Name: שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: למד שיטה לשינוי משטחי נגיפים באמצעות כימיה לחץ bioorthogonal. מחקר זה מדגים שינוי adenovirus עם קבוצות azide וחיבור בדיקות פלואורסצנטיות לשיפור מיקוד גנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות NSF למימון (CBET-0846259).

<ol><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+%22Clickable%22+Amino+Acids+and+Sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors%3A+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li>
<li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li>
<li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+%28Ad%29+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li>
<li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Strain-Promoted+%5B3+%2B+2%5D+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li>
<li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

התפתחות של תגובות לחץ chemoselective ו bioorthogonal, כולל אלה של azides, הוא אזור מתפתח במהירות, מחקר, ולאחר מכן יש מספר גדל והולך של התגובות הללו לבחירה עבור יישומים bioconjugation. הגבלנו את היקף פרוטוקול זה כך שיכלול רק שתי שיטות אשר נבחרו בשל התועלת שלהם במעבדה שלנו וזמינות מסחרית של חומרים כימיים כל. במסלול הראשון מסוג זה - זן, לקדם אזיד-alkyne בחיי בן אשר (SPAAC) - alkyne נכלל בתוך טבעת cyclooctyne <strong...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> אדנווירוס מסוג 5 (Ad5) המכיל transgene GFP </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> כליה עובריים אנושיים (HEK 293) תאים </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco של שינוי הנשר בינוני (DMEM), גלוקוז גבוהות </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbecco של שינוי הנשר בינוני, לא מתיונין, לא ציסטאין (DMEM-Met /-Cys), גלוקוז גבוהות </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> בקר עגל סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> פניצילין - סטרפטומיצין 100 × פתרון (עט סטרפטוקוקוס) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0.5% טריפסין-EDTA (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> תא 100 מ&quot;מ צלחת תרבות, רקמות תרבות קלקר שטופלו </td><td> BD פלקון </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> תרבית תאים CO 2 באינקובטור </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית הממשלה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מזרק מסנן סטרילית (0.2 מיקרומטר, אצטט תאית) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (אירופה) </td></tr><tr><td> אוואנטי צנטריפוגות י&quot;א </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> צינורות חרוטי (50 מ&quot;ל, סטרילי) </td><td> BD פלקון </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> , צינור Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 מ&quot;ל, 14 x 89 מ&quot;מ </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrifuge מצויד 41 SW ו SW 60 rotor </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf Biopur Safe-נעל צינורות, 1.5 מ&quot;ל </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> סרכזת 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri בספט ספין ג&#39;ל סינון עמודות </td><td> פרינסטון הפרדות </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> מחט סטרילית, 18 מד </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חנקן תיק הכפפה (אם CuAAC deoxygenated יש לבצעם) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> בקבוק ויסקי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חנקן נוזלי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אלקטרופורזה התא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ל פלורסנט סורק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מוכן ג&#39;ל טריס-HCl ג&#39;ל </td><td> ביו רד </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthroline disulfonic חומצה (BDA) הרכב: מלח </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Sulfoxide דימתיל (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td></td><td></td></tr><tr><td> טריס הבסיס (טריס (hydroxymethyl) aminomethane) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> הרכב: פוספט (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספט בופר סליין (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M HCl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> גליצרול </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שור אלבומין בסרום </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-ציסטאין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-מתיונין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (dodecyl נתרן גופרתי) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> גליצין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol כחול </td><td></td><td></td></tr><tr><td> כלוריד צסיום (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> (אני) נחושת ברומיד (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סידן כלוריד (CaCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אשלגן כלורי (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלוריד (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alkyne בדיקה עבור * CuAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> טמרה alkyne </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> בדיקה מאומצת alkyne עבור * SPAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> טמרה DIBO alkyne </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Quick הספקים הבולטים של כימיה לחץ ריאגנטים וערכות כוללים Invitrogen, Jena Biosciences, ברי Associates, Sigma-Aldrich, גלן מחקר, לחץ על כלים כימיה Baseclick. מגוון של צבעים alkyne ו ligands המיקוד ניתן למצוא בקטלוגים של אותם ספקים.

