Name: תרבויות Explant עצביות מן Xenopus laevis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: למד שיטת תרבות אקספלנטים עצביים מעוברי Xenopus laevis לצורך הדמיית דינמיקת ציטוסקלט בקונוסי צמיחה באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנץ ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לבוב פרימן לאימונים וקירשנר המעבדה לשימוש במתקן הצפרדע, וחברי מעבדת Vactor אן על תמיכה. אנו מודים לניקון מרכז ההדמיה בבית הספר לרפואה ברווארד לקבלת סיוע במיקרוסקופ אור לתמונות באיור 1. עבודה זו מומנה על ידי הבא: NRSA NIH המלגה ומלגת K99-NIH לאל, מדע בסיסי שותפות מימון <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">(https://bsp.med.harvard.edu/)</a> לAEF, וNIH RO1 NS035909 לDVV

הערה: אנו מתארים את השלבים בשני הסעיפים הראשונים רק בקצרה, כמו פרוטוקולים מצוינים עם מידע מפורט שפורסמו במקומות אחרים המתמקדים באופן ספציפי יותר בשלבים הבאים (לדוגמה 8-12). בנוסף, הפרוטוקול הכללי של עבודה עם תאי עצב בעמוד שדרת Xenopus בתרבות תא החייה כבר פורסם בעבר במאמר שיטות מפורט 8. אנו ממליצים בחום לבדוק את המאמר כהשלמה לסרטון הזה, למרות שכאן אין לנו לספק מספיק מידע כדי לבצע בהצלחה ולפתור את הנתיחה העצבית צינור ופרוטוקול ציפוי בשלב 3. 1. הפריה במבחנה של Xenopus ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ביצים מצפרדעים נשיות שהוזרקו כוריוני 12-18 שעות גונדוטרופין (400 יחידות / צפרדע) לפני איסוף הביצים. איסוף ביצים בפתרון של 1X מארק השתנה רינגר (MMR) (0.1 מ &#39;NaCl, 2.0 mM KCl, 1.0 mM 4 MgSO, 2.0 mM CaCl 2, HEPES 5.0 מ&quot;מ, pH 7.4 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפרות ביציות במבחנה עם אשכים טחונים, כפי שתואר לעיל 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי לפחות 20 דקות, הסר את מעייל ריבת עובר על ידי עוברים דוגרים בציסטאין 2% ב1X MMR (הובא ל-pH 7.8 עם NaOH) במשך 3-5 דקות. לשטוף עם 0.1x MMR (או 0.1x MBS (המתכון השתנה של בארת&#39; המלוח, 1X: 88 המ&quot;מ NaCl, 1 המ&quot;מ KCl, 0.7 המ&quot;מ CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2.5 המ&quot;מ 3 NaHCO, 5 HEPES מ&quot;מ, pH 7.8)) 3 -5 פעמים, ולשמור על עוברים בטמפרטורת חדר עד לזריקות, או אם ירצו, עוברי מקום ב14-18 מעלות צלזיוס להאט פיתוח. </li></ol> 2. Microinjection של רנ&quot;א הערה: בעוד שאנו מנצלים הזרקת RNA כאן, טכניקות אלה אינן מוגבלות לRNA, ו-DNA, חלבונים, חומצות גרעין או שונות למניפולציה גנטית יכול לשמש גם וכבר תארו בעבר 12. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניסוי, RNAs עבור תיוג מבני cytoskeletal או אחרים arדואר משועתק מתבניות DNA לינארית באמצעות mMessage mMachine הערכה (Ambion). mRNAs דורש &#39;כובע ו3&#39; 5 זנב polyadenylation לקדם תרגום ותמנע פגיעה בעוברים. pCS2 + הוא וקטור נפוץ בשימוש למטרה זו, וערכת השעתוק כוללת אנלוגית כובע במהלך תגובת הסינתזה. אנחנו מחדש להשעות mRNA תומלל בnuclease ללא DDH 2 0, בריכוז מניות בין 500 ל -2000 ng / μl, ואחרי האחסון מהיר ב-80 ° C. לפני הזריקה, לדלל RNA בDDH 2 0 לריכוז המתאים להזרקה. כפי שהזריק נפח קטן בלבד לעוברים, resuspending במאגר אינו הכרחי. ריכוז הזריקה הסופית שלנו הוא בדרך כלל 50-200 pg / nl, תלוי במבנה, ואנחנו בדרך כלל תהיינה להזריק עד 4 nl לעובר, אם כי מעבדות רבות באופן מסורתי להזריק עד 10 nl, אשר הוא כ 1% מהנפח הכולל של עובר. RNA יכול להיות רעיל במינונים גבוהים, והמנה כל סוגי עוברlly נע בין 10 pg לng 1, אם כי עד 5 ng יכול להיות נסבל תלוי בגן ובטהרה בפרט. עם זאת, ללוקליזציה חלבון הדמיה, הרמה הנמוכה ביותר האפשרית צריכה להיות מוזרקת למנוע לכלוכים על ביטוי. רנ&quot;א לEB1-GFP בפרוטוקול זה משמש בסכום סופי של 250 עמ &#39;לעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחטי הזרקה על ידי משייכת נימים עם מחט 9 חולץ, לקוטר קצה ~ 0.2 מיקרומטר. עם P-87 חולץ סאטר, אנו משתמשים