Name: הפקת אנטיגנים רקמות למבחנים פונקציונליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: למד הכנת תמציות רקמות אנושיות למבחנים פונקציונליים בתאי T. השיטה משתמשת בתערובת BAW ללא ממסים רעילים ומאפשרת מדידה מדויקת של תגובות תאי T ופרוליפרציה במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהבריאות האוסטרלית הלאומיות והמועצה למחקר רפואי (NHMRC # 559007) וסוכרת נעורי Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) ותכנית התשתיות התפעולית של הממשלה ויקטוריאני. אנו מודים לחברי צוות טום מנדל איילט להשתלות תכנית איילט הבידוד למתן רקמות האדם. רקמות אדם נאספו ושימוש באישור אתי מקומי (בית חולי סנט וינסנט HREC-הבריאות של סנט וינסנט 011/04 וHREC-135/08).

1. הכנת רקמת טחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההערה, כל החומר האנושי יש להתייחס כאל פוטנציאל מדבק וכל ההליכים צריכים להתנהל בקבינט זרימה למינרית שנייה ייצוגי. בעזרת מספריים ומלקחיים סטריליים, הסרת רקמת שומן וסיבית מסעיפי טחול (~ 1-2 סנטימטר בגודל) וחתוך אותו במידה של חומר הכמוסה החיצוני ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חתיכה קטנה (1-2 סנטימטר 3) של רקמת טחול ולמקם את כל חתיכה לתוך צינור סטרילי 50 מ&quot;ל פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Snap-להקפיא את החתיכות של רקמות על ידי טבילה בנוזל N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -80 ° C. פרוטוקול דומה מתאים לרקמות אחרות (הים). </li></ol> 2. הכנת איילט אנוש לאחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איוני תרבות בתקשורת CMRL. איסוף איונים בצינור תחתון 10 מיליליטר חרוטים ולשטוף פעמים ב PBS על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 1500 למשך 5 דקות. יוצק את PBS ולנקז את החיץ שיורית על ידי נחת הצינור ההפוך בקצרה על מגבת נייר. היזהר שלאכדי לסלק את האיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמרוקן, מחדש כובע צינור ונצמד הקפאה בחנקן נוזלי ובחנות -80 ° C. </li></ol> 3. הכנת תמצית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Baw תמהיל (10:30:60% v / v) וחנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מ-80 ° C. להפשיר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Baw מספיק קרה כקרח כדי לכסות את פיסת הרקמה. לאיים להשתמש 3-5 מ&quot;ל. לרקמת טחול להשתמש 10-20 מ&quot;ל תלוי בגודל של פיסת הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב homogenizer הרקמות. נקה ידי &#39;מאחד&#39; 10-20 מ&quot;ל של אתנול 70% / מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומוגני הרקמה בצרורות מרובות, לאחר ביצוע בדיקת homogenizer לתוך הצינור עם פתרון Baw רקמות ו. לשמור על הצינור בדלי קרח לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות homogenizer בין דגימות, על ידי מאחד 10-20 מ&quot;ל של אתנול 70% / מים ולאחר מכן חיץ Baw. זה מונע זיהום צולב של רקמה בין samples.Dismantleand נקי עם אתנול 70% / מים אחרינודואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תמצית מכילה חומר מסיס רק נדרשה, חובצה את תמצית רקמה הומוגני ב4000 סל&quot;ד בRT למשך 10 דקות. אם תמצית גולמית יותר נדרשת, להסתובב בסל&quot;ד 1000 בRT למשך 5 דקות. הטכניקה המתאימה ביותר לחילוץ החלבונים Baw המסיס תלויה בניתוח במורד הזרם של החלבונים. לשימוש במבחנים אימונולוגיים פונקציונליים אנחנו היינו מציעים שננסה לפרק את החלק המסיס באוריאת ז 8 כפי שמצאנו בעבר זה להיות נסבל היטב 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור נקי ולשים אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הריכוז של חלבון בתמצית באמצעות assay BCA או דומה. </li></ol> 4. הקפא תמציות ייבוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם המסה של חלבון הנדרש (כלומר, 100 מיקרוגרם לצינור), לדלל את homogenate בהתאם ולוותר aliquots ל5.0 כותרת המ&quot;ל סטרילי, פלקון (12x75 מ&quot;מ) צינורות. לעתים קרובות אנו משתמשים ב100 מיקרוגרם / צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1מחט סטרילית 8-20 מד מזרק לעשות 3 חורים בכובע של כל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפא צינורות או על ידי הצבתן בקרח יבש ל~ 10 דקות או במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך&gt; 1 שעה. