Name: Assay לחדירות של Neuroepithelium עוברי דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: למדו שיטה לכימות חדירות הנוירואפיתל העוברי בדג הזברה באמצעות הזרקת פיטצי דקסטרן פלואורסצנטי ודימות לאורך זמן. טכניקה זו מאפשרת השוואת רקעים גנטיים ותנאים סביבתיים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש, והקרן הלאומית למדע. תודה מיוחדת לחברי מעבדת סייב לדיונים רבים שימושיים וביקורת בונה, ולאוליבייה Paugois לגידול בעלי דגי מומחה.

1. הכנה לmicroinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחטי microinjection ידי משייכת צינורות נימים באמצעות חולץ מחט מכשירי סאטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט עומס microinjection עם צבע זרחני (FITC-dextran). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מחט על micromanipulator ומכשירי microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור מחט microinjection זהירות בעזרת מלקחיים לבערך 2 מיקרומטר ברוחב, לעומת זאת, זה משתנה בהתאם להגדרת microinjector. למחטי microinjection, זה מקביל לאזור 1 של המחט מהקצה שלא מתכופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את גודל ירידה בנפט, התאמת זמן הזרקה ולחץ, כך שכל זריקה מספקת 1 nl. הגדרות דוגמה לרווארד Apparatus microinjector הם: איזון P = 1.4 psi, P = יצא 1.4 psi, P = 22.9 psi להזריק, P = 67.8 psi הברור עם זמן הזרקה של 0.4-0.7 שניות. הקוטר של המחט שלנו תוך שימוש בהגדרות אלה הוא בערך 2 מיקרומטר. עם זאת, הגדרות תהיינה microinjector ספציפית, ולהשתנותccording למחט הקוטר. </li></ol> 2. הכנת העוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעייל 2 מנות עם 1% agarose במים לכל מצב, חורים להציץ לתוך agarose עם קצה פיפטה 1-200 μl, ולהסיר תקעי agarose. מלא מנות עם תקשורת עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחי שימוש בעוברים, dechorionate ש18 hpf או מבוגר תחת stereomicroscope. עוברים מבוימים פי קימל et al. 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברי dechorionated לצלחת מצופית 1 agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עוברים, להוסיף tricaine (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) למנה עד עוברים מפסיקים לנוע (שנעשה על פי 12 Westerfield). </li></ol> 3. הזרקת החדרים במוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי אוריינט אז אתה מסתכלים על צד הגב שלהם על ידי הצבת את הזנב של העובר לתוך החור. אם micromanipulator הוא בצד ימין, ולאחר מכן להעביר את העובר כך שהמוח הקדמי הוא לשמאל ולמוח האחורי בצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט בעמדת wiנקודת dest של חלל המוח אחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות צלחת גג לנקב של חלל המוח האחורי להיות בטוח שלא לעבור את עומק המוח בחלמון (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 1-2 nl של צבע פלואורסצנטי אל חדרי הלב מוודאים צבע ממלא את כל האורך של חדרי המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים לצלחת המצופית agarose השנייה, מלאת תקשורת עובר ולהרדים מחדש כפי שמתואר ב2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להתחיל הדמיה, כאמורה בסעיף 4 על מנת לקבל תמונת זמן אפס. </li></ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי אוריינט עם הזנב בחור כמתואר בסעיף 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ לנתח עם אור ניאון וגם משודר לקחת תמונה הגבה brightfield. שמור את ההגדלה מתמדת בין ההדמיה של עוברים שונים. זה מאפשר השוואה ישירה של ניתוחים שבוצעו באמצעות התמונה J (5.2-6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי להזיז את העובר, מיקרוסקופ או צלחת, לוקחתמונת ניאון מקבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עבור כל עובר בנקודתי זמן רצוי. </li></ol> 5. כימות של תנועת דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיזוג brightfield ותמונות ניאון בפוטושופ כפי שתואר בעבר על ידי Gutzman וסייב 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את מרחק המהלכים הקדמיים לצבוע בתוכנת J תמונה זמינה <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קובץ ממוזג פתוח בJ תמונה ולהשתמש בכלי קו למתוח קו מנקודת ציר המוח הקדמי לצבוע את החזית בזווית 10-20 מעלות מneuroepithelium (איור 1 א). אזור זה נבחר משום שהוא האתר הראשון והבולט ביותר של צבע דולף neuroepithelium הסוג הפראי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר כלי מדידה לחישוב אורכו של קו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל פעם נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מרחק נטו מול הצבע עבר לאורך זמן על ידי הפחתה במרחק t = 0 מנקודתי זמן אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה עלגרף. </li></ol> 6. נציג תוצאות דוגמה לתוצאות המתקבלות בבדיקת חדירות neuroepithelial שימוש בעוברים בסוג בר מוצגת באיור 1 ב-D. מדויק כדי להבדיל חדירות, כדאי לבדוק עם צבעים weightsto המולקולרי שונה לזהות שגודל הוא רק מעט דולף בסוג בר או עוברי ביקורת (איור 2). זה מאפשר זיהוי של מוטציות גנטיות או תנאים סביבתיים שגם עלייה או ירידת חדירות (1D איור, ירוק וקווים אדומים בהתאמה). לneuroepithelium 24 hpf דג הזברה, 70 kDa הדלפות FITC dextran לאט במשך 2 שעות, ואילו 2,000 kDa אין ו10 kDa כמעט מייד דולף החוצה. לכן 70 kDa הוא המשקל המולקולרי האידיאלי כדי לזהות מצבים שגם עלייה וירידת חדירות neuroepithelial. אם המחט מתגעגעת לום חדרית, פלואורסצנציה wחולה מופיע מחוץ למוח בזמן t = 0 (לדוגמה ראה Gutzman וסייב, 2009 10). העוברים האלה אמורים להיות מושלכים מאז לצבוע הזריקו לא הכילו בתחילה בתוך המוח ואין מסקנה ברורה לגבי תנועה של הצבע והחדירות של neuropeithelium יכולה להתבצע. לבסוף, אם יש עוברים חללים קטנים או חדרים במוח בלתי מנופחים, לפני הזרקה של חדרי מוח עם תמיסת מלח אפשר לעשות לפני הזריקה של צבע פלואורסצנטי. זה מנפח את החדרים שהופכים לאחר מכן להדמיה של חדרים קלים יותר כאשר הזרקה עם צבע פלואורסצנטי. בקרות נאותות חייבות להתבצע כדי לקבוע אם הזרקה של מי מלח משבשת התפתחות צינור עצבית נורמלית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4242/4242fig1.jpg" /> איור 1. כמובן זמן של צבעי משקל מולקולריים שונים. () תרשים ניסויי. ראשון, צבע פלואורסצנטי מוזרק לתוך חדרי הלב. X = מיקום של מחט להזרקה. תמונות גב באות נלכדות לאורך זמן. לבסוף, המרחק התרגש מול הצבע מהמוח הקדמי ציר נקודה נמדדה (מיוצג ע&quot;י קו אדום). (BC) Merged brightfield ותמונות גב ניאון ב22 hpf (t = 0 דקות, B) ו24 hpf (t = 120 דקות, ג). לבן קו מציין מרחק של חזית הצבע מהמוח הקדמי חדר לב. (ד) נתוני חדירות מדגם היפותטיים. כחול = סוג בר או פקדים, אדום = דגימה עם חדירות ירדו יחסית לשליטה, ו= מדגם ירוק עם חדירות יחסית לשליטה מוגברת. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4242/4242fig2.jpg" /> איור 2. מדידה של חדירות לצבע neuroepithelial משקל מולקולרי שונה. (AE) brightfield ממוזג הגבה ותמונות ניאון של 22 עוברי סוג בר hpf בt = 0 דקות לאחר הזרקה עם FITC-dextran של המשקלים המולקולריים הבאים: 10 KDA (A), 40 KDA (ב &#39;), 70 KDA (C), 500 KDA (ד&#39;) וכ -2,000 KDA (E). עובר (A&#39;-E &#39;) בדיוק כמו ב( AE) בt = 120 דקות ב 24 hpf. קדמי לשמאל. F = מוח קדמי, מ = מוח תיכון, H = מוח אחורי. אסטריסק = אוזן.