שינוי chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ bioorthogonal

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

שינוי של חלקיקי נגיף קיבל כמות משמעותית של תשומת לב פוטנציאל אדיר שלו להשפיע על ריפוי גנטי, יישומים oncolytic ופיתוח החיסון. 1,2,3 גישות שוטפות למשקי שינוי משטחים ויראלי, שהם בעיקר גנטיקה מבוסס, לעיתים קרובות סובלים הנחתה התמרה של ייצור וירוס, infectivity ו הסלולר. 4,5 באמצעות כימיה לחץ chemoselective, פיתחנו גישה חלופית פשוטה אשר עוקפת בעיות אלה תוך שמירה הן גמישות מאוד נגיש. 1,2 מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את היעילות של שימוש כימיה לחץ bioorthogonal לשנות את פני השטח של סוג adenovirus 5 חלקיקים. תהליך זה שני שלבים ניתן להשתמש גם טיפולית 1 או אנליטי, 2,6 כפי שהוא מאפשר קשירת chemoselective של מולקולות, צבעים מיקוד או מולקולות אחרות של עניין על חלבוניםמראש תווית עם תגי אזיד. שלושת היתרונות העיקריים של השיטה הם (1) תיוג מטבולית מדגים מעט השפעה על כושר ויראלי, 1,7 (2) מגוון רחב של ligands מפעיל יכול להיות מנוצל, ו (3) הוא מהיר להפליא, אמינות קל לגשת. 1,2,7 בשלב הראשון של הליך זה, חלקיקים adenovirus מיוצרים הנושא או azidohomoalanine (אהה, פונדקאית מתיונין) או סוכר טבעי O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ושניהם מכילים אזיד (N-3) פונקציונלית הקבוצה. לאחר טיהור של אזיד-Modified חלקיקי נגיף, בדיקה alkyne המכיל מחצית ניאון טמרה הוא ligated באופן chemoselective על חלבונים או גליקופרוטאינים מראש שכותרתו. לבסוף, ניתוח SDS-PAGE מתבצע להפגין קשירת מוצלח של החללית על גבי חלבונים נגיפיים קפסיד. שילוב אהה מוצג לתייג כל capsid ויראליחלבונים (Hexon, פנטון ו Fiber), בזמן O-GlcNAz תוצאות לשילוב תיוג של סיבים בלבד. בתחום זה מתפתחת, מספר שיטות קשירת אזיד-alkyne פותחו בהצלחה, אך רק 2 מצאנו להיות הנוחה ביותר הם הפגינו להלן - זן, לקדם אזיד-alkyne בחיי בן אשר (SPAAC) ונחושת-catalyzed אזיד-alkyne בחיי בן אשר (CuAAC) תחת אווירה deoxygenated.

חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר azido<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. קבוצה אזיד של כל אחד ligated chemoselectively דרך &quot;לחץ&quot; התגובות כימיה כאמצעי שינוי פני ויראלי.

שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

שינויים במבנה חלקיקי נגיפים זכו לתשומת לב רבה בשל הפוטנציאל העצום שלהם להשפיע על טיפול גנטי, טיפול אונקוליטי...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטה גמישה להנדסה מחדש של מעטפות נגיפיות באמצעות כימיית קליק (click chemistry). בשלב הראשון של הליך זה, תאי כליה עובריים אנושיים מודבקים ב-adenovirus מסוג 5 ומודגרים בנוכחות של חומצת האמינו הבלתי טבעית homo alanine או סוכר האצטו parasite N acetoacetyl glucosamine. לאחר יומיים, חלקיקי ה-adenovirus המסומנים באזיד נאספים ומטוהרים.בשלב הבא, משתמשים בתגובת Azi Aine cyclo edition ספציפית כימית כדי לקשור גששים פלורסצנטיים לפני השטח של חלקיקים אלו. כפי שהוסבר בפרוטוקול הכתוב, פעולה זו מבוצעת באמצעות אחת משתי שיטות קישור אפשריות: קישור המהשרא על ידי מאמץ (strain promoted) או קישור המזרז על ידי נחושת (copper catalyzed azid ine cyclo edition).ביישומים טיפוליים, חיבורים אלו יכולים לכלול פוליפפטידים, פולימרים או מולקולות קטנות. בניסוי זה, נעשה שימוש בגשש פלואורסצנטי כדי שניתן יהיה להדגים את הליגציה של הגשש לחלבוני הקפסיד באמצעות SDS page. קיים עניין רב בפיתוח וירוסים כסוכני הולכה של גנים, במיוחד בהקשר של טיפולים תרופתיים, הולכת גנים, טיפול אונקוטי וטכנולוגיית חיסונים.בהקשר זה, כוונון הממשק בין הנגיף למארח הוא חשוב במיוחד לצורך השגת התכונות המתאימות לגירוי חיסוני המכוון לרקמה טיפולית. מספר גורמים נוספים הם חשובים עבור כוונון הממשק בין המארח לנגיף. בהקשר זה, פיתחנו פרוטוקול סימון דו-שלבי.השלב הראשון הוא הכנסה מטבולית של חומצת אמינו לא טבעית או סוכר לא טבעי. פעולה זו מתקינה נקודת עיגון שניתן להרחיב לאחר מכן באמצעות כימיה סלקטיבית ביותר, ובכך להוסיף לנגיפים אלו כמעט כל פונקציונליות הרצויה ללא הפרעה משמעותית לנגיף, ליכולת ההדבקה או לכושר ההישרדות הכללי, המהווים מכשול מרכזי שיש להתגבר עליו. לאחר סטריליזציה של מנדף הזרימה הלמינרית ושל ציוד המעבדה, הכין 11 צלחות תרבית של 100 מילימטר של תאי HEK 293 המגודלים במצע גידול HEK בטמפרטורה של 37 °C.לאחר שתשקיף תרבית התאים הופך ל-80 עד 90% confluent, הסר את מצע הגידול מאחת הצלחות ושטוף פעם אחת עם TD buffer. שחרר את התאים באמצעות מיליליטר אחד של trypsin EDTA והדגר למשך דקה אחת. הוסף תשעה מיליליטרים של מצע גידול וספור את מספר התאים שנאספו בצלחת זו.באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer), חשבו את מספר חלקיקי ה-adenovirus הדרושים להדבקה עבור כל אחת מ-10 צלחות התרבית שנותרו. הסירו באיטיות את מצע הגידול, ולאחר מכן שטפו עם חמישה מיליליטר של TD buffer. הוסיפו מיליליטר אחד של infection buffer והדגירו למשך שעה אחת במהלך תקופה זו.נער את הצלחות בעדינות מצד לצד בכל 15 דקות לאחר ההדבקה. הוסף בזהירות תשעה מיליליטרים של תווך גידול HEK לכל צלחת, והדגר למשך 18 שעות נוספות. ממסלולות מלאי מרוכזות של HA ב-Sistine.הכינו מצע לסימון HA בהתאם לפרוטוקול הכתוב. ודאו כי תחילה סיננתם תמיסות מלאי אלו באמצעות מסנן מזרק מסוג 0.2 micrometer. סטריליזו את תמיסת המלאי של המתיונין עבור הביקורת באותה דרך, הסירו בזהירות את מצע הגידול ושטפו כל צלחת תרבית עם five milliliters של TD buffer.החליפו זאת ב-10 milliliters של מצע סימון HA והדגירו את התאים המודבקים למשך שש שעות נוספות. חלבוני הקפסיד הוויראליים יתורגמו כעת בנוכחות azo homo alanine ובהעדר methionine. החליפו בזהירות את מצע הסימון ב-10 milliliters של מצע גידול טרי, והדגירו למשך 18 שעות נוספות.לאחר השלמת שלב זה, עברו להליך הטיהור בשלב השלישי של הסרטון. לחלופין, ניתן להחדיר תגי azi באמצעות סוכרים המכילים azi במקום החומצה האמינית הבלתי טבעית a HA. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב-n acetoacetyl galacto, שגורם למטבוליזם של טפיל כקדם-מטבולי ל-UDPN Acetoacetyl. Glucosamine משמש לצמיחה בנוכחות סוכר aceto זה.אדנווירוס מסוג 5 יציג קבוצות azi רק על הסיב (fiber) לצורך סימון סוכרים. ראשית, בצעו את שלב 1 של הסרטון עד להודעה שמופיעה על המסך. שלב זה תואם לשלב 1.5 בפרוטוקול הכתוב.