תרבויות Explant עצביות מן Xenopus laevis

מטרת הליך זה היא לתרבת חרוטי צמיחה של Xenopus Lavis לניתוח תמונה ברזולוציה גבוהה לאחר מכן. זה מושג על ידי הזרקת הורמון לנקבות צפרדעים כדי לעורר את ייצור הביציות. השלב השני הוא לאסוף ולהפרות את הביציות, ולאחר מכן להזריק להן mRNA או מבנים מעניינים אחרים.

למחרת, העוברים מנותחים והצינורות העצביים מבודדים, נחתכים ומצופים על פתקי כיסוי. השלב האחרון הוא לדמות את האקסונים הגדלים וחרוטי הצמיחה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה כדי להראות שינויים בלוקליזציה של חלבונים בקונוסים גדילה לאורך זמן.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שניתוח הצינור העצבי יכול להיות קשה ללמוד מקריאת קטע שיטה מבלי להתבונן בטכניקה ממקור ראשון. השג ביצים מנקבות צפרדעים שהוזרקו בעבר עם 400 יחידות של גונדוטרופין כוריוני 12 עד 14 שעות לפני כן. אסוף את הביצים לתמיסת צלצול אחת שהשתנתה בסימני X.

לאחר מכן יש להפרות את ה- X שנאסף במבחנה עם אשכי טחון כפי שתואר קודם לכן, ולהוסיף 0.1 XMMR לאחר 20 דקות לפחות. הסר את המדיה ודגר את העוברים ב-2% ציסטאין ב-XMMR אחד ב-pH 7.8 למשך שלוש עד חמש דקות כדי להסיר את שכבת הג'לי של העובר. ואז שופכים את העוברים לכוס.

לאחר מכן, שטפו את העוברים עם 0.1 XMMR או 0.1 x מי מלח אמבטיה מותאמים שלוש עד חמש פעמים לאחר הכביסה הסופית. שמור את העוברים ב-0.1 XMMR בטמפרטורת החדר עד להזרקה או אם רוצים. הנח את העוברים בטמפרטורה של 14 עד 18 מעלות צלזיוס כדי להאט את ההתפתחות לפני ההזרקה.

יש לדלל RNA מכוסה שהוכן בעבר לריכוז סופי של 50 עד 200 פיקוגרם בננה ליטר במים מזוקקים כפולים, ולאחר מכן לאחסן על קרח עד להזרקת מיקרו. לאחר מכן, הכן את מחט ההזרקה על ידי משיכת נימי בו סיליקט באמצעות מושך סוטר או מכשיר דומה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ, השתמש במלקחיים כדי לשבור את קצה המחט בזווית כדי ליצור צורה דמוית שמיכה ולמלא מחדש את המחט ב-0.5 עד מיקרוליטר אחד של תמיסת ה-RNA המדולל.

התקן את המחט על המיקרו מניפולטור נעשה כאן שימוש במזרק PLI 100 PICO של מערכת רפואית. כעת, הניחו את העוברים המופרים בשלב תא אחד עד ארבעה לתוך צלחת פלסטיק המכילה 5% fol ב-0.1 XMMR. כייל את נפח ההזרקה עבור כל מיקרו פיפטה חדשה באמצעות מיקרומטר רדיקלי או במה.

לאחר מכן הגדר את מזרק הפיקו כך שיספק את כמות ה-RNA הרצויה עבור כל זריקה. כאן משתמשים בנפח הזרקה של ננוליטר אחד. החזיקו את העוברים בעזרת מלקחיים או אם העדיפו, הניחו על משטח אחיזה והזריקו את הנפח הרצוי לתוך פיצוצי החיות.

פזרו את הזריקות במספר מקומות ברחבי העובר כדי לקבל פיזור אחיד של RNA. זריקה אחת עד שתיים נעשות בכל פיצוץ לעובר בשלב ארבעה תאים, בעוד ששתיים עד ארבע זריקות משמשות לעובר בשלב שני תאים. לאחר ההזרקות מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פלסטיק המכילה 0.1 XMMR ומאפשרים להם להתפתח עד לשלב 20 עד 23.