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשים על lyophilizer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על הקפאה יבשה יותר ומאפשר לאזן (-100 ° C). זה לוקח בערך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לנפח, ייבוש בהקפאה יכול להסתיים בתוך 3 שעות אבל באופן שגרתי להשאיר הדגימות שלנו בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיומו של מחזור הייבוש, לכבות משאבת ואקום ולאפשר לחץ לאט לאט אל תוך החדר. הסר מדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע סטרילי, להסיר את המכסים המחוררים מהצינורות ולהחליף בחדשים (פלקון 352032). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות חנות ב -20 ° C. דוגמאות ניתן לשחזר בתרבית, או חוצצים אחרים, ולהשתמש בפונקציה או מבחנים ביוכימיים. </li></ol> 5. נציג תוצאות איור 1 מציג את ההכתמה של חלבוןנטען ג&#39;ל עם תמצית מרקמת לבלב מדולדל איון (שכותרת acinar) טחול ומטוהרים ואיי איוני אדם (שכותרת). התוצאות מראות ייצוג טוב של חלבונים בעלי משקל מולקולרי שונה לכל רקמות. הקיבולת של תמציות רקמה כדי לעורר שגשוג תאי T אנושי נבדקה באמצעות assay CFSE מבוסס התפשטות 7 (איור 2). PBMC משמש assay זה בודד מאדם עם סוכרת מסוג 1. עוצמת התגובה מתבטאת כיחס בין מספר תאים עמומים CFSE ל5000 CD4 +, תאי CFSE בהירים ללא אנטיגן: תאים עמומים CFSE ל5000 CD4 +, תאים בהירים CFSE עם האנטיגן מדגימות שלושה עותקים 7. התוצאות מראות חלשה, אבל, ריבוי זיהוי בתגובה לacinar (CD1 = 3.5) ותגובה חזקה לתמצית איון (6.8). נגיף שפעת מומת (CDI = 142.6) כלול כביקורת חיובית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> איור 1. ג&#39;ל חלבון. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> איור 2. תוצאות מבדיקת תפוצה CFSE מבוססת נגד acinar ותמצית איון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פרוטוקול זה פותח בגלל שרצינו להפיק תמצית מרקמה האנושית שהייתה חופשי מכימיקלים רעילים כגון חומרי ניקוי. באופן ספציפי יש לנו השתמשנו בו כדי להכין תמצית של רקמה האנושית שניתן להשתמש במבחנים של תפקוד מערכת חיסון של אדם במבחנה. תמציות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה באותה מידה יכולה להיות מחדש בכל מאגר ומשמשות לניתוחים ביוכימיים רבים, כגון כרומטוגרפיה סופגת מערבית או בנוזל. זה עושה את הטכניקה המתאימה ליישומים רבים במורד זרם הזה. <p class="jove_content" style=";text-align:right;...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל 12 75 צינורות קלקר סטריליים מ&quot;מ x </td><td> BD פלקון </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> כובעים לצינורות צינורות קלקר (לעיל) </td><td> BD פלקון </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מיליליטר צינורות סטריליים </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> כימיקלי Mallinckradt </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogenizer: PRO200 </td><td> Bio-אסטרטגיה </td><td> 01-01200 </td><td> 10 המ&quot;מ x 115 גנרטור משונן </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> 18-20 מד מחט סטרילית </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני CMRL-1066 </td><td> סיגמא </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> סיגמא </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1. ריאגנטים וציוד ספציפיים.

