שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטה גמישה להנדסה מחדש של מעטפות נגיפיות באמצעות כימיית קליק (click chemistry). בשלב הראשון של הליך זה, תאי כליה עובריים אנושיים מודבקים ב-adenovirus מסוג 5 ומודגרים בנוכחות של חומצת האמינו הבלתי טבעית homo alanine או סוכר האצטו parasite N acetoacetyl glucosamine. לאחר יומיים, חלקיקי ה-adenovirus המסומנים באזיד נאספים ומטוהרים.

בשלב הבא, משתמשים בתגובת Azi Aine cyclo edition ספציפית כימית כדי לקשור גששים פלורסצנטיים לפני השטח של חלקיקים אלו. כפי שהוסבר בפרוטוקול הכתוב, פעולה זו מבוצעת באמצעות אחת משתי שיטות קישור אפשריות: קישור המהשרא על ידי מאמץ (strain promoted) או קישור המזרז על ידי נחושת (copper catalyzed azid ine cyclo edition).

ביישומים טיפוליים, חיבורים אלו יכולים לכלול פוליפפטידים, פולימרים או מולקולות קטנות. בניסוי זה, נעשה שימוש בגשש פלואורסצנטי כדי שניתן יהיה להדגים את הליגציה של הגשש לחלבוני הקפסיד באמצעות SDS page. קיים עניין רב בפיתוח וירוסים כסוכני הולכה של גנים, במיוחד בהקשר של טיפולים תרופתיים, הולכת גנים, טיפול אונקוטי וטכנולוגיית חיסונים.

בהקשר זה, כוונון הממשק בין הנגיף למארח הוא חשוב במיוחד לצורך השגת התכונות המתאימות לגירוי חיסוני המכוון לרקמה טיפולית. מספר גורמים נוספים הם חשובים עבור כוונון הממשק בין המארח לנגיף. בהקשר זה, פיתחנו פרוטוקול סימון דו-שלבי.

השלב הראשון הוא הכנסה מטבולית של חומצת אמינו לא טבעית או סוכר לא טבעי. פעולה זו מתקינה נקודת עיגון שניתן להרחיב לאחר מכן באמצעות כימיה סלקטיבית ביותר, ובכך להוסיף לנגיפים אלו כמעט כל פונקציונליות הרצויה ללא הפרעה משמעותית לנגיף, ליכולת ההדבקה או לכושר ההישרדות הכללי, המהווים מכשול מרכזי שיש להתגבר עליו. לאחר סטריליזציה של מנדף הזרימה הלמינרית ושל ציוד המעבדה, הכין 11 צלחות תרבית של 100 מילימטר של תאי HEK 293 המגודלים במצע גידול HEK בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר שתשקיף תרבית התאים הופך ל-80 עד 90% confluent, הסר את מצע הגידול מאחת הצלחות ושטוף פעם אחת עם TD buffer. שחרר את התאים באמצעות מיליליטר אחד של trypsin EDTA והדגר למשך דקה אחת. הוסף תשעה מיליליטרים של מצע גידול וספור את מספר התאים שנאספו בצלחת זו.

באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer), חשבו את מספר חלקיקי ה-adenovirus הדרושים להדבקה עבור כל אחת מ-10 צלחות התרבית שנותרו. הסירו באיטיות את מצע הגידול, ולאחר מכן שטפו עם חמישה מיליליטר של TD buffer. הוסיפו מיליליטר אחד של infection buffer והדגירו למשך שעה אחת במהלך תקופה זו.

נער את הצלחות בעדינות מצד לצד בכל 15 דקות לאחר ההדבקה. הוסף בזהירות תשעה מיליליטרים של תווך גידול HEK לכל צלחת, והדגר למשך 18 שעות נוספות. ממסלולות מלאי מרוכזות של HA ב-Sistine.

הכינו מצע לסימון HA בהתאם לפרוטוקול הכתוב. ודאו כי תחילה סיננתם תמיסות מלאי אלו באמצעות מסנן מזרק מסוג 0.2 micrometer. סטריליזו את תמיסת המלאי של המתיונין עבור הביקורת באותה דרך, הסירו בזהירות את מצע הגידול ושטפו כל צלחת תרבית עם five milliliters של TD buffer.

החליפו זאת ב-10 milliliters של מצע סימון HA והדגירו את התאים המודבקים למשך שש שעות נוספות. חלבוני הקפסיד הוויראליים יתורגמו כעת בנוכחות azo homo alanine ובהעדר methionine. החליפו בזהירות את מצע הסימון ב-10 milliliters של מצע גידול טרי, והדגירו למשך 18 שעות נוספות.