בהגדרות הבאות: החום 644, משיכה 125, מהירות 70, זמן 250, אבל פרמטרים אלה משתנים בהתאם למכונה ויש סדרו לאחר שינוי הנימה (אנו משתמשים כיום 2.5 מ&quot;מ נימת תיבה מרובעת שהיא 2.5 מ&quot;מ רחב). תחת מיקרוסקופ, לשבור מחט קצה עם מלקחיים בזווית כדי ליצור צורת נוצה, כמו. ישנן שיטות אחרות לשבירה ומילוי מחטי הזרקה (לדוגמה 11,12), אבל אנחנו ממלאים את המחט עם רנ&quot;א ידי הצבת ירידה קטנה (0.5 - μl 1) לקצה האחורי שלמחט. לmicroinjecting לעוברים, יש מספר מערכות הזרקה זמינות מסחרי, שתיים מן שכיח ביותר להיות פיק ההזרקה (מערכות רפואיות), וNanoject (דראמונד המדעי) (ראה עמוד 11 למידע נוסף). אנו משתמשים במערכות הרפואית PLI-100 Pico-Injector, שמשתמש בגז דחוס לתקופה מוגדרת של זמן דיגיטלי כדי לספק כרכי nanoliter עקביים. נפח הזרקה חייב להיות מכויל לכל micropipette החדש באמצעות מיקרומטר במה, וזמן הזרקה צריך להיות מותאם להשגת כמות רצויה של רנ&quot;א המוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מופרה עובר ב1 - לשלב 4-תא לתוך צלחת פלסטיק המכילה Ficoll 5% בMMR 0.1x. מחזיק את העובר במקום עם מלקחיים, או הצבה בפלטפורמה מחזיקה (רשת פלסטיק, עם רשת ~ 1 מ&quot;מ, דבקה בתחתית הצלחת בפלסטלינה או שעוות שיניים), להזריק לעצמה רצויה לסטומרים בעלי חיים (ראה שלב 2.1 לפרטים בדבר היקפי הזרקה). להפיץ בכמה locations ברחבי עובר, זריקה אחת לפחות לכל אחד מבעלי חי לסטומרים, לקבל התפלגות אחידה יותר (לדוגמה, לעובר בשלב 4-תא, אנחנו בדרך כלל להזריק 1-2 פעמים בכל blastomere, ואילו בשלב 2-תא עובר, אנחנו מזריקים 2-4 פעמים בכל blastomere). יתרון של מתנה עד שלב התא 2-4 הוא שאתה להבטיח את העובר החל לדבוק באופן נורמלי. עם זאת, אם הזמן הוא מהות, אתה יכול להתחיל בשלב 1-התא, עם הבדל קטן בתוצאה הסופית שאינן זקוקים יותר לעוברים להיות מוזרקים. עוברים בשלב בוגרים יותר יכולים לשמש גם כן, וזה שימושי במיוחד אם סוגי תאים ספציפיים ממוקדים להזרקה, אבל כמו שאנחנו מעדיפים בדרך כלל ביטוי רחב יותר, אנחנו מזריקים בעוברים צעירים כדי להפחית את הצורך בזריקות יותר רבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים הזריקו לצלחת פלסטיק המכילה MMR 0.1x ולאפשר להם להתפתח עד שלב 20-23 13. דגירת עוברים ב14-22 ° C בהתאם spe הרצויעורך של פיתוח. (לביתור צינורות עצביים למחרת, השתמש ~ 22 ° C. עבור היום אחרי, השתמש ~ 14 ° C.) </li></ol> 3. Dissection צינור עצבי וציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קודם לביצוע הניתוחים, להכין את מנות תרבות 14. ראשית, coverslips מעייל עם מספיק פתרון של 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פולי ליזין ב PBS לברכה על פני coverslip, של או מאטק או מנות תרבות Lab-Tek, ודגירה במשך שעה אחת (לחלופין, אפשר להשתמש בזכוכית יושבת coverslips רופף בצלחת פטרי, על מיקום מאוחר יותר בשקופיות זכוכית עבור הדמיה וimmunocytochemistry). לשאוב ולשטוף עם עודף של PBS 3 פעמים, ולתת להתייבש. אז מנות מעייל עם 10 מיקרוגרם / המ&quot;ל laminin ב PBS (אנחנו בדרך כלל להשתמש ב500 μl לcoverslip, מספיק לברכה שמעל פני השטח) למשך שעה ב37 מעלות. לשאוב פתרון laminin ולשטוף 3 פעמים עם עודף של PBS, נזהר שלא לתת למשטחים laminin מצופים נחשפו לממשק האוויר. Replacהדואר PBS עם תרבות אמצעי תקשורת (צלצול של 50%, L-15 תקשורת 49%, סרום שור עוברי 1%, בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין וgentamycin, pH 7.4 ומסנן מעוקר). (מדיה רינגר, 115 המ&quot;מ NaCl, KCl 2.5 מ&quot;מ, 2 המ&quot;מ CaCl 2, 10 mM pH Hepes 7.4, 0.5 המ&quot;מ EDTA). בעוד הפרוטוקול שלנו משתמש באמצעי תקשורת זה, יש לציין כי מדובר במועשר תקשורת משותפת לתרבויות גנגליון רשתית מבוגרות Xenopus, שבו תאי העצב הפחיתו אנרגיה שמורה. תרבויות בעמוד שדרה צעירות לשרוד ולגדול ליותר מ 24 שעות בתקשורת של האצבעות טהורות ללא גורמי צמיחה נוספים, וזה אכן אחד היתרונות של שימוש במערכת זו. אופציונלי: תוספת NT3 וBDNF (לריכוזים סופיים של כל 25 ng / μl) לתקשורת התרבות להגדיל תולדת האקסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל השונות בביטוי של mRNA המוזרק, עוברים עשויים להפגין פסיפס של קרינה. קודם לביצוע נתיחות, עובר מסך לנוכחות של קרינה, כדי לזהות העוברים האלה שEXPציידת חלבון היתוך הניאון בצינור העצבי. הנח עוברי ניאון בשלב 20-23 לתוך קערת פלסטיק agarose מצופה מלאה בתקשורת של שטיינברג (58 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 0.44 mM Ca (NO 3) 2, 1.3 המ&quot;מ 4 MgSO, 4.6 mM טריס, pH ל -7.8 אז autoclaved) 5. להכנת המנה agarose המצופה, מעייל התחתון של צלחת פלסטיק מומס עם 1% agarose ב0.1x MMR ובואו להתקשות. זה מספק משטח רך ולכן הניזק שאינו מתרחש למלקחיים העדינים ומחטי טונגסטן המשמשים במהלך שלבי נתיחה שלאחר מכן. הנתיחה של עוברים מעבר שלב 23 אפשרית, אבל זה מאתגר יותר כרקמות לדבוק באופן הדוק יותר זה לזה ולכן דורשות טיפול ארוך יותר עם collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת ביתור, להסיר את קרום vitelline עם מלקחיים עדינים, ואז לבודד את החלק הגבה כולו של העובר, על ידי ביצוע סדרה של חתכים. כשאתה יושב ומלקחיים להחזיק את העובר במקום, השתמש שני לעשות חתך עלצד של העובר על מנת לחשוף את הפנים החלולים. לאחר מכן, השתמש בשני המלקחיים לצבוט לאורך הרקמה בין שתי מחציות גב וגחון של העובר, כך גזירת העובר בחצי לבודד את החלק הגבה מכיל את הצינור העצבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח explant הגבה בצינור אפנדורף עם 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל collagenase בתקשורת של טיינברג לדקות 15-20 במסובב, כדי לשחרר את הרקמות, ולאחר מכן explant הגבה פיפטה לתוך צלחת פלסטיק agarose מצופה עם הפתרון של טרי שטיינברג. לחלופין, explant ניתן להציב בצלחת הפטר שמכילה תמיסת collagenase במשך 15 דקות, שבו כל הנתיחה ואז אפשר תהיה פועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מלקחיים, בעדינות לנתח את הצינור העצבי מהאפידרמיס הגבה וnotochord הגחון. חלק את קצה המלקחיים בין האפידרמיס והרקמה שמתחתיו ומושך באיטיות חזרה לאפידרמיס, וחושף את הצינור העצבי מתחת. לאחר מכן, השתמש 1 מלקחיים להחזיק את הרקמות ואחרות כדי להחליק את הקצה ביןצינור עצבי וnotochord. לבסוף, להשתמש במלקחיים כדי להסיר את somites בכל צד של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הצינור העצבי למנת agarose מצופה מלאה בתרבית, כמתואר בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי האוסף של מספר צינורות עצביים, לחתוך אותם לחתיכות רבות (כ 20, אם כל הצינור מבודד) באמצעות מחטי טונגסטן חדד או מלקחיים, ולאחר מכן את החלקים בצלחת מנות התרבות מלאה במדיום (מוכן בשלב 3.1), והוא מתפשט את explants באופן שווה בשורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי, אל תזוז את הכלים כי זה יפריע לתאים הקשורים. דגירת explants הצינור העצבי מצופה סביב 20-22 מעלות צלזיוס אנו נוהגים להשאיר את המנה של תאים על הספסל בטמפרטורת חדר למשך הלילה. אחד היתרונות של Xenopus laevis הנוירונים הוא שחממה מיוחדת לתרבית תאים המווסתת את רמות 2 או טמפרטורת CO אין צורך. Neurites קונוסים צמיחה יכולים להיות שנצפו וצולמו בטמפרטורת החדר 12-24 שעות לאחר ציפוי, למרות תולדה יכולה להיות מואצת עם התוספת של גורמי גדילה. באופן כללי, ביטוי של RNA או מוצר פלסמיד יגרום ביטוי משתנה בין תאים, ובכך ייתכן שיש מגוון של רמות ביטוי קרינה בין קונוסים צמיחה. אנו צפינו בביטוי RNA של חלבוני ניאון יישמרו גם 48 שעות לאחר ציפוי, למרות שזה תלוי במבנה המסוים. </li></ol> 4. נציג תוצאות לאחר ביצוע הפרוטוקול, אשר סכם באיור 1A, explants הבריא, נתח-כהלכה ותרבית עצבי ישלח את האקסונים או neurites רבים בכל כיוון על laminin / מצע פולי ליזין, שמוצג בתרשים 1B. את הקונוסים הצמיחה בקצוות של אקסונים ניתן הדמיה על ידי או אופטיקה DIC, כפי שניתן לראות בתרשים 1C, לדינמיקת תנועתיות כוללת תמונה, או מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה גבוהה לבחון את localization של חלבוני cytoskeletal מתויגים-fluorescently, למשל, EB1-GFP מוצג באיור 1D. