גישור ממשק ביו אלקטרונית עם Biofabrication

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבצע שיקוע חשמלי של סרטי ביו-פולימרים ולפונקציונליזציה שלהם באמצעות רכיבים ביולוגיים כגון חלבונים ותאים. שיקוע חשמלי מושג על ידי ניצול שינוי ה-pH המתרחש באופן מקומי באלקטרודה תחת מתח, בשילוב עם תמיסת פוליסכריד המגיבה ל-pH. לאחר בחירת אסטרטגיית שיקוע קתודית או אנודית, מופעל מתח על האלקטרודה כדי לעורר מעבר מסול ל-ג'ל, אשר יוצר סרט דק בעל תבנית המוגדרת על ידי הגאומטריה החשמלית.

יתרה מכך, ניתן להחדיר רכיבים ביולוגיים כגון חלבונים ותאים לאורך תהליך השקיעה על האלקטרודה. על מנת לבצע פונקציונליזציה ביולוגית של הסרט, התקבלו תוצאות המראות, על בסיס דימוי פלואורסצנציה, כי הרכיבים הביולוגיים ממוקמים על הסרטים. בנוסף, הרכיבים הם פונקציונליים ומסוגלים לקיים אינטראקציה עם סביבתם, כפי שהודגם באמצעות זיהוי אלקטרוכימי של פעילות אנזימטית ושימוש בתגובה של תאי דגמה (reporter cells).

ביו-פבריקציה (Biofabrication) מספקת ארגז כלים חדשני לבניית הממשק שבין ביולוגיה לאלקטרוניקה. אנו מאמינים שיתרונותיה העיקריים הם הפשטות שלה והיכולת לבצע הרכבה בתנאים קרובים לתנאים פיזיולוגיים. הביולוגיה מומחית בייצור בקנה מידה ננומטרי באמצעות הרכבה עצמית ואמצעים אנזימטיים. על ידי גיוס יכולות אלו, אנו עוקפים שיטות סינתזה מורכבות, מסוכנות וגוזלות זמן שנעשה בהן שימוש בטכניקות הרכבה אחרות.

הצוות השיתופי שלנו קיבל את הרעיון לבנות את ממשק מכשיר ה-BioD באמצעות חומרים ומנגנונים ביולוגיים כאשר הבחנו שניתן לשקע את הקיטן (kitan) שלהם באמצעות אלקטרודות. קיטן הוא פוליסכריד היוצר סרט המגיב ל-pH, שיכול לזהות אותות חשמליים המופעלים על ידי המכשיר ולהשקיע כשכבה דקה. ברגע שראינו שניתן לשקע קיטן באמצעות אלקטרודות, הבנו שנוכל לגשת למערך רחב יותר של כלים מהביוכימיה ומהביולוגיה המולקולרית כדי לבנות את ממשק מכשיר ה-BioD.

יישום של טכניקה זו מתרחב למערכי מעבדה על שבב (lab-on-chip) שבהם נדרשים רכיבים ביולוגיים תפקודיים, שכן היא מספקת דרך זולה ופשוטה למיקום רכיבים אלו על אלקטרודה שבה הם יכולים להישאר חיוניים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שסרט ביו-מיוצר עלול להיות עדין ולהינזק בקלות. לפיכך, יש להיזהר שלא לפעול בצורה חריפה מדי בעת שטיפת הסרט או צילומ האופטי שלו.

ייתכן שהסרט יהיה רגיש להפרעות בקלות. עם זאת, כיתרון, ניתן להשתמש באלקטרודות שוב מכיוון שהסרט מוסר בקלות. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, חברו ספק כוח לאלקטרודות שהיוצרו בהתאמה אישית באמצעות כבלי חיבור ותפסים מסוג תנין.

שקופית זכוכית מצופה אינדיום-בדיל-תחמוצת (ITO) תשמש כאנודה או כאלקטרודה העובדת, ורדיד פלטינה ישמש כקתודה או כאלקטרודת נגד. מקמו את האלקטרודה כך שהמשטח של ה-ITO שיופעל פונקציונלית יהיה מול אלקטרודת הנגד, באופן שבו משטח ה-ITO ממוקם באופן אנכי כדי לטבול אותו בתמיסה, או באופן אופקי, כך שהתמיסה תוכל להישמר על פני השטח. לאחר מכן, הכינו תמיסת שיקוע אלגינאט על ידי ערבוב של 1% alginate ו-0.5% calcium carbonate במים מזוקקים ועקירה של התערובת באוטוקלב. לאחר מכן, סמנו את האלגינאט באופן פלואורסצנטי באמצעות Fluor spheres על ידי ערבוב וערבוב במכשיר וורטקס.

