי פלסטיק עם אתנול 70% (לילה) ואור UV (לפחות 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על מבנים את הנפילה, באמצעות מלקחיים, מקום 12 טבעות פלסטיק סטריליים התמך (עם קוטר פנימי גדול יותר מקוטר התבנית) (n = 6, דגימות ובקרה) בתוך הבארות של צלחת תרבות 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, להעביר בזהירות את הידרוג chondrocyte-agarose מצלחת פטרי לצלחת 24 היטב, הבטחה שכל אחד במטבע חיזוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 400 μl של מדיה מלאה (לדוגמא 20% FBS בF-12 תקשורת התרבות של שינקין עם 20 HEPES מ&quot;מ, 100 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית, ו2x אנטיביוטיקה / antimycotics) לכל דגימה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מתקן הדחיסה המעוקרת (איור 1) ולהבטיח את platens עם ברגים שנקבעו. צרף מתקן הדחיסה לצלחת התרבות 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר ולהבטיח מחדש את הברגים הקבועים ליצור קשר Platen-הידרוג&#39;ל (אפס מדינת מתח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מתקן הדחיסה התאסף לתוך מערכת בדיקת micromechanical מאך-1. מתקן מאובטח על הבמה האנכית באמצעות סיכה ונעילת איתור המקום עם בורג סט. הסר את מחול המרווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טעינת דחיסה דינמית במשרעת רצויה (למשל 10% משרעת מתח המבוססת על הגובה המקורי של דגימות), תדירות (1 לדוגמא רץ) ומשך או מספר המחזורים (למשל מרווחי זמן של עד 60 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת הגירוי מכאני, החלף את מחול המרווח, שחרר את בורג סט סיכת האיתור ולהסיר את מעטת הדחיסה וצלחת תרבות מבדיקת מערכת micromechanical מאך-1. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבני Radiolabel תא הידרוג ידי להשלים את התקשורת עם 5 μCi של איזוטופ הרצוי (למשל [3 ח] תווית חלבון פרולין לסינתזת הקולגן chondrocyte ספציפית ו[ 35 S] גופרית לסינתזת גליקן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת מבני radiolabeled עבור 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את המבנים הידרוג radiolabeled ולשטוף 3 פעמים ב1x PBS (pH 7.4), כדי להסיר כל איזוטופ מאוגד. דגימות Digest באמצעות פפאין (40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ביצטט אמוניום 20 מ&quot;מ, חומצת 1 מ&quot;מ ethyldiaminetetraacetic וdithiothreitol 2 מ&quot;מ על 65 המעלות צלזיוס במשך 72 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay לעכל לתוכן דנ&quot;א באמצעות assay PicoGreen הצבע 11 ופעילות איזוטופ משולב, מנורמל לתוכן ה-DNA, על ידי נצנץ β-נוזל ספירת עיכול פפאין מייד לאחר 12,13. </li></ol> הערה: הרכישה וסילוק חומרים רדיואקטיביים (איזוטופים פסולת ופריטיםשייתכן שהגיע לחומרים רדיואקטיביים מגע) חייב לעקוב מדיניות (ו / או ממשלתי) ונהלים לטיפול וסילוק הבטוח של חומרים רדיואקטיביים מוסדי רלוונטי. 4. נציג תוצאות מבני שור מפרקי chondrocyte-agarose הידרוג (2% agarose עם 10 10 x 6 תאים / תאים כמוסים מ&quot;ל) היו מגורה מכאני בהמשרעת של מתח דחיסה 10% בתדירות של הרץ 1 במשך 20 עד 60 דקות (או 1200 ל3600 מחזורים ) וassayed לתוכן ה-DNA וסינתזה תאית על ידי שילוב radioisotope. ה-DNA וסינתזת מטריקס הושפעה באופן תלוי מינון. תוכן ה-DNA הראה ירידה משמעותית 35% כתוצאה מ20 או 30 דקות של גירוי (p &lt;0.01), ואילו 60 דקות של גירוי הציגו שום אפקט (איור 2). סחוס ספציפי סינתזת הקולגן וגליקן (נקבע על ידי [3 ח]-פרולין ו<html> [35 S] שילוב גופרית, בהתאמה) הציג עלייה משמעותית של כ 60% בתגובה ל20 או 30 דקות של גירוי (p &lt;0.01), עם 60 דקות של גירוי אינה מראה סימני השפעה משמעותית (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="איור 1" /> . האיור 1 סכמטי של מתקן הדחיסה הדינמית שהותקן על גירוי מבני chondrocyte-agarose שמאל:. אסדה מורכבת ימני:. התפוצץ נוף מראה רכיבים בודדים. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. שינויים בתוכן ה-DNA של chondrocyte-agarose הידרוג מגורה מכאני תחת משרעת 10% דחיסת מתח ברץ 1 במשך 20 עד 60 דקות (ממוצע ± SEM, n = 6/group). her.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. שינויים בסינתזה תאית (קולגן וproteoglycans) של agarose chondrocyte הידרוג מגורה מכאני תחת משרעת מתח דחיסה 10% בהרץ 1 במשך 20 עד 60 דקות (ממוצע ± SEM, n = 6/group).