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> איור 1. סיכום של פרוטוקול ניסוי, ותוצאה צפויה. א) פרוטוקול זרימת תרשים. לראות את הסרט לפרטים בדבר נתיחה ביום 3. הצינור העצבי כולה צריך לחתוך לכ 20 חתיכות שווות בהגודל ומתפזר באופן שווה בשורות על coverslip. בקריקטורה זו, מספריים מתוארים לייצג חיתוך הרקמות עם מלקחיים עדינים. CG גונדוטרופין כוריוני B) תמונת דסק&quot;ש של אקסונים או neurites צומחים מתוך explant (explant בפינה שמאלית עליונה). ג) תמונה גבוהה יותר הגדלה של חרוט צמיחה בקצה האקסון הולך וגדל. ד) תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של EB1-GFP בחרוט צמיחה. 10 מיקרומטר סרגל קנה מידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li>
<li>Buck, K. B., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+turning+induced+by+direct+local+modification+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics.</a> J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).</li>
<li>Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit%2FMAST%2FCLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. 42, 913-926 (2004).</li>
<li>Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+adhesion+and+signaling+dynamics+in+Xenopus+laevis+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones.</a> Dev. Neurobiol. , (2011).</li>
<li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).</li>
<li>Tanaka, E., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+growth+cone+turning+at+substrate+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries.</a> J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).</li>
<li>Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubule+dynamics+in+growth+cone+motility+and+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth.</a> J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).</li>
<li>Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+Xenopus+spinal+neurons+in+live+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture.</a> Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual+2010%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+Eggs+from+Xenopus+laevis+Females%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890(2008).</li>
<li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).</li>
<li>Lavery, D. L., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+and+loss-of-function+strategies+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+Laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).</li>
<li>Guirland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cAMP+signaling+through+G-protein-coupled+receptors+mediates+growth+cone+attraction+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).</li>
<li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).</li>
<li>Turney, S. G., Bridgman, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+stimulates+and+guides+axonal+outgrowth+via+growth+cone+myosin+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).</li>
<li>Weinl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+turning+of+Xenopus+retinal+axons+induced+by+ephrin-A5%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5.</a> Development. 130, 1635-1643 (2003).</li>
<li>Knoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).</li>
<li>Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+expression+in+transgenic+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos.</a> Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