פעולה זו תאפשר דימוי פלואורסצנציה של הסרט שהתקבל. לאחר עיקור באוטוקלאב, טבול את שתי האלקטרודות בתמיסת השיקוע שהוכנה והחל צפיפות זרם קבועה של 3 A/m² למשך שתי דקות. המתח ישתנה בטווח של 2 עד 3 V. לאחר שתי דקות, נתק את האלקטרודה והסר את תמיסת השיקוע. שטוף בעדינות את הסרט בתמיסת sodium chloride כדי להסיר alginate עודף.

דגרו את הסרט לזמן קצר בסידום כלוריד 0.1 molar כדי לחזק את הג'ל. לאחר מכן, דגרו את הסרט בתמיסת האחסון הרצויה. המשיכו לדמיון של הסרט באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לפני השקיעה המשותפת.

גדלו תרבית תאי משדרים ותרבית תאי קולטנים כפי שהודרך בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. לאחר מכן, הכינו תמיסת שיקוע של alginate וסידן פחמתי (calcium carbonate). ערבבו את התמיסה עם כל אחת מתרביות התאים ביחס של אחד לאחד, עד לריכוז סופי של 1% alginate ו-0.5% calcium carbonate, כאשר התאים מדוללים לכמחצית מצפיפות הגידול.

השתמשו בلامיקה של זכוכית עם תבנית של שתי אלקטרודות ITO המוקפות בבאר של poly dimethyl silane ואלקטרודת פלטינה נגדית. חברו אלקטרודת ITO אחת ואת אלקטרודת הפלטינה לספק כוח. כפי שנעשה קודם לכן, טבלו את האלקטרודות בתמיסת השקיעה המכילה את תאי המקלט.

כוון את ספק הכוח לזרם קבוע בצפיפות של 3 A/m², כאשר ממד שטח הפנים מוגדר על ידי האלקטרודה הבודדת שבה תתרחש השקיעה. החל את הזרם למשך שתי דקות כדי לאפשר שקיעה משותפת (co-deposition) של התאים במטריצת האלגינאט. שטוף את הסרט בתמיסת sodium chloride כפי שנעשה קודם לכן, והעבר את חיבור הקתודה לאלקטרודת ה-ITO הסמוכה.

חזור על תהליך ההשקעה, אך הפעם הכנס את התמיסה המכילה את תאי השליחה (sender cells). דגירה את השבב בעל שתי האלקטרודות, המכיל את התאים שהושקעו במקביל ואת ה-calcium argenate, למשך לילה בטמפר פוספט (phosphate buffered saline) ב-37 degrees Celsius.

מועשר ב-10% LB media וב-1 millimolar calcium chloride. לאחר הדגירה, דמיינו את השבב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי להתחיל בשיקום אלקטרודת קיטוזן. חברו את ספק הכוח לאלקטרודות.

חברו את תמבקי האליגטור. שבב סיליקון מצופה זהב ישמש כקתודה ורדיד פלטינה ישמש כאנודה. מקמו את פני השטח של אלקטרודת הזהב כך שהיא תהיה מול אלקטרודת העזר כפי שבוצע קודם לכן.

הכינו תמיסת Kato sand על ידי ערבוב של שבבי Kato sand במים והוספה איטית של חומצה כלורית בריכוז two molar כדי להמיס את הפוליסכרידים. בהתאם לנוהל המוזכר בטקסט, ניתן לסמן את תמיסת ה-Kato sand באופן פלואורסצנטי כדי לדמות את השכבה השקועה על האלקטרודה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר מכן, הניחו את האלקטרודות בתוך תמיסת ה-kaizan, כאשר האזור המיועד לשיקוע שקוע לחלוטין.

במשך שתי דקות יש להחיל זרם קבוע שחושב על בסיס צפיפות של ארבעה אמפר למטר רבוע, בהתבסס על שטח הפנים של האלקטרודות העובדות. במקרה זה, זרם של 16 microamps מוחל על אלקטרודת זהב של ארבעה מילימטר רבוע; המתח ישתנה בטווח של שניים עד שלושה וולט. לאחר מכן יש לשטוף את האלקטרודה במים דאיוניים להסרת כיטוזן עודף. המשך לדמות את הסרט באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, כאשר כיטוזן ו-glucose oxidase הופקדו מתוך תמיסה בצפיפות זרם של ארבעה אמפר למטר רבוע על אלקטרודה תבניתית.