בהתאם למהירות ההתפתחות הרצויה, העוברים מודגרים בטמפרטורה של 14 עד 22 מעלות צלזיוס מעטפים כלי תרבית מטופלים PLL עם 10 מיקרוגרם למיליליטר למינין ב- PBS ומניחים את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר שחלף זמן הדגירה, שטפו את הצלחות שלוש פעמים כאשר PBS נזהר לא לתת למשטח המצופה למינין להיחשף לאוויר לאחר הכביסה הסופית. החליפו את ה-PBS במדיה תרבותית.

לבסוף, הכינו שלוש מנות מצופות אגרוס על ידי ציפוי תחתית צלחת מתורבתת ב-1%aros ב-0.1 XMMR ואפשרו לה להתקשות. לאחר ההתקשות, מלאו צלחת אחת בשונות המדיה של שטיינברג בביטוי ה-mRNA המוזרק עלולה לגרום לעוברים להפגין פסיפס של פלואורסצנטיות לפני ביצוע דיסקציות. סנן עוברים לנוכחות פלואורסצנטית וזהה את העוברים המבטאים את חלבון האיחוי הפלואורסצנטי בצינור העצבי.

לאחר מכן העבירו את העוברים הפלואורסצנטיים בשלב 20 עד 23 לתוך צלחת הפלסטיק המצופה אגרוס המכילה את המדיה של שטיינברג. מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ מנתח ומשתמשים במלקחיים עדינים כדי להסיר את קרום הוויטלין. לאחר מכן, בזמן שמלקחיים אחד מחזיק את העובר במקומו, השתמש בשני כדי לבצע חתך בצד העובר ולחשוף את החלק הפנימי החלול.

לאחר מכן, השתמש בשתי קבוצות המלקחיים כדי לצבוט לאורך הרקמה בין חצאי הגב והגחון של העובר כדי לחתוך את העובר לשניים ולבודד את החלק הגבי המכיל את הצינור העצבי. מניחים את האקספלן X הגבי בצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל שני מיליגרם למיליליטר, קולגנאז במדיה של שטיינברג ומניחים על מסובב למשך 15 עד 20 דקות. לאחר מכן העבירו את האקספלשן הגבי לצלחת מצופה אגרו מלאה במדיה טרייה של שטיינברג.

תוך כדי עבודה תחת המיקרוסקופ, נתח את הצינור העצבי מהאפידרמיס הגבי והנור הגחוני על ידי החלקת קצה המלקחיים בין האפידרמיס לרקמה שמתחתיו, ומשיכה איטית לאחור של האפידרמיס. לאחר מכן השתמש במלקחיים אחד כדי להחזיק את הרקמה ובאחר כדי להסיר רקמה המקיפה את הצינור העצבי. לאחר מכן, העבירו את הצינור העצבי המנותח לצלחת מצופה אגרוס מלאה במצע תרבית טרי.

לאחר שנאספו מספר צינורות עצביים, אתה משחיז מחטי טונגסטן או מלקחיים כדי לחתוך כל צינור לכ-20 חתיכות. ואז צלחת את החלקים על כלי התרבות המצופים למינין, ומורחים את החצילים באופן שווה בשורות. לאחר ציפוי הצינורות העצביים, אין להזיז את הכלים מכיוון שהדבר יפריע להצמדת התאים.

דגרו על הצינור העצבי המצופה בטמפרטורה של 20 עד 22 מעלות צלזיוס. אינקובטור תרבית תאים אינו נדרש לתרבית נוירונים של XUS lavis 12 עד 24 שעות לאחר ציפוי נוירוני תמונה וחרוטי גדילה בטמפרטורת החדר. זכור כי ביטוי משתנה של RNA עלול לגרום לטווח של רמות פלואורסצנטיות בין חרוטי גדילה.

תמונת DIC זו מציגה אקסונים ונויריטים שצומחים מחוץ ל-X בפינה השמאלית העליונה של שדה הראייה. סרגל קנה המידה בתמונה זו ובתמונות הבאות מייצג 10 מיקרון. סרטון ההגדלה הגבוה הזה מראה את חרוט הצמיחה בקצה של אקסון גדל.

לבסוף, סרטון מיקרוסקופיה פלואורסצנטי זה מראה ביטוי של EB 1 GFP בחרוט גדילה. בעוד שכאן, אנו מספקים את הדוגמה של הדמיה, חלבון היתוך קצה פלוס EB אחד GFP. ניתן ליישם את שיטת explant העצבית הזו על כל מספר של חלבונים כדי להבהיר את ההתנהגויות שלהם בתוך חרוט הגידול במהלך צמיחת נויריטים.