<ol><li>Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+remodeling+in+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+articular+cartilage+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of articular cartilage in health and disease.</a> Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).</li>
<li>Neu, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+of+functional+biotribology+and+regenerative+medicine+in+synovial+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).</li>
<li>Demarteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+cartilage+constructs+engineered+from+expanded+human+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+compressive+stimulation+improves+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).</li>
<li>Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+chondrocyte-seeded+fibrin+gels%3A+effects+on+matrix+accumulation+and+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).</li>
<li>Buschmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte%2Fagarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).</li>
<li>Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+alters+proteoglycan+deposition+and+matrix+deformation+around+individual+cells+in+cartilage+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants.</a> Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cartilage+matrix+by+mammalian+chondrocytes+in+vitro.+I.+Isolation%2C+culture+characteristics%2C+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology.</a> The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).</li>
<li>Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+chondrocytes+embedded+in+3D+constructs%3A+in+vitro+methods+for+assessment+of+morphological+and+metabolic+response+to+compressive+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain.</a> Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).</li>
<li>McGowan, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+quantification+of+DNA+in+human+articular+and+septal+cartilage+using+PicoGreen+and+Hoechst+33258%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).</li>
<li>Fan, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intermittent+static+biaxial+tensile+strains+on+tissue+engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage.</a> Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).</li>
<li>Kaupp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+vibrations+increase+the+proliferation+of+articular+chondrocytes+in+high-density+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%3A+Journal+of+Engineering+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+shear+deformation+improves+the+quality+of+cartilaginous+tissue+formed+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+application+of+cyclic+loading+can+accelerate+matrix+deposition+and+enhance+the+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).</li>
<li>Kisiday, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dynamic+compressive+loading+on+chondrocyte+biosynthesis+in+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds.</a> Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).</li>
<li>Chowdhury, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+chondrocyte+metabolism+in+agarose+constructs+subjected+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

<html> השיטה המתוארת ליישום גירויים מכאניים מבוקרים לתא בעלת גרעין agarose הידרוג מאפשרת חקירה הישירה להשפעות של כוחות דחיסה דינמיים בחילוף חומרי chondrocyte. השימוש במתקן לבדיקה מותאמת אישית בשילוב עם טבעות התמך ספק מגבלת רוחב למבנים כדי להימנע מבעיות פוטנציאליות של מדגם מפנה. השימוש בplatens טעינה המת המשוקלל מובטחים בצוותות ערכות מבטיח מגע ישיר עם מבנים למרות הבדלים פוטנציאליים בגובה מדגם. Radiolabeling לאחר הגירוי למדוד ביוסינתזה סלולרית מפחיתה את הפוטנציאל לזיהום, ומאפשר למתקן...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של המגיב או ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> החם של F-12 </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> פרוטאז </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbate </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה / antimycotics </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> רייכרט מואר ליין Hemacytometer </td><td> אוסר מדעי </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> קוואנט-IT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> פפאין מפפאיה לטקס </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> תצטט אמוניום </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> חומצת Ethyldiaminetetraacetic </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Dithiothreitol </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> נקודת התכה נמוך agarose, סוג שביעי </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;p&gt; <td> מסך Mesh (200) סנן </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> מאך-1 Tester micromechanical </td><td> Biomomentum בע&quot;מ </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> דחיסה טוען לנענע </td><td> שהותקן </td><td></td><td> מוצר דומה יכול להיות מסופק על ידי Biomomentum בע&quot;מ </td></tr><tr><td> פלייט התרבות פלקון 24 ובכן </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> מונה הנצנץ β-Liquid </td><td> Beckman Coulter </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] פרולין </td><td> פרקין אלמר- </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] גופרית </td><td> פרקין אלמר- </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