הפקת אנטיגנים רקמות למבחנים פונקציונליים

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

רבים מיעדי אנטיגן של תגובה חיסונית אדפטיבית, המוכרים על ידי תאי T, B ולא הוגדרו 1. זה נכון במיוחד במחל אוטואימוניות וסרטן 2. המטרה שלנו היא לחקור את האנטיגנים מוכרים על ידי תאי T אנושיים בסוג המחלה אוטואימונית 1 הסוכרת 1,3,4,5. כדי לנתח את התגובות אנושיות תא T נגד רקמות שבו אנטיגנים המוכרים על ידי תאי T אינם מזוהים פתחנו שיטה לחילוץ אנטיגנים חלבון מרקמה אנושית בתבנית תואמת עם מבחנים תפקודיים 6. תגובות בעבר, תאים-T לתמציות רקמות unpurified לא ניתן היו למדוד, משום ששיטות החילוץ להניב lysate שהכיל חומרי ניקוי שהיו רעילים לתאי דם היקפי אדם mononuclear. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ חלבונים מרקמות אדם בתבנית שאינה רעיל לתאי T אנושיים. רקמת homogenized בתערובת של, אצטוניטריל butan-1-ol וואטאה (Baw). ריכוז החלבון בתמצית הרקמה נמדד ומסה ידועה של חלבון aliquoted לתוך צינורות. לאחר חילוץ, הממסים האורגניים יוסרו על ידי lyophilization. תמציות רקמות Lyophilized ניתן לאחסן עד נדרשים. לשימוש במבחנים של תפקוד מערכת חיסוני, השעיה של תאי חיסון, בתקשורת התרבות המתאימה, ניתן להוסיף ישירות לתמצית lyophilized. ייצור ציטוקינים ושגשוג על ידי PBMC, בתגובה לתמציות שהוכנו באמצעות שיטה זו, נמדדו בקלות. לפיכך, השיטה שלנו מאפשרת הכנה המהירה של lysates רקמות האנושיים שיכול לשמש כמקור לאנטיגנים בניתוח של תגובות תא T. אנו ממליצים כי שיטה זו תאפשר הניתוח של תגובות חיסוניות מסתגלות לרקמות בהשתלה, סרטן והתפתחות מחלה.

פרוטוקול פשוט להכנת תמציות של רקמה אנושית שתשמש כמקור לאנטיגנים במבחנים תפקודיים תא T מתואר. שיטה זו מאפשרת תגובות תא T לאנטיגנים המופקים מרקמות כדי להימדד<em&gt; במבחנה</em&gt;.