explants העצבי Xenopus laevis לשלוח neurites בצורה מאוד חזקה על ידי 24 שעות לאחר הציפוי בlaminin / מצע פולי ליזין אם תנאים מתאימים. עם המצע הזה, קונוסים צמיחה הם מאוד ניע ויכולים להשיג אורכי האקסון של עד 1 מ&quot;מ, המשתרעים לכל הכיוונים החיצוניים מexplant, למרות שאורכים אופייניים הם 100 מיקרומטר או יותר. אם neurites לא צומח, יש מספר מוגבל של סיבות לכך יהיה המקרה. אפשרות אחת היא שexplants העצבי לא עמד כראוי למנה. הקפד שלא לפגוע בקבצים על ידי הזזת הצלחת בטעות לאחר ציפוי. כ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> גונדוטרופין כוריוני </td><td> Argent מעבדות כימיות </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> ציסטאין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine ערכה </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> נימי Borosil מחטי 1.2 מ&quot;מ (OD) x 0.9 מ&quot;מ (ID) </td><td> Fhc </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> סיגמא </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> דומון # 5 Biologie Inox מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> מנות מאטק </td><td> מחצלת Tek תאגיד </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> פולי-L-lysine </td><td> סיגמא </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> סיגמא </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> סיגמא </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> סיגמא </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