גירוי מכאני של הידרוג chondrocyte-agarose

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

סחוס במפרק סובל מיכולת תיקון מוגבלת, כאשר נפגע על ידי עלבון מכאני או מושפל על ידי מחלה, כגון דלקת מפרקים ניוונית. כדי לתקן את הליקוי הזה, כמה התערבויות רפואיות פותחו. שיטה אחת כזו היא לשוב אל פני שטח לאזור הפגוע ברקמת סחוס מהונדס, אך בדרך כלל רקמה המהונדסת חסרות את המאפיינים ועמידות ביוכימיים של סחוס מקורי, חקירת השרידות ארוכות הטווח שלו. זה מגביל את יישום הנדסת רקמות סחוס לתיקון פגמי מוקד קטנים, בהסתמך על הרקמה שמסביב כדי להגן על החומר המושתל. כדי לשפר את התכונות של הרקמות המפותחות, גירוי מכאני הוא שיטה פופולרית משמשת להגברת הסינתזה של מטריקס סחוסים, כמו גם את התכונות המכאניות כתוצאה של הרקמות המהונדסות. גירוי מכאני חל כוחות לרקמה בונה מקביל לאלו בגוף חי. זההוא מבוסס על ההנחה שהסביבה המכאנית, בחלקו, מסדירה את הפיתוח והתחזוקה של 1,2 רקמת ילידים. הצורה הנפוצה ביותר מיושמת של גירוי מכאני בהנדסת רקמת סחוס היא דחיסה דינמית בזנים פיסיולוגיים של כ 5-20% בתדירות של 1 הרץ 1,3. מספר מחקרים בחנו את ההשפעה של דחיסה דינמית והראו את זה יש השפעה חיובית על חילוף חומרים וביוסינטזה chondrocyte, סופו של דבר משפיע על התכונות הפונקציונליות של 4-8 רקמות המפותחות. במאמר זה, אנו מדגימים את השיטה המכאנית כדי לעורר מבנים הידרוג chondrocyte-agarose תחת דחיסה דינמית ולנתח שינויים ביוסינתזה דרך מבחנים ביוכימיים וradioisotope. שיטה זו יכולה גם להיות שונה כדי קושי להעריך את שינויים שנגרמו פוטנציאל בתגובה תאית כתוצאה מגירויים מכאניים.

ביוסינתזה של מטריקס סחוסים ידי כונדרוציטים יכולה להיות מושפעת על ידי יישום של גירויים מכאניים. שיטה זו מתארת ​​את הטכניקה של החלת זני דחיסה דינמיים לכונדרוציטים גלומים במבני 3D וההערכה של Induced שינויים בחילוף חומרי chondrocyte.