הכינו את תמיסת סימון הסוכר על ידי העברת 100 µL של תמיסת סוכר ATO מרוכזת למבחנות פלקון (Falcon) והמתנה להתאיידות המתנול. לאחר מכן, הוסיפו 100 milliliters של מצע גידול ל-HEK. כסו את התאים בכל צלחת ב-10 milliliters ממצע סימון סוכר זה והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 44 שעות.עברו לשלב שלוש לצורך טיהור. העבירו את המצע יחד עם התאים המודבקים ממעטחת התרבית לשני מבחנות קוניות וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 2000 G למשך 10 דקות, בטמפרטורה של ארבע מעלות.הסר את supernatant ותלה את כל pellet ב-four milliliters של TD buffer באמצעות חנקן נוזלי ובאמבט של 37 degree. בצע שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה (freeze thaw) כדי ללוות את התאים המודבקים. ערבב את התו suspension באמצעות vortex בין מחזור למשנהו.סבב במערך צנטריפוגה את תגSuspend ההפשרה ב-2000 G למשך 10 דקות כדי להשקיע את שיירי התאים; מכיוון שהאדנווירוס ששימש להדבקה בשלב הראשון הכיל טרנסגן GFP, פעילות פלואורסצנטית בשלב זה מאשרת טרנסדוקציה וביטוי של ה-DNA הוויראלי. הכן בזהירות מדרג צפיפות של צסיום כלוריד בריכוזים שבין 1.25 גרם למילליליטר ל-1.4 גרם למילליליטר. העבר בעזרת פיפט את העלייה של התאים המולייסים אל מדרג הצפיפות וסבב במערך צנטריפוגה ב-126,000 G למשך שעה אחת בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס.לאחר הצנטריפוגציה, אמורה להופיע פס רחב ועבה בשפופרת הצנטריפוגה. זהו הווירוס שעבר מודיפיקציה של azi. בעזרת מחט star L, דקרו את תחתית השפופרת כך שהתוכן יטפטף, ואספו בזהירות את הווירוס זה.פס של שתי שיטות הליגציה הדגים את המאמץ. נתיב מעודד מאמץ כולל תנאי תגובה פשוטים יותר, אך בעל החיסרון של מבחר מוגבל יותר של גששים זמינים מסחרית לביצוע ליגציה מעודדת מאמץ. ערבב 50 µL של נגיף שעבר מודיפיקציה של אזיד בבופר אחסון נגיפים עם 0.25 µL של תמיסת סימון Tamara BCN על ידי נקישה בתחתית המבחנה המכוסה ברדיד אלומיניום, וסובב למשך הלילה בטמפרטורת החדר.טהר את נגיף ה-click באמצעות סינון ג'ל צנטריפוגלי. השתמש בעמודות ספין ששיווי המשקל שלהן הושג באמצעות תמיסת אחסון נגיפים. תגובת ה-cyclo addition המזורזת על ידי נחושת בתוספת חסר בחמצן מאפשרת זמינות גבוהה יותר של גששים, אך היא סובלת מהחיסרון של צורך בציוד ייעודי לשמירה על אטמוספירה נטולת חמצן.לביצוע ליגציה בתיווך נחושת. ראשית, יש לבצע דה-אוקסיגנציה לכל חומרי התגובה והתמיסות בתוך שק כפפות עם חנקן למשך שש שעות. בתום פרק זמן זה, הכין את תמיסת המלאי של קטליזטור הנחושת (I) בתוך שק הכפפות כדי להתחיל את התגובה. הוסף 1 µL מתמיסת מלאי הנחושת הזו ל-50 µL של תמיסת גשש נגיפי וחומר כלטציה.השאירו את תגובת הסימון להמשיך במהלך הלילה בתוך שקית הכפפות. טהרו את הסינון כפי שמתואר בשלב ארבע. לאחר הרתחה, טהרו את הנגיף שעבר תגובת click והוסיפו בופר לליזה של הדגימה למשך 10 דקות.טענו את הבארות עם הנגיף שנבחר ואת הביקורות ובצעו את האלקטרופורזה. השאירו את המיכל מכוסה בנייר אלומיניום כדי להגן על הגשש הפלואורסצנטי מפני אור. לאחר שעה אחת, השתמשו בסורק ג'לים פלואורסצנטי לסריקת הג'ל.שימו לב כי וירוסים שלמים או וירוסים שאינם מסומנים ב-I לא אמורים לדחוק סימון פלואורסצנטי משמעותי עבור סימון HA; וירוסים שהופקו בריכוז גבוה יותר של HA מראים סימון פלואורסצנטי רב יותר בשל דרגה גבוהה יותר של שילוב HA. כמו כן, שימו לב כי הווירוס המסומן בסוכר מבטא תגי azi אך ורק בחלבון הקפסיד של הסיב. החל מתאיים בהסמכה של 80%, יש להקצות יומיים להדבקה בסימון azi, חמש שעות לקציר ולטיהור של הווירוס המסומן, לילה אחד לתגובת ה-click, ושעתיים לניתוח SDS page, לסך הכל שלושה וחצי ימים. לסיכום, הוצגו שתי שיטות לסימון azi ושתי תגובות כימיה של click עם azid alkin.היישום והמשאבים העומדים לרשותכם צריכים לקבוע איזו שיטה או שיטות הן המתאימות ביותר למטרתכם. למרות שכל החומרים בפרוטוקול זה זמינים מסחרית, מצאנו כי סינתזה של סוכרי aceto של HA וגששי INE היא יעילה יותר מבחינה כלכלית ומאפשרת גמישות רבה יותר בשינויים של פני השטח של הנגיף.