<ol><li>Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+neurulation%3A+first+impressions+do+not+count%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+vertebrate+neurulation+and+a+re-evaluation+of+teleost+neural+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation.</a> Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).</li>
<li>Salehi, Z., Mashayekhi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cerebrospinal+fluid+on+neural+cell+survival+in+the+developing+chick+cerebral+cortex%3A+an+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study.</a> Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).</li>
<li>Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).</li>
<li>Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69, 893-905 (2011).</li>
<li>Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival%2C+proliferation%2C+and+neurogenesis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A.+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Totally+tubular%3A+the+mystery+behind+function+and+origin+of+the+brain+ventricular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system.</a> Bioessays. 31, 446-458 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+neuroepithelial+barrier+by+Claudin5a+is+essential+for+zebrafish+brain+ventricular+lumen+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Information+Network+%28ZFIN%29%3A+a+resource+for+genetic%2C+genomic+and+developmental+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research.</a> Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנחנו מדגימים את היכולת לכמת חדירות של המוח העוברי דג זברת החיים כפי שנקבע לצבע מוזרק של משקל מולקולרי נתון. התצפית שלנו שneuroepithelium דג הזברה העוברית הוא דיפרנציאלי חדיר לצבעים שונים של משקולות מולקולריות מצביעה שהצבע עובר דרך חדירות paracellular. עם זאת, אנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות של תרומת transcellular לחדירות הנצפות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כל מבנה צינורי אחר, כל עוד הן בתוך ומחוץ לצינור שניתן לראות ולומן יהיה ניתן להזריק. עם זאת, זיהוי של המשקל המולקולרי האי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> Dextran, fluorescein, anionic, ליזין ניתן לתקן </td><td> Invitrogen </td><td> D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 </td></tr><tr><td> Tricaine אבקה </td><td> סיגמא </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> צינורות נימים </td><td> Fhc בע&quot;מ </td><td> 30-30-1 </td></tr></tbody></table>