גירוי מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose

סחוס מפרקי סובל מיכולת תיקון מוגבלת כאשר הוא נפגע כתוצאה מפגיעה מכנית או נשחק עקב מחלה, כגון אוסטאוארטריטיס (Osteoarthritis). כדי לטפל ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפעיל עומס דחיסה מכני דינמי על הידרוג'לים המוזרעים בתאים. לשם כך, תאים ראשוניים מופקים באמצעות דיסקציה ועיכול אנזימטי של פרוסות סחוס. התאים המבודדים מוכפסים בתוך הידרוג'ל agros בריכוז של 2%, ומבני תאים מוזרעים נוצרים באמצעות מחץ ביופסיה.לאחר מכן מניחים את הדגימות במתקן להעמסה בלחץ ומכניסים אותן למערכת גירוי מכני מיקרוסקופית מדגם mach one. העמסה דינמית בלחץ מופעלת על מבנים הזורעים תאים כדי להעריך את סינתזת הקולגן והפרוטאו-גליקנים. המבנים עוברים סימון רדיואקטיבי לאחר דגירה שמאפשרה שילוב של הסמן.איזוטופים נמדדים באמצעות ספירת סינטיגציה, כאשר הנתונים המתקבלים מנורמלים ל-DNA. התוצאות מראות שינויים בסינתזה של המטריקס החוץ-תאי בעקבות גרייה מכנית. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תגובת אתר הנגד וגרייה מכנית.ניתן ליישם זאת גם על מערכות אחרים כגון תאי גזע, רקמות חיבור אחרות או תאים קולטני מכניקה. מפרקי הפלנגות של המטקרפליים מפרות בקר בוגרות מבחינה שלדית ששימשו כאן, הושגו מבית שחיטה מקומי באזור נתיחה סטרילי. תחת מנדף זרימה למינרית, הניחו את פרוסות הסחוס לצחנת פטרי בקוטר 100 millimeter המכילה 20 milliliters של hams, F 12 עם 0.5% protease והדגרירו למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.בעקבות דגירה תחת ואקום, שאבו את תמיסת הפרוטאז ושטפו את הפרוסות על ידי הוספת מצע גידול hams. F 12 תוך כדי ערבוב עדין, ולאחר מכן שאיבה. חזרו על פעולה זו, שטפו פעמיים נוספות, ולאחר השטיפה השלישית, שאבו את מצע הגידול באמצעות ואקום.הוסיפו 20 milliliters של hams F 12 המכיל 0.15%collagenase A והדגירו את הצלחונות למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. למחרת, העבירו בפיפטה את תרחיף התאים דרך מסנן רשת בסינון של 200 mesh אל תוך צלחת פטרי נקייה; כדי לשטוף את המסנן, העבירו בפיפטה חמישה milliliters נוספים של hams F 12, תוך איסוף הנוזל העובר לאותה צלחת. העבירו את תרחיף התאים לפפיתה קונית של 50 milliliter.שטפו את צלחת הפטרי עם 10 milliliters של hams F 12. לאחר מכן, העבירו את תמיסת השטיפה לפ hiker-tube (מבחנה קונית). סבבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-600 עד 800 RCF למשך שש עד שמונה דקות בטמפרטורת החדר.עם סיום הסבב, שאבו את העלייה תוך הקפדה לא להפריע למשקע התאים. השביו את המשקע ב-40 milliliters של מצע תרבית. הצנטריגו את המבחנה ב-600 עד 800 RCF למשך שש עד שמונה דקות.חזור על השאיבה, השעיה המשחת התאים והצנטריפוגה פעמיים נוספות, לסך הכל שלוש פעמים לפני הסבב השלישי. השהה את החיך באמצעות ערבול וקח מנה (aliquot) של 500 µL לספירת תאים. במהלך הסבב השלישי, השתמש ב-hemocytometer ובמיקרוסקופ אור הפוך כדי לספור את התאים החיים במנה באמצעות שיטת הדירה של trypan blue.