תרבויות explant עצביות מן<em&gt; xenopus laevis</em

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

התהליך המורכב של הדרכת האקסון מונע בעיקר על ידי חרוט הצמיחה, שהוא המבנה הדינמי ניע בקצה האקסון הולך וגדל. במהלך תולדת האקסון, חרוט הצמיחה חייב לשלב מספר מקורות מידע קיו הדרכה לווסת cytoskeleton כדי להניע את הצמיחה קדימה קונוס ומדויק לנווט למצוא מטרות הספציפיות שלה 1. איך השילוב הזה מתרחש ברמת cytoskeletal עדיין מתפתחים, והבדיקה של חלבון cytoskeletal ודינמיקת מפעיל בתוך חרוט הצמיחה יכולה לאפשר הבהרת המנגנונים אלה. קונוסים צמיחת laevis Xenopus הם גדולים מספיק (10-30 מיקרונים בקוטר) לביצוע גבוה ההדמיה ברזולוצית חיה של דינמיקת cytoskeletal (למשל 2-4) והם קלים לבודד ולטפל בסביבת מעבדה בהשוואה לבעלי חוליות אחרים. הצפרדע היא מערכת מודל קלסית למחקרים התפתחותיים נוירוביולוגיה, ותובנה מוקדמות חשובות למיקרופון חרוט צמיחהדינמיקת rotubule תחילה נמצאה באמצעות מערכת זו 5-7. בשיטה 8 זה, ביצים נאספות ומופרה במבחנה, הזריקה רנ&quot;א קידוד חלבוני היתוך cytoskeletal מתויג fluorescently או מבנים אחרים כדי לתפעל ביטוי גנים, ולאחר מכן אפשרו לפתח לבמת הצינור העצבית. צינורות עצביים מבודדים על ידי נתיחה ואז מתורבתים, וקונוסים צמיחה בneurites נגמל הם צלמו. במאמר זה יתאר כיצד לבצע בשיטה זו, שמטרתה היא לקונוסים תרבות Xenopus laevis צמיחה לניתוח תמונה הבא ברזולוציה גבוהה. למרות שאנו מספקים את הדוגמא של חלבון היתוך עצה + EB1-GFP, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מספר של חלבונים על מנת להבהיר את התנהגותם בתוך חרוט הצמיחה.

explants העצבי culturing מגזור<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; עוברים המבטאים חלבוני היתוך ניאון מאפשרים הדמיה של דינמיקת cytoskeletal קונוס צמיחה.

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

התהליך המורכב של הנחיית אקסונים מונע במידה רבה על ידי קונו הגדילה (growth cone), שהוא המבנה התנועתי הדינמי בקצה האקסון הגדל. במהלך...