בהתאם לנוהל השקיעה של אלקטרודת ה-Chitosan, ייווצר סרט kaizan הלוכד glucose oxidase. חברו את האלקטרודה המטופלת למערכת של שלוש אלקטרודות כאלקטרודת העבודה, חוט פלטינה כאלקטרודת העזר וכסף/כסוף כלורי כאלקטרודת הייחוס, טבלו את האלקטרודות לתוך תמיסת בופר פוספט המכילה sodium chloride. בצעו צימוד אלקטרוכימי של החלבון לסרט ה-Kazam על ידי הפעלת מתח קבוע למשך 60 שניות באמצעות chrono pyrometry לאחר הצימוד.

הנח את השבב בבופר פוספאט ושטוף במשך 10 דקות על שייקר אורביטלי כדי להסיר נתרן כלורי שאינו פעיל וגלוקוז אוקסידאז שאינו מצומד. חבר מחדש את מערכת שלושת האלקטרודות וטבול אותה בתמיסה של 5 millimolar גלוקוז. לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים הרצויים עבור טלמטריית וולטמטריה מחזורית כדי לסרוק את הפוטנציאל בכיוון חיובי עד 0.7 volts.

הוצא את האלקטרודות מתמיסת הגלוקוז ושטוף אותן בבופר פוספט. לאחר מכן, הנח את האלקטרודות בתוך כלי כימי של 10 מיליליטר המכיל שמונה מיליליטר של בופר פוספט על גבי פלטת ערבוב מגנטית. כוון את השבב הפונקציונלי עם GOX ל-0.6 וולט כדי שישמש כאלקטרודת העבודה.

לאחר הגדרת הפרמטרים הרצויים, בצעו הקלטת בסיס (baseline). הוסיפו מנות (aliquots) של גלוקוז לתמיסת הבאפר כדי להעלות את ריכוז הגלוקוז ב-4 millimolar עבור כל מנה. בניסוי זה, מתווספות לתמיסת הבאפר מנות של 400 µL של גלוקוז בריכוז 80 millimolar. קשרו את תפוקת הזרם לכל ריכוז של גלוקוז. כדי ליצור עקומת סטנדרט לביצוע פונקציונליזציה של חלבון, השתמשו בנחית זכוכית בעלת תבנית של אלקטרודות זהב ו-ITO סמוכות המצויות בתוך A-P-D-M-S.

יש להטיל מתח קיטוב קתודי על אלקטרודת הזהב כדי לשקע את הטיטן (tizen) כפי שהודגם בעבר. לאחר שטיפת הסרט, יש להוסיף תמיסה של auto inducer two synthase המסומנת בفلורסצנציה כחולה ומועשרת בטיירוזינאז (tyrosinase). לאחר דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר.

שטפו את הקרום ב-PBS כפי שנעשה קודם לכן, והפילו פוטנציאל אנודי על אלקטרודת ה-ITO הטבולה בתמיסת שיקוע אלגינאט המכילה תאי מקלט. המשיכו באותם שלבים שתוארו בשקיעה המשותפת של אוכלוסיות תאים באלגינאט כדי להפיק את האות המועבר באופן אנזימטי. לאחר שטיפת הקרומים, הוסיפו תמיסה של 5 µM SAH ו-PBS מועשרים ב-10% LB media וב-1 mM.

כסו את האלקטרודות בסידן כלורי (Calcium chloride) כדי למנוע התאיידות של התמיסה והדגרירו למשך לילה ב-37 °C. פעולה זו תאפשר תגובה של תא מקלט על ידי ייצור של חלבון פלואורסצנטי אדום DS red; ניתן לדגום אלקטרודות סמוכות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על ידי כיוון המסננים ללכידת הפלואורסצנציה הכחולה של inducer two synthase והפלואורסצנציה האדומה המובעת על ידי תאי המקלט שגויסו. אותות חשמליים יכולים ליצור מיקרו-סביבות מקומיות סמוך לפני השטח של אלקטרודה, וגירויים אלו יכולים להפעיל הרכבה עצמית של פוליסכרידים כגון alginate ו-razan, שישקעו כשכבת הידרוג'ל על פני השטח של האלקטרודה.

מכיוון שמעבר זה ממצב של תמיסה (sol) למצב של ג'ל (gel) מתרחש על פני השטח של האלקטרודה, הסרט המתקבל מקבל כתובת חשמלית כאשר הגיאומטריה שלו תואמת את תבנית האלקטרודה. באמצעות אלגינאט, אוכלוסיות תאים ייחודיות הופקדו במשותף בכתובות נפרדות. ראיות לכתובת האלקטרודית שלהן נצפות בעת אינטראקציה בין אוכלוסיית תאי השולח לאוכלוסיית תאי המקבל.