לאחר שמספר התאים נקבע והסבוב השלישי הושלם, שאבו את העל-נוזל (snat) ובצעו ריסספנזיה. תלו את המשקע בנפח של מצע תרבית שפי 2 מצפיפות ההשבזה הרצויה. בשלב זה, התאים הכונדרוציטים תלו שנית בריכוז של 20 × 10⁶ תאים למילילטר.השלב הבא של הפרוצדורה הוא כליאת הכונדרוציטים הראשוניים המבודדים מהסחוס המפרקי בתוך הידרוג'ל aros; השעה 0.8 גרם של aros בתוך 20 מיליליטר של PBS סטרילי בתוך כלי כימי. הנח את הכלי על פלטה מחוממת המכוונת ל-120 °C, וברגע שה-aros נמס.הורידו את החום ל-60 °C בתוך מבחנה קונית בנפח של 50 milliliter. ערבבו נפחים שווים של תרחיף התאים עם פי שניים מהריכוז הרצוי של תמיסת ה-aro החמימה. כאן, 5 milliliters של תרחיף תאים מתווספים ל-5 milliliters של תרחיף 4%agro עבור תערובת סופית של 2%Agros hydrogel; ערבבו היטב באמצעות פיפט, תוך הימנעות מיצירת בועות גדולות שעלולות להשפיע על חיוניות התאים.כעת, העבירו בזהירות 10 milliliters של תערובת האגרוג'ל עם הכונדרוציטים לבדייה של פטרי בקוטר 60 millimeter. שוב, הימנעו מיצירת בועות גדולות. כסו את הבדייה במכסה.לאחר מכן, השאירו את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ברגע שהתערובת התמצקה, השתמשו במנקב ביופסיה של 4 מילימטר כדי להוציא כמה שיותר דגימות של הידרוג'ל כונדרוציטים-אלגינט.הניחו את הדגימות בתוך צלחת פטרי נקייה בעזרת מידומטר, ורשמו את הקוטר והגובה של כל דגימה. באופן אידיאלי, המבנה צריך להיות בגובה של כ-5 mm; השליכו כל דגימה שהתקבלה מאזור שבו גובה הדגימה עולה על 2%. העבירו את הדגימות לצלוחת פטרי חדשה בקוטר 60 mm המכילה 10 mm של מצע גידול מלא. בחלק זה של הפרוטוקול, המבנים המיושבים בתאים יועברו גירוי מכני באמצעות דחיסה דינמית.דבר זה יושג באמצעות מתקן דחיסה בעיצוב מותאם אישית, המצמיד מכנית את ה-PLAs להעמסה של המבנים למערכת מיקרו-מכנית דמוית אחת, השולטת במידת הדחיסה המופעלת על המבנים. ההיבט הקשה ביותר של הפרוצדורה הוא טעינת הדגימות למתקן הדחיסה. חשוב לכוונן נכונה את הפלטות במתקן כדי להבטיח הפעלה נאותה של עומס דחיסה דינמי.לפני השימוש, עקרו את הרכיבים המתכתיים של מתקן הדחיסה באוטוקלאב. עקרו את הרכיבים הפלסטיים באמצעות 70%ethanol למשך לילה ובאור UV למשך 15 דקות לפחות. זאת כדי למנוע מהמבנים של הידרוג'ל aros עם כונדרוציטים ליפול.השתמשו בפינצטה כדי להניח 12 טבעות קיבוע פלסטיקיות סטריליות לתוך הבארות של פלטת תרבית בעלת 24 בארות. הקטרים הפנימיים של טבעות הקיבוע צריכים להיות גדולים מקטרי המבנה. בצעו זאת בזהירות באמצעות פינצטה.העבירו את ההידרוג'לים של ה-chondro aros מהצלחת הפטרי ללוח 24 בארות, תוך קיבוע של כל אחד מהם בטבעת עיגון. העבירו 400 µL של מצע גידול מלא לכל דגימה. לאחר מכן, הרכיבו את מתקן הדחיסה הסטרילי וקבעו את ה-PLAs באמצעות ברגי סט.חברו את מתקן הדחיסה לצלחת תרבית בעלת 24 בארות כדי ליצור מגע בין ההידרוג'ל למשטח השחרור והדקו שוב. עיוות המבנה של ברגי הset יחול על מצב ייחוס לא עמוס זה או על מצב מאמץ אפס. טענו את מתקן הדחיסה המורכב למערכת בדיקות מיקרו-מכניות מסוג Mach one באמצעות פין המיקום.