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

אנו מציגים שיטה לקיבוע מהיר, הפיך של מולקולות קטנות והרכבות nanoparticle פונקציונליות ללימודי Surface Plasmon התהודה (SPR), תוך שימוש רציף לכידת הכימיה cycloaddition bioorthogonal ונוגדן אנטיגן על השבב.

Microfluidic תגובת Capture-חיי בן אשר על השבב כדי לשתק הפיך מולקולות קטנות או מבני Multi-רכיב עבור יישומי Biosensor

שיטה זו מתארת ​​את השימוש בכימיה לחץ כדי למדוד שינויים בשעתוק תא מארח לאחר הדבקה בנגיף קדחת הבקעה (RVFV) מתח MP-12. תוצאות יכולות להיות דמיינו איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או הושגו כמותית באמצעות cytometry הזרימה. שיטה זו ניתנת להתאמה לשימוש עם וירוסים אחרים.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להחדרת בדיקות כימיות באופן ספציפי לתוך מקטע נוגדנים על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד, ולאחר מכן צימוד האזיד עם בדיקה כימית על ידי תוספת ציקלו-אזיד-אלקין המקודמת על ידי זן (SPAAC).

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

שתכננו את החלבון capsid של וירוס הפטיטיס E כמו ננו-חלקיק theranostic (HEVNP). HEVNP עצמי מרכיבה לתוך כלוב icosahedral יציב במשלוח הרירית. כאן, אנו מתארים את השינוי של HEVNPs לגידול מיקוד על ידי מוטציה השטח החשופים שאריות אל cysteines, אשר נזווג סינתטי ליגנדים שקושרים במיוחד תאים סרטניים.

Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

כאן, אנו מציגים את הליך כדי fluorescently functionalize את disulfides על האח מים Qβ עם dibromomaleimide. אנו מתארים Qβ ביטוי טיהור, הסינתזה של מולקולות dibromomaleimide-functionalized, ואת התגובה ההטיה בין dibromomaleimide לבין Qβ. וכתוצאה מכך צהוב הניאון מצומדת החלקיק יכול לשמש מכשיר בדיקה קרינה פלואורסצנטית בתוך תאים.

ביצוע הנוצרות על-ידי ההטיה של חלקיקים דמויי וירוס PEGylated פלורסנט מאת כימיה Dibromomaleimide-דיסולפידי

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים במיוחד לשנות capsids אדנו-אתרים נבחרים על-ידי כימיה פשוטה. אדנו מסוככים את המומנט חלקיקים וקטורים העברת גנים retargeted יכול להיווצר ו החרקי המארח יכול להילמד.

בשילוב שינויים Capsid גנטי וכימי של וקטורים המבוסס על אדנו העברה גנטית עבור הגנה ומיקוד

פרוטוקול לסינתזה ומדידה של המאפיינים הפוטוכימיים של תרכובות בכלוב מודולרי עם moieties לחיץ מוצג.

עיצוב, סינתזה ומאפייני פוטוכימיקלים של תרכובות בכלוב לחיצים

המחקר של acylation שומן יש השלכות חשובות אינטראקציות חלבון הסלולר ומחלות. מוצג כאן הוא פרוטוקול שונה כדי לשפר את זיהוי הכימיה קליק של חלבונים acylated שומן, אשר ניתן ליישם בסוגי תאים שונים בשילוב עם בדיקות אחרות, כולל מרדף דופק ספקטרומטריית מסה.

שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

כאן, אנו מציעים פרוטוקול פשוט המשלב הנדסת אוליגוסכריד מטבולית, כימיית קליקים ומיקרוסקופ הרחבה המאפשר הדמיה ביולוגית של N-גליקופרוטאינים תוך-תאיים עם רזולוציה משופרת באמצעות ציוד מיקרוסקופיה שגרתי.

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

למד שיטה לשינוי משטחי נגיפים באמצעות כימיה לחץ bioorthogonal. מחקר זה מדגים שינוי adenovirus עם קבוצות azide וחיבור בדיקות פלואורסצנטיות לשיפור מיקוד גנטי.

שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

גלה סרטונים נוספים