assay לחדירות של neuroepithelium עוברי דג הזברה

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

מערכת חדרית המוח נשמרת בין חוליות והוא מורכב מסדרה של חללים המחוברים ביניהם בשם חדרים במוח, שיוצר בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות מוח ונשמרים לאורך חייו של בעל החיים. מערכת חדרית המוח נמצאת בבעלי חוליות, ואת החדרים להתפתח לאחר היווצרות צינור עצבית, כאשר החלל המרכזי מתמלא בנוזל שדרה (CSF) 1,2. CSF הוא נוזל עשיר בחלבון שהוא חיוני להתפתחות תקינה של מוח ותפקוד 3-6. בדג הזברה, אינפלצית חלל המוח מתחילה בכ 18 הפרית הודעה לשעה (hpf), לאחר שהצינור העצבי סגור. תהליכים מרובים קשורים בהיווצרות חלל מוח, כולל היווצרות neuroepithelium, היווצרות צומת הדוקה המווסתת את החדירות וייצור CSF. אנחנו הראינו כי Na, K-ATPase נדרש לאינפלצית חלל המוח, משפיעים כל התהליך אלהes 7,8, ואילו 5a claudin הוא הכרחי להיווצרות צומת הדוקה 9. בנוסף, הראה כי &quot;רגיעה&quot; של neuroepithelium העוברי, באמצעות עיכוב של שרירן, קשור באינפלצית חלל מוח. כדי לחקור את הרגולציה של חדירות במהלך אינפלצית חלל מוח דג זברה, שפתחנו assay שמירת צבע חדרית. שיטה זו משתמשת בהזרקת חלל מוח בעובר דג זברת חיה, טכניקה שפותחה בעבר במעבדה שלנו 10, fluorescently לתייג את הנוזל השדרתי. עוברים ואז הם צלמו לאורך זמן את מהלכי צבע הניאון דרך החדרים במוח וneuroepithelium. המרחק מול הצבע מתרחק מהצד הבסיסי (שאינו luminal) של neuroepithelium לאורך הזמן הוא לכמת והוא מדידת חדירות neuroepithelial (איור 1). אנו צופים שבצבעים 70 KDA וקטן יעברו דרך neuroepithelium ויכולים להיות detecteד מחוץ למוח העוברי דג הזברה ב 24 hpf (איור 2). assay שמירת צבע זה יכול לשמש כדי לנתח חדירות neuroepithelial במגוון רחב של רקע גנטי שונה, בזמנים שונים במהלך פיתוח, ולאחר הפרעות סביבתיות. זה יכול להיות שימושי גם בבדיקה פתולוגית של הצטברות CSF. באופן כללי, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לנתח את התפקיד והרגולציה של חדירות במהלך פיתוח ומחלה.

אנו מתארים מדידת חיה כל חיה כמוני לחדירות של מוח דג הזברה העוברי. הטכניקה מנתחת את היכולת לשמור על נוזל השדרתי ומולקולות של משקולות מולקולריות שונות בתוך חלל הצינור העצבי, והוא מכמת את תנועתם מחוץ לחדרי לב. שיטה זו יעילה לקביעת הבדלים בחדירות וההתבגרות אפיתל במהלך פיתוח ומחלה.

Assay לחדירות של Neuroepithelium עוברי דג הזברה

מערכת הפרוגי של המוח שמורה בקרב חולייתנים והיא מורכבת מסדרה של חללים מקושרים הנקראים פרוגי המוח, היוצרים...