חבקו את המתקן לבמה האנכית ולאחר מכן נעלו אותו במקומו באמצעות בורג לחיצה. הסירו את ג'יג המרווח. השתמשו בממשק התוכנה Mach one כדי להגדיר את התדר ל-1 hertz, את האמפליטודה ל-350 microns ואת מספר המחזורים ל-1,200.תהליך זה מפעיל עומס דחיסה דינמי בעוצמה של 10% amplitude של מאמץ, בהתבסס על הגובה המקורי של הדגימות. כדי להתחיל את הגירוי המכני, לחצו על כפתור ההפעלה של בורר ה-mach one. התקן ההעמסה המתחבר לצלחת התרבית כולל שש שקעים הנעים למעלה ולמטה, ובכך מגרים שש דגימות בו-זמנית.מדגמי הביקורת ללא גירוי נמצאים גם הם באותה פלטת תרבית, אך אינם ממוקמים בבארים בעלות השקעים. כאשר ההרצה תסתיים, המכשיר ישמיע צפצוף והמפעיל (actuator) יחזור למצב הייחוס הבלתי טעון. עם סיום הגירוי המכני, החזירו את ג'יג הריווח (spacing jig).שחררו את בורג הייחזור של פין המיקום, והסירו את מערך הדחיסה ואת פלטת התרבית ממערכת הבדיקה. לצד סימון הרדיאו, פפיטו לתוך כל באר של מבני ההידרוג'ל של התאים חמישה µCi של Tritium Prolene protein label עבור סינתזת קולגן ספציפית לכונדרוציטים ו-S³⁵ sulfur עבור סינתזת פרוטאוגליקנים. דגרו את המבנים המסומנים רדיואקטיבית למשך 24 שעות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide כדי לקצור את מבני ההידרוג'ל המסומנים. השתמשו בפינצטה כדי לשטוף כל מבנה הידרוג'ל שלוש פעמים על ידי טבילה ב-PBS. כדי להסיר כל איזוטופ שלא נקשר, העבירו את המבנה השטוף למבחנה של 1.5 mL.בשלב הבא, הוסיפו 500 µL של תמיסת pape למבחנות בנפח 1.5 mL. הניחו אותן על בלוק חימום והמתינו להערכה (digestion) בטמפרטורה של 65 °C למשך 72 שעות. עם סיום תהליך ההערכה, הדגימה אמורה להיראות צלולה יחסית.מיד לאחר עיכול הפה, קחו מנות של 100 µL מכל דגימה כדי לקבוע את תכולת ה-DNA באמצעות בדיקת pico green D. לאחר מכן, קחו מנה של 100 µL מכל דגימה כדי לקבוע את הפעילות של האיזוטופ שהטמיע באמצעות ספירת ניצנוץ נזילה לבטא. יש לנרמל את פעילות האיזוטופ שהתקבלה ביחס לתכולת ה-DNA לצורך ניתוח.מבני הידרוג'ל aros של כונדרוציטים סחוסים של בקר, המורכבים מ-2% aros עם 10 × 10⁶ תאים למיליליטר של תאים encapsulated, עברו גירוי מכני באמפליטודה של 10% compressive strain בתדר של 1 Hz למשך 20 עד 60 דקות, או 1,200 עד 3,600 מחזורים. לאחר מכן, נמדדו תכולת ה-DNA וסינתזת המטריצה החוץ-תאית באמצעות שילוב רדיו-איזוטופים.כפי שניתן לראות כאן, סינתזת ה-DNA והמטריצה החוץ-תאית הושפעה באופן תלוי מינון. תכולת ה-DNA הראתה ירידה משמעותית של 35% כתוצאה מגירוי של 20 או 30 דקות, עם ערך p נמוך מ-0.01; גירוי של 60 דקות לא הראה השפעה. סינתזת קולגן ופרוטאוגליקנים ספציפיים לסחוס נקבעה על ידי שילוב של tritium, proline ו-S 35 sulfur, בהתאמה.אלה הראו עליות משמעותיות של כ-60% בתגובה ל-20 או 30 דקות של גרייה עם ערך p של פחות מ-0.01; 60 דקות של גרייה לא הראו השפעה ניתנית להבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לגרות באופן מכני תרביות הידרוג'ל באמצעות לחיצה דינמית, וכיצד להתאים פרוטוקול זה לשימוש ביישומים דומים.