רבים מאותי האנטיגנים המשמשים כמטרה לתגובה החיסונית האדפטיבית, המזוהים על ידי תאי B ותאי T, טרם הוגדרו 1. הדבר נכון במיוחד במחלות אוטואימוניות...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין תמצית רקמה התואמת לבדיקות אימונולוגיות פונקציונליות. זאת על ידי איסוף דגימה של הרקמה הרלוונטית תחילה. לאחר מכן, יש לבצע הומוגניזציה לדגימת הרקמה בתערובת של butanol, aceto, nitrile ומים, או BAW.לאחר קביעת ריכוז החלבון, מחלקים את התמצית ומבצעים ליופיליזציה להסרת ממסים. בסופו של דבר, התמצית המשוחזרת משמשת כמקור לאנטיגן במבחני פרוליפרציה של תאי T אנושיים או במבחני הפרשת ציטוקינים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ליזיס באמצעות דטרגנטים, הוא שהתמצית נקייה מממסים ודטרגנטים רעילים.בפרוטוקול זה, יש להתייחס לכל החומרים האנושיים כבעלי פוטנציאל להדבקה, ויש לבצע את כל הפעולות בתוך מ chụp זרימה למינרית (lamina flow cabinet) מסוג class two. באמצעות מספריים ופינצטה סטריליים, הסר רקמת שומן ורקמה סיבית מנתחי טחול בגודל של כ-1 עד 2 סנטימטרים. גזז ככל הניתן מהחומר של הקפסולה החיצונית.גזרו חתיכות קטנות של רקמת טחול והניחו כל חתיכה בתוך מבחנת פלקון (Falcon) סטרילית של 50 milliliter. הקפיאו את חתיכות הרקמה על ידי טבילה בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. כדי להתחיל את ההליך להכנת איליות עין אנושיות לתרבית אחסון.את הלולאות (eyelets) במצע CMRL בטמפרטורה של 37 °C. אספו את הלולאות לשפופרת צנטריפוגה עם תחתית קונית בנפח 10 ml וסובבו ב-1,500 RPM למשך חמש דקות. השליכו את המצע ושטפו פעמיים ב-PBS; לאחר השטיפה השנייה.שפכו את ה-PBS ונקזו את הבאפר שנותר על ידי הנחת השפופרת ההפוכה לזמן קצר על נייר סופג. היזהרו לא להוציא את ה-eyelets ממקומם. לאחר הניקוז, סגרו את השפופרת, בצעו הקפאה מהירה (snap freeze) בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.להכנת תמצית רקמה, ראשית, הוצא מבחנה המכילה את הרקמה מטמפרטורה של 80- °C והבא אותה לטמפרטורת החדר. הרקמה תעבור הומוגניזציה בתערובת של בוטנול, אצטוניטריל ומים, או BAW, שהוכנה מראש ואוחסנה בטמפרטורה של 4 °C. הוסף כמות מספקת של BAW קר מהקרח כדי לכסות את פיסת הרקמה; עבור רקמת הטחול ששימשה בהדגמה זו, השתמש ב-10 עד 20 milliliters של BAW.הרכיבו את הומוגנייזר הרקמות. נקו את ההומוגנייזר על ידי הומוגניזציה של 20 milliliters של 70% ethanol במים. לאחר מכן, הכניסו את probe ההומוגנייזר למבחנה המכילה את הרקמה ואת תמיסת ה-BAW ובצעו הומוגניזציה לרקמה בפולסים מרובים.שמור את המבחנה בדלי מתאים לאחר מכן כדי למנוע זיהום צולב של רקמות בין הדגימות. נקה ביסודיות את ההומוגנייזר בין דגימות על ידי הומוגניזציה של 10 עד 20 milliliters של 70% ethanol במים, ולאחר מכן צנטריפוגה של באפר BAW. את תמצית הרקמה ההומוגניזית יש להחזיק בטמפרטורת החדר.אם נדרש תמצית המכילה חומרים ממיסים בלבד, סבב ב-4,000 RPM למשך 10 דקות. אם נדרשת תמצית גולמית יותר, סבב ב-1000 RPM למשך חמש דקות; לאחר הצנטריפוגציה, העבר את העלייה (supernatant) למבחנה נקייה והנח אותה על קרח. ריכוז החלבון בתמצית נקבע לאחר מכן באמצעות BCA או בדיקה דומה.השלב החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא מדידה מדויקת של ריכוז החלבון בתמצית, על מנת שניתן יהיה לבצע ליופיליזציה לנפח מתאים של התמצית. כדי להגיע למסה הרצויה של חלבון לייבוש בהקפאה, יש לדלל תחילה את ההומוגנאט בהתאם לכמות החלבון הנדרשת ולהעביר אליקוטים למבחנות סטריליות של 5 מיליליטר המסומנות בתווית. בדוגמה זו, הוקצו 100 micrograms של חלבון לכל מבחנה.השתמשו במחט סטרילית בכיול 18 עד 20 כדי ליצור שלושה חורים במכסה של כל מבחנה. הקפיאו את המבחנות על ידי הנחתן על קרח יבש למשך כ-10 דקות, הפעילו את המייבש בהקפאה (freeze dryer) והמתינו עד שיגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 100- מעלות צלזיוס. תהליך זה יארך כ-30 דקות. כאשר המייבש בהקפאה מוכן, הכניסו את המבחנות לתוכו והפעילו את משאבת הוואקום.בהתאם לנפח התמצית, ניתן להשלים את תהליך הייבוש בהקפאה תוך שלוש שעות, אם כי נהוג להשאיר את הדגימות למשך הלילה. לאחר סיום מחזור הייבוש, כבו את משאבת הוואקום והחזירו את הלחץ לתא באיטיות.הוצא את מדף המבחנות בתוך מ 빠르게 סטרילי. הסר את הפקקים המנוקבים מהמבחנות והחלף אותם בפקקים חדשים. אחסן את המבחנות בטמפרטורה של 20- °C.ניתן להחזיר את הדגימות מאוחר יותר למצבם המקורי בתרבית, במדיה או בבפפרים אחרים ולהשתמש בהם עבור בדיקות ביוכימיות תפקודיות. איור זה מציג את צביעת ג'ל חלבונים שהועמסו בו תמציות מרקמת לבלב נטולת איים מהטחול ואיים אנושיים מנוקים. תוצאות אלו מראות ייצוג טוב של חלבונים במשקלים מולקולריים שונים עבור כל רקמה; נבדקה היכולת של תמציות איים ו-asana לעורר פרוליפרציה של תאי T אנושיים באמצעות בדיקת פרוליפרציה שבה סומנו תאי PBMC (תאים חד-גרעיניים מדם פריפרי) בצבע הפלואורסצנטי CFSE; תאים שעברו פרוליפרציה בתגובה לאנטיגן, אשר הובילה להפחתה בעוצמת ה-CFSE, נמדדו ישירות באמצעות ציטומטריה של זרימה.תאי ה-PBMC ששימשו בדוגמה זו בודדו מאדם הסובל מסוכרת מסוג 1. עוצמת התגובה של תאי ה-C בוטאה כיחס בין מספר תאי ה-CFSE dim לכל 5,000 תאי CD4 חיוביים מסוג CFSE bright ללא אנטיגן, לבין מספר תאי ה-CFSE dim לכל 5,000 תאי CD4 חיוביים מסוג CFSE bright עם אנטיגן, מתוך דגימות שנערכו בשלוש חזרות. התוצאות מראות שגשוג חלש אך ניתן לזיהוי בתגובה ל-Asana, עם מדד חלוקת תאים או CDI של 3.5.נצפתה תגובה חזקה יותר לתמצית ה-eyelet עם CDI של 6.8; נגיף שפעת מנוטרל נכלל כביקורת חיובית לאחר הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון Ali Spot או e Iza, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו ציטוקינים מופרשים בתגובה לאנטיגנים המופקים מרקמות.