מטרת הליך זה היא לגדל קונוסי צמיחה של Xenopus Lavis לצורך ניתוח תמונות ברזולוציה גבוהה בהמשך. הדבר מושג תחילה על ידי הזרקת הורמונים לצפרדעים נקבות כדי לעורר ייצור ביצים. השלב השני הוא איסוף והפריה של הביצים, ולאחר מכן הזרקת mRNA או מבנים אחרים בעלי עניין לתוכן.ביום למחרת, העוברים מנותחים, והצינורות העצביים מבודלים, נחתכים ומונחים על לבישי זכוכית (cover slips). השלב הסופי הוא הדמיה של האקסונים הגדלים והקונוסי הגדילה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופיית פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה כדי להראות שינויים בלוקליזציה של חלבונים בקונוסי הגדילה לאורך זמן.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן ניתן להתקשות בלימוד דיסקציות של צינור העצבים מקריאת סעיף השיטות ללא צפייה ישירה בטכניקה. השג ביצי מנקיות שהוזרקו להן 400 units של chorionic gonadotropin כ-12 עד 14 שעות לפני כן. אסוף את הביצים לתוך תמיסת ringer modified אחת.לאחר מכן, בצעו הפרייה in vitro של ה-X שנאספו באמצעות רסס אשכים כפי שתואר בעבר, והוסיפו 0.1 XMMR לאחר 20 דקות לפחות. הסירו את המצע והדגירו את העוברים ב-2% cysteine ב-one XMMR ב-pH 7.8 למשך שלוש עד חמש דקות כדי להסיר את מעטפת הג'לי של העוברים. לאחר מכן, שפכו את העוברים לתוך כוס כימית.בשלב הבא, שטפו את העוברים ב-0.1 XMMR או ב-0.1 x modified bath saline שלוש עד חמש פעמים לאחר השטיפה האחרונה. השאירו את העוברים ב-0.1 XMMR בטמפרטורת החדר עד להזרקה או לפי הרצונכם. הניחו את העוברים בטמפרטורה של 14 עד 18 degrees Celsius כדי להאט את ההתפתחות לפני ההזרקה.דללו RNA עם כיסוי (capped RNA) שהוכן מראש לריכוז סופי של 50 עד 200 picograms per liter באמצעות מים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן אחסנו על קרח עד להזרקה המיקרוסקופית. בשלב הבא, הכינו את מחט ההזרקה על ידי מתיחה של קפילרה מ-borosilicate באמצעות סוטר-פולר (suter puller) או מכשיר דומה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ, השתמשו בפינצטה כדי לשבור את קצה המחט בזווית ליצירת צורה דמוית נוצה, ומלאו את המחט מאחור ב-0.5 עד 1 µL של תמיסת ה-RNA המדוללת.הרכיבו את המחט על המיקרו-מניפולטור; במקרה זה נעשה שימוש במזרק PICO PLI 100 של מערכת A medical. כעת, העבירו את העוברים המופרים בשלב של תא אחד עד ארבעה תאים לתוך צלחת פלסטיק המכילה 5%fol ב-0.1 XMMR. כיילו את נפח ההזרקה עבור כל מיקרו-פיפט חדש באמצעות מיקרומטר רדיאלי או מיקרומטר של במה.לאחר מכן, הגדירו את ה-pico injector להזרקת הכמות הרצויה של RNA עבור כל הזרקה. כאן נעשה שימוש בנפח הזרקה של 1 nanoliter. החזיקו את העוברים בעזרת פינצטה, או אם תעדיפו, הניחו אותם על פלטפורמת החזקה והזריקו את הנפח הרצוי לתוך ה-animal blasters.פזר את ההזרקות במספר מיקומים ברחבי העובר כדי להשיג התפלגות אחידה של RNA. עוברים בשלב ארבעה תאים מקבלים הזרקה אחת עד שתיים בכל בלאסטמר (blastomere), בעוד שעוברים בשלב שני תאים מקבלים שתיים עד ארבע הזרקות. לאחר ההזרקות, העבר את העוברים המוזרקים לכלי פלסטיק המכיל 0.1 XMMR והנח להם להתפתח עד לשלבים 20 עד 23.בהתאם למהירות ההתפתחות הרצויה, מדגרירים את העוברים בטמפרטורה של 14 עד 22 מעלות צלזיוס. מצפים צלחות תרבית שעובדו ב-PLL ב-10 מיקרוגרם למלל laminin ב-PBS ומניחים את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. עם תום זמן הדגירה, שוטפים את הצלחות שלוש פעמים ב-PBS, תוך הקפדה שהמשטח המצופה ב-laminin לא ייחשף לאוויר לאחר השטיפה האחרונה. מחליפים את ה-PBS במצע גידול.לבסוף, הכינו שלוש צלחות מצופות agarose על ידי ציפוי תחתית צלחת תרבית ב-1% agarose ב-0.1 XMMR והמתנה להתקשחות. לאחר ההתקשחות, מלאו צלחת אחת ב-steinberg's media; שונות בביטוי של mRNA המוזרק עלולה לגרום לעוברים להראות פסיפס של פלורסצנציה לפני ביצוע הדיסקציות. סננו את העוברים כדי לבדוק נוכחות של פלורסצנציה וזהו את אותם עוברים המבטאים את חלבון החיבור הפלואורסצנטי בצינור העצבי.לאחר מכן, העבירו את העוברים הפלורסצנטיים בשלבים 20 עד 23 למנתית פלסטיק מצופה באגרוס המכילה מצע שטיינברג (Steinberg's Media). הניחו את המנתית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי והשתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר את הקרום הוויטליני. לאחר מכן, בעוד פינצטה אחת מחזיקה את העובר במקומו, השתמשו בפינצטה השנייה כדי לבצע חתך בצד העובר ולחשוף את החלל הפנימי.בשלב הבא, השתמשו בשתי מערכות של פינצטות כדי לצבוט לאורך הרקמה שבין החלקים הגביים (dorsal) והבטניים (ventral) של העובר, במטרה לחתוך את העובר לשניים ולבודד את החלק הגבי המכיל את צינור העצבים. העבירו את ה-explan הגבי למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה המכילה collagenase בריכוז 2 mg/mL בתוך מדיום Steinberg, והניחו על רוטטור למשך 15 עד 20 דקות. לאחר מכן, העבירו את ה-explan הגבי לצלחית מצופה agarose המלאה במדיום Steinberg טרי.בזמן העבודה תחת המיקרוסקופ, יש להוציא את צינור העצבים (neural tube) מהאפידרמיס הדורסלי ומה-Noor הוונטרלי על ידי החלקת קצה הפינצטה בין האפידרמיס לרקמה שמתחתיו, ומשיכה איטית של האפידרמיס לאחור. לאחר מכן, השתמש בפינצטה אחת כדי להחזיק את הרקמה ובשנייה כדי להסיר רקמה המקיפה את צינור העצבים. לאחר מכן, העבר את צינור העצבים שהוצא לכלי מצופה ב-agros ומלא במצע גידול טרי.לאחר איסוף מספר צינורות עצביים (neural tubes), השחז את מחטי הטונגסטן או הפינצטה כדי לחתוך כל צינור לכ-20 חתיכות. לאחר מכן, פזר את החתיכות על צלחות תרבית מצופות בלמינין, תוך פריסה אחידה של ה"חצילים" בשורות. לאחר זריעת הצינורות העצביים, אין להזיז את הצלחות, שכן הדבר יפריע להיצמדות התאים.דגרו את פרוסות צינור העצבים שהוצבו על התרבית בטמפרטורה של 20 עד 22 degrees Celsius. אינקובטור לתרביות תאים אינו נחוץ לגידול נוירונים של XUS lavis; 12 עד 24 שעות לאחר ההצבה, דמיינו את הנוירונים ואת קוני הגדילה בטמפרטורת החדר. קחו בחשבון שביטוי משתנה של RNA עשוי להוביל לטווח של רמות פלואורסצנציה בין קוני גדילה שונים.תמונת DIC זו מראה אקסונים ונוריטים הגדלים מתוך ה-X explan בפינה השמאלית העליונה של שדה הראייה. סרגל המقياس בתמונה זו ובתמונות הבאות מייצג 10 microns. סרטון זה, בהגדלה גבוהה יותר, מראה את קו הגדילה בקצה של אקסון הגדל.לבסוף, סרטון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית זה מראה ביטוי של EB1-GFP בקו גדילה. בעוד שכאן אנו מציגים דוגמה של דימות של חלבון ההיתוך לקצה הפלוס EB1-GFP, ניתן ליישם שיטת השתלת העצב (neural explant) הזו על מספר רב של חלבונים כדי לה 규ש את התנהגותם בתוך קו הגדילה במהלך צמיחת נוריטים.