המולקולה auto inducer two מפיצה את עצמה מתאי השליחה ונספגת על ידי תאי הקליטה, מה שמוביל לביטוי של החלבון הפלואורסצנטי DS red. כאן, פלואורסצנציה אדומה נצפית רק באלקטרודה שבה פונים לתאי הקליטה. לעומת זאת, האנזים לביו-חישוף glucose oxidase מאפשר זיהוי של גלוקוז באמצעות תגובה אנזימטית המייצרת מימן פראוקסיד, אשר ניתן לאחר מכן לחמצן באופן אלקטרוכימי כדי לייצר זרם פלט.

בדרך זו, ניתן להמיר אות כימי לאות חשמלי. גרף זה מראה כי שכבות שבהן Geo X היה מצומד כימית מייצרות אות אנטי חזק בנוכחות גלוקוז, בניגוד לשכבות שאינן מכילות Geo X. תוצאות אלו מעידות על כך שניתן להרכיב את Geo X על גבי שכבת zam שהורגשה ושהוא שומר על פעילות קטליטית. יתרה מכך, נוצרת עלייה מדורגת בזרם האוטי בתגובה לריכוזים עולים של גלוקוז.

עקומת הסטנדרט המוצגת מראה כי העליות השלביות התקדמו באופן כמעט ליניארי, בהתאם לכמות הגלוקוז שהוספה. תוצאות אלו מראות כי האנזים שומר על רגישותו גם לאחר הצמדה לסרט ה-Razza כפי שמתואר כאן; ה-I two synthase כולל תג Penta tyrosine. Tyrosinase פועל על תג הטירוזין ומחמצן את קבוצות הפנול של השאריות ל-o quinones, אשר נקשרות לאחר מכן באופן קוולנטי לקבוצות האמין של ה-kazan. עדות לפונקציונליזציה של סרט ה-Kazam ב-a i two synthase באמצעות הרכבת Tyrosinase נראית בתמונת פלואורסצנציה זו, המציגה סרט kaza על זהב, שבו ה-I two synthase הפונקציונלי סומן בפלואורסצנציה בכחול. מכיוון ש-a I two synthase מייצר a I two מהסובסטרט SAH באותו אופן שבו עושים זאת תאי השליחה (sender cells), קרבתו לתאי מקלט (receiver cells) שגויסו בנוכחות SAH גורמת גם לתאי המקלט להגיב בפלואורסצנציה על ידי ביטוי של ds.

פלואורסצנציה אדומה של תאי המקבל מדגימה שוב אינטראקציה בין הכתובות עקב דיפוזיה של ai, משניים לאחד, ומצביעה עוד על כך שהאנזימים המקובעים ל-tizen שומרים על פעילותם לאחר קישור קוולנטי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשקיע אלקטרולית סרטי פוליסכריד וכיצד לבצע להם פונקציונליזציה באמצעות מגוון טכניקות. הדגמנו את הגמישות בשלבי פונקציונליזציה אלו, המאפשרת לנו לעבוד עם מגוון רחב של רכיבים ביולוגיים בבדיקות המשך.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה תוך דקות ספורות בלבד כדי ליצור תבניות סרט דקות מוגדרות היטב, עליהן ניתן להשרשב רכיבים ביולוגיים בדיוק רב. בדרך זו, אנו יכולים לייצר בקלות רבה משטחים פעילים בעלי תבניות ביולוגיות על אלקטרודות ייעודיות, באופן מאורגן ובמקביל להשגת אינטראקציות ביולוגיות מורכבות. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להפעיל יצירתיות הן בתכנון מערך האלקטרודות והן בבחירת הרכיבים הביולוגיים כדי להשיג את האינטראקציה המתוכננת.

תקוותנו היא שכלי הביו-פבריקציה יגשרו בין שני תחומים נפרדים, ביוטכנולוגיה ומיקרו-אלקטרוניקה, שכל אחד מהם חולל מהפכה בחיינו באופן עצמאי. אנו מאמינים כי באמצעות יצירת ממשק בין שני תחומים אלו, נפתח פתרונות חדשים לכמה מהבעיות הדחופות ביותר של החברה. לדוגמה, אנו צופים כי הביו-פבריקציה עשויה לספק שיטות פשוטות ורב-גוניות לדרכים חדשות של חישוש, עבור בדיקות בנקודת הטיפול (point of care), אבחון מחלות וזיהוי איומים ביולוגיים וכימיים.

דוגמה אחת בעלת השפעה רחבה עשויה להיות תסמיך עורקי (stent) מהדור הבא, שיהיה מסוגל לנטר את הפרופיל המטבולי שלך ובמקביל לשמור על העורק פתוח.