mechanical-stimulation-of-chondrocyte-agarose-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מערכת 3D של האדם culturing chondrocytes במפרק ברמות גבוהות של נוזל סינוביאלי מתואר. הנוזל הסינוביאלי משקף את microenvironment הטבעי ביותר עבור הסחוס במפרק, וניתן להשיג בקלות ומאוחסנים. מערכת זו ולכן יכול לשמש ללימוד התחדשות הסחוס ועל הרפוי ההקרנה לטיפול בדלקת מפרקים.

מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי

עיצבנו bioreactor טעינה מכאני רומן שניתן להחיל מאמץ מכאני uniaxial או biaxial לbiocomposite סחוס לפני ההשתלה לתוך פגם סחוס במפרק.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

Bioprinter שימש ליצירה הידרוג דוגמת המבוסס על תבנית עולה. עובש poloxamer היה backfilled עם הידרוג'ל שני ולאחר מכן eluted, ומשאיר חללים שהיו מלאים בידרוג'ל שלישי. שיטה זו משתמשת elution המהיר וטוב של printability poloxamer לייצר ארכיטקטורות מורכבות מbiopolymers.

הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

תיקון סחוס מייצג אתגר רפואי שלא נענה וגישות מבוססות תאים להנדסת סחוס מפרקי אנושי הן פתרון מבטיח. כאן, אנו מתארים הידרוג'לים ביומימטיים תלת מימדיים (תלת מימדיים) ככלי אידיאלי להתרחבות והתבגרות של כונדרוציטים מפרקיים אנושיים.

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

פיגום הנדסת רקמות בזריקות מורכב פולי (N-isopropylacrylamide) סולפט -graft-כונדרואיטין (PNIPAAm-ז-CS) microparticles אלגינט המכילים הוכן. כוחו הדבק, נפיחות נכסים ב biocompatibility במבחנה מנותח במחקר זה. טכניקות האפיון שפותחו כאן עשויות לחול על מערכות thermogelling אחרות.

סינתזה של Thermogelling midi (N-isopropylacrylamide) מרוכבים -graft-כונדרואיטין סולפט עם אלגינט microparticles עבור הנדסת רקמות

לחץ מכני יכול לגרום להתמיינות כונדרוגנית של תאי גזע, ולספק גישה טיפולית פוטנציאלית לתיקון סחוס פגום. אנו מציגים פרוטוקול לגרימת התמיינות כונדרוגנית של תאי גזע שמקורם בשומן (ASCs) באמצעות כבידה צנטריפוגלית (CG). ויסות מוגבר המושרה על ידי CG של SOX9 מביא להתפתחות פנוטיפים כונדרוגניים.

Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

מאמר זה מספק שיטות מפורטות לגבי בדיית ואפיון מכשיר מיקרופלואידיג בעלי דלקת ריאות לדחיסת כונדרוציט.

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג'ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.

היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים

מחקר זה מתאר שיטה לייצור ספרואידים כונדרוציטיים על ידי צבירת תאים לספרואידים בתנאי הדבקה נמוכה באמצעות כוח הכבידה, ולאחר מכן תרבית את הספרואידים המתקבלים במיני-ביוריאקטורים.

יצירת ספרואידים מכונדרוציטים שונים בתנאי הדבקה נמוכה תחת כוח הכבידה ומיני ביוריאקטורים תוצרת בית

חקור את השפעת העומס המכאני הדינמי על מטבוליזם של כונדרוציטים בהידרוג'ל אגרוז דו-ממדי. השיטה מאפשרת הערכת סינתזת קולגן ופרוטאוגליקנים בתרביות תלת-ממדיות.

גירוי מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose

גלה סרטונים נוספים