neural-explant-cultures-from-xenopus-laevis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים...

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

Xenopus laevis מספק מערכת מודל אידיאלית ללימוד מפרט גורל תא ותפקוד פיסיולוגי של תאי רשתית בודדים בתרבית תאים ראשוניות. כאן אנו מציגים טכניקה לביתור רקמות רשתית ויצירת תרביות תאים ראשוניות שהם צלמו לפעילות הסידן ונותחו על ידי כלאה באתר.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר...

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח פסגת premigratory גולגולת עצבית (NC) מneurulas laevis Xenopus. יכול להיות מצופה explants אלה בפיברונקטין ותרבית במבחנה, או מורכב בחזרה לעוברי מארח. טכניקה זו מאפשרת חקר המנגנונים של מעבר NC האפיתל לmesenchyme, הגירה, ובידול.

Dissection של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; העצבי קרסט עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Explant תרבות או<em&gt; In vivo</em&gt; השתלות

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

explants blastoderm דגי זברה נוצרים על ידי בידוד תאים עובריים ממרכזי איתות אנדוגני בתוך העובר המוקדם, ומייצרים אשכולות תאים נאיביים יחסית מניפולציה בקלות ו ex vivoתרבית . מאמר זה מספק הוראות להכנת explants כאלה ומדגים את התועלת שלהם על ידי חקירת תפקידים עבור נודל איתות במהלך gastrulation.

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

זה פרוטוקול וידאו מדגים כיצד להפלות ו למנות בתום תאים בתום גזע עצביים באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר באמצעות assay עצביים המושבה יוצרי התא.

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

למד שיטת תרבות אקספלנטים עצביים מעוברי Xenopus laevis לצורך הדמיית דינמיקת ציטוסקלט בקונוסי צמיחה באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנץ ברזולוציה גבוהה.

תרבויות Explant עצביות מן

גלה סרטונים נוספים