extraction-of-tissue-antigens-for-functional-assays

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול להכנת חזקים, בקנה מידה קטן תמציות הלה גרעיני מתואר. פרוטוקול זה הוא בעל ערך עבור מבחני הדורשים שימוש של אוכלוסיות קטנות של תאים, כגון תאים שטופלו בתרופות או RNAi. השיטה צריכה להיות ישים למגוון רחב של ביטוי גנים מבחני סוגי תאים אחרים, כולל תאים חולים.

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת ELISpot כדי להעריך את תפקודם של תאי B מפרישי נוגדנים, ASC. הנוגדנים המופרשים על ידי ASCs אינטראקציה עם מקטעי נוגדנים רב-שבטיים הקשורים לקרום, אשר מזוהים על ידי נוגדני IgG או IgM מצומדים אנזים. הכתם הצבעוני שנוצר בכל באר מעיד על נוכחות איזוטיפ של הנוגדן הספציפי, אשר נמצא בקורלציה עם פעילות ההפרשה של תאי B.

הערכה תפקודית של תאי B מפרישי נוגדנים באמצעות בדיקת ELISpot

אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי ומפורט לצביעה חיסונית כפולה בחלקי רקמת מערכת העצבים המרכזית של חולדה (CNS) ובלוטות הלימפה ההיקפית (LN) קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

מחקר סרטן תרגומי תלוי במיצוי רקמות אנושיות. עבודה רבה הושקעה באופטימיזציה של שיטות מיצוי לניתוח ex vivo. כאן, אנו מתארים שיטות עיבוד רקמות המאפשרות פלט נתונים מקסימלי מדגימות מוגבלות.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

שיטה פשוטה אך יעילה המעסיקה חלקיקים מגנטיים כדי לזהות ולהעשיר תאי B-reactive אנטיגן לניתוח פונקציונלי פנוטיפי מתואר.

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

אי-התאמות לויקוציטים אנושיים רצפים אנטיגן (הלע) בין תורם איברים זוגות הנמענים הם הגורם העיקרי של דחיות בתיווך נוגדנים השתלת איברים. כאן אנו מציגים את השימוש מערכים אנטיגן מותאמות אישית המבוססות על רצפים התורמים הבודדים הלע כדי לחקור התורם אנטי alloantibodies הלע ב עוגב נמענים.

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

אנו מתארים שיטת הצביעה מהירה לביצוע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

בדיקות חיסוניות מבוססות דם מלא מספקות כלי קל וחסכוני במשאבים לניתוח חסינות ספציפית לאנטיגן למטרות אבחון ומחקר. מאמר זה מספק פרוטוקול אופטימלי מבוסס דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח מקיף של חסינות המאכסן לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים, כולל גרסה בנפח נמוך עבור חולים ילדים ובעלי חיים קטנים.

בדיקת דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח ספציפי לאנטיגן של חסינות המארח לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

למד הכנת תמציות רקמות אנושיות למבחנים פונקציונליים בתאי T. השיטה משתמשת בתערובת BAW ללא ממסים רעילים ומאפשרת מדידה מדויקת של תגובות תאי T ופרוליפרציה במעבדה.

הפקת אנטיגנים רקמות למבחנים פונקציונליים

גלה סרטונים נוספים