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת את החדירות של הניורו-אפיתל העוברי של דגי הזברה. זאת משיגים תחילה על ידי הזרקת fitzy dextran במשקל 70 kilodalton לתוך פרונטריקולים של המוח. לאחר מכן, נרכשת סדרת תמונות של שדה בהיר ופלואורסצנציה לאורך זמן.לאחר מכן, נמדד המרחק של הצבע הפלואורסצנטי מנקודת הציר של המוח הקדמי בכל נקודת זמן. לבסוף, מחושב המרחק שעבר לאורך זמן. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שינויים בחדירות הנוירו-אפיתליאלית על ידי השוואה בין רקעים גנטיים שונים או תנאים סביבתיים שונים.המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת את החדירות (permeability) באפיתל העצבי העוברי של דג הזברה. כדי להתכונן להזרקה, טענו מחט הזרקה שהוכנה מראש בצבע פלואורסצנטי, והרכיבו את המחט על המניפולטור ומכשיר המיקרו-הזרקה. השתמשו בפינצטה כדי לשבור בזהירות את מחט המיקרו-הזרקה לרוחב של כ-2 מיקרון.מדדו את גודל הטיפה בשמן, תוך התאמת זמן ההזרקה והלחץ כך שכל הזרקה תספק 1 nanoliter. להכנת העוברים, צפו שתי צלחות ב-1% agros במים עבור כל תנאי, ובאמצעות טיפ של פיפט בנפח 200 µL, נקבו חורים ב-agros והסירו את הפקקים. מלאו את הצלחות בתמיסת גידול לעוברים תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמשו בפינצטה כדי להעביר עוברים, הנמצאים 18 שעות לאחר ההפריה או יותר, לתוך החורים.לאחר מכן, העבירו את העוברים לאחת מהצלחות המצופות ב-agros כדי להרדימם. הוסיפו trica לצלחת והמתינו עד שהעוברים יפסיקו לזוז. כווןו את העוברים כך שצדם הגבי יהיה גלוי, על ידי הנחת זנב העובר בתוך החור.אם המיקרו-מניפולטור נמצא מימין, העבירו את העובר כך שהמוח הקדמי יהיה משמאל והמוח האחורי מימין. מקמו את המחט בנקודה הרחבה ביותר של התוך-חדר של המוח האחורי. לאחר מכן, נקבו בזהירות את לוח הגג (roof plate) של התוך-חדר של המוח האחורי, תוך הקפדה שלא לחדור דרך עומק המוח אל תוך החלמון.לאחר מכן, מזריקים ננוליטר אחד עד שניים של צבע פלואורסצנטי לתוך הפרוזות (ventricles), תוך וידוא שהצבע ממלא את כל אורכו של המוח. הפרוזות. מעבירים את העוברים לצלוחית אגר (agros dish) שנייה מלאה במצע גידול לעוברים, ומאלחשים אותם שוב. עוברים מיד לדימות על מנת לקבל תמונות לאורך זמן.בצעו מיקוד (Zero) של התמונות לצילום העוברים. כוון אותם כך שזנבותיהם יהיו בתוך החור כפי שנעשה קודם לכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה בעל תאורה שעוברת (transmitted) ותאורה פלואורסצנטית. צלמו תמונת שדה בהיר (bright field) של הצד הגבי (dorsal).שמרו על הגדלה קבועה בין העוברים כדי לאפשר השוואה ישירה ללא הזזת מיקרוסקופ העוברים או הצלחת. צלמו תמונה פלואורסצנטית תואמת, וחזרו על הפעולה עבור כל עובר ובכל נקודת זמן רצויה. כדי לכמת את תנועת הצבע, השתמשו ב-Photoshop כדי למזג את תמונות השדה הבהיר (brightfield) והפלואורסצנציה.כדי למדוד את המרחק שבו נע חזית הצבע, השתמש ב-Image J כדי לפתוח את קובץ המיזוג (merge file) והשתמש בכלי הקו כדי לשרטט קו מנקודת הציר של המוח הקדמי (forebrain hinge point) אל חזית הצבע בזווית של 10 עד 20 מעלות מהנוירו-אפיתל (neuro epithelium); בחר בכלי המדידה כדי לחשב את אורך הקו. לבסוף, חשב את המרחק נטו שבו נעה חזית הצבע לאורך זמן, על ידי חיסור המרחק בזמן אפס מנקודות הזמן האחרות.שרטטו את התנועות על הגרף המוצג. להלן דוגמה לתוצאות חדירות נוירו-אפיתליאלית באמצעות עוברים מסוג wild type. תמונות השדה הבהיר הממוזג המוצגות כאן צולמו ב-22 ו-24 שעות לאחר ההפריה, בהתאמה.הקו הלבן מציין את המרחק של חזית ה-D מהחדר של המוח הקדמי. הגרף מציג נתוני חדירות היפותטיים המדגימים את היכולת לקבוע עלייה בחדירות, המסומנת בירוק, או ירידה בחדירות, המסומנת באדום, בהשוואה לעוברי ביקורת המסומנים בכחול. כדי להבדיל באופן מדויק בין רמות חדירות, מומלץ לבחון צבעים בעלי משקלים מולקולריים שונים כדי לזהות גודל שדולף באופן חלקי בלבד בעוברי סוג בר (wild type) או עוברי ביקורת.דבר זה מאפשר זיהוי של מוטציות גנטיות או תנאים סביבתיים המגבירים או מפחיתים את החדירות במהלך 24 השעות. נוירו-אפיתל של דגי זברה מסוג בר (wild type) לאחר הפרטיליזציה. FITC-dextran של 70 kilodalton דולף באיטיות לאורך שעתיים, בעוד ש-2000 kilodalton אינו דולף, ו-10 kilodalton דולף החוצה כמעט באופן מיידי.לפיכך, 70 kilodaltons הוא המשקל המולקולרי האידיאלי לזיהוי תנאים המגבירים ומפחיתים את חדירות האפיתל העצבי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת את חדירות האפיתל העצבי בעוברים של דגי זברה.

an-assay-for-permeability-of-the-zebrafish-embryonic-neuroepithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

מאמר זה מתאר את התגובה ההתנהגותית של דגי זברה לתרכובות רעילות על ידי ניטור תנועת הזחל. הפרוטוקול בוחן גם דוגמה לתגובת זחלי הזברה למזהמים סביבתיים.

בדיקת תנועת זחלים: שיטה בעלת תפוקה גבוהה לחקר רעילות נוירו-התנהגותית של תרכובת בזחלי דגי זברה

סרטון זה מדגים בדיקה לא פולשנית לחקר אלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה. עם מדידת סליל הזנב בעוברים כתוצאה מדפולריזציה ספונטנית של הנוירונים המוטוריים של חוט השדרה, מוחל חוסם תעלות נתרן כדי להפחית את תדירות הסליל. לאחר מכן, העוברים משותקים באגרוז ומונחים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הנוירונים המוטוריים המהונדסים גנטית מבטאים ביו-חיישן חישת מתח עם תורם ופלואורופור מקבל. ירידה בפליטה פלואורופורית מקבלת מצביעה על ירידה בדפולריזציה הספונטנית של נוירונים מוטוריים עקב חוסם תעלות...

גישה לא פולשנית לחקר האלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה

מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים לחקור את התכונות החשמליות של תאים מעוררים בתנאים הפיזיולוגיים הלא פולשניים ביותר על ידי שימוש בעוברי דג הזברה במערכת in vivo יחד עם מחוון מתח מקודד גנטית (GEVI) מבוסס העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) המתבטא באופן סלקטיבי בסוג התא המעניין.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

מוצג כאן הוא שיטת אלקטרופורציה עבור משלוח ה-DNA של הפלזמה ותיוג תא ependymoglial במבוגר בלדג טלנצאלון. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה ויעילה כדי להמחיש ולעקוב אחר תאים ependymoglial בודדים ופותחת אפשרויות חדשות להחיל אלקטרופורציה על מגוון רחב של מניפולציות גנטיות.

שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

אנו מתארים את זרימת העבודה וניתוח הנתונים של מערכת סינון להערכת רעילות של תרכובות כימיות בהתבסס על תגובת הבהלה של רטט עובר דג הזברה. המערכת מתעדת את תנועותיהם של עוברי דגי זברה בחשיפה לגירוי רטט ומאפשרת הערכה משולבת של רעילות/קטלניות כללית ורעילות עצבית-שרירית.

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

פרוטוקול זה מציג שיטה אמינה להערכת תקינות מחסום הדם-מוח (BBB) במודל דג זברה בוגר (Danio rerio) באמצעות הערכה מבוססת צבע כחול של אוון, המאפשרת ניתוח איכותי וכמותי של הפרעה נוירו-וסקולרית.

הדמיה של שומר הסף: ההערכה מבוססת הצבע הכחול של אוון על חדירות מחסום דם-מוח בדג זברה בוגר

למדו שיטה לכימות חדירות הנוירואפיתל העוברי בדג הזברה באמצעות הזרקת פיטצי דקסטרן פלואורסצנטי ודימות לאורך זמן. טכניקה זו מאפשרת השוואת רקעים גנטיים ותנאים סביבתיים שונים.

Assay לחדירות של Neuroepithelium עוברי דג הזברה

גלה סרטונים נוספים