לאחר השלמת שלב זה, עברו להליך הטיהור בשלב השלישי של הסרטון. לחלופין, ניתן להחדיר תגי azi באמצעות סוכרים המכילים azi במקום החומצה האמינית הבלתי טבעית a HA. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב-n acetoacetyl galacto, שגורם למטבוליזם של טפיל כקדם-מטבולי ל-UDPN Acetoacetyl. Glucosamine משמש לצמיחה בנוכחות סוכר aceto זה.

אדנווירוס מסוג 5 יציג קבוצות azi רק על הסיב (fiber) לצורך סימון סוכרים. ראשית, בצעו את שלב 1 של הסרטון עד להודעה שמופיעה על המסך. שלב זה תואם לשלב 1.5 בפרוטוקול הכתוב.

הכינו את תמיסת סימון הסוכר על ידי העברת 100 µL של תמיסת סוכר ATO מרוכזת למבחנות פלקון (Falcon) והמתנה להתאיידות המתנול. לאחר מכן, הוסיפו 100 milliliters של מצע גידול ל-HEK. כסו את התאים בכל צלחת ב-10 milliliters ממצע סימון סוכר זה והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 44 שעות.

עברו לשלב שלוש לצורך טיהור. העבירו את המצע יחד עם התאים המודבקים ממעטחת התרבית לשני מבחנות קוניות וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 2000 G למשך 10 דקות, בטמפרטורה של ארבע מעלות.

הסר את supernatant ותלה את כל pellet ב-four milliliters של TD buffer באמצעות חנקן נוזלי ובאמבט של 37 degree. בצע שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה (freeze thaw) כדי ללוות את התאים המודבקים. ערבב את התו suspension באמצעות vortex בין מחזור למשנהו.

סבב במערך צנטריפוגה את תגSuspend ההפשרה ב-2000 G למשך 10 דקות כדי להשקיע את שיירי התאים; מכיוון שהאדנווירוס ששימש להדבקה בשלב הראשון הכיל טרנסגן GFP, פעילות פלואורסצנטית בשלב זה מאשרת טרנסדוקציה וביטוי של ה-DNA הוויראלי. הכן בזהירות מדרג צפיפות של צסיום כלוריד בריכוזים שבין 1.25 גרם למילליליטר ל-1.4 גרם למילליליטר. העבר בעזרת פיפט את העלייה של התאים המולייסים אל מדרג הצפיפות וסבב במערך צנטריפוגה ב-126,000 G למשך שעה אחת בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגציה, אמורה להופיע פס רחב ועבה בשפופרת הצנטריפוגה. זהו הווירוס שעבר מודיפיקציה של azi. בעזרת מחט star L, דקרו את תחתית השפופרת כך שהתוכן יטפטף, ואספו בזהירות את הווירוס זה.

פס של שתי שיטות הליגציה הדגים את המאמץ. נתיב מעודד מאמץ כולל תנאי תגובה פשוטים יותר, אך בעל החיסרון של מבחר מוגבל יותר של גששים זמינים מסחרית לביצוע ליגציה מעודדת מאמץ. ערבב 50 µL של נגיף שעבר מודיפיקציה של אזיד בבופר אחסון נגיפים עם 0.25 µL של תמיסת סימון Tamara BCN על ידי נקישה בתחתית המבחנה המכוסה ברדיד אלומיניום, וסובב למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

טהר את נגיף ה-click באמצעות סינון ג'ל צנטריפוגלי. השתמש בעמודות ספין ששיווי המשקל שלהן הושג באמצעות תמיסת אחסון נגיפים. תגובת ה-cyclo addition המזורזת על ידי נחושת בתוספת חסר בחמצן מאפשרת זמינות גבוהה יותר של גששים, אך היא סובלת מהחיסרון של צורך בציוד ייעודי לשמירה על אטמוספירה נטולת חמצן.

לביצוע ליגציה בתיווך נחושת. ראשית, יש לבצע דה-אוקסיגנציה לכל חומרי התגובה והתמיסות בתוך שק כפפות עם חנקן למשך שש שעות. בתום פרק זמן זה, הכין את תמיסת המלאי של קטליזטור הנחושת (I) בתוך שק הכפפות כדי להתחיל את התגובה. הוסף 1 µL מתמיסת מלאי הנחושת הזו ל-50 µL של תמיסת גשש נגיפי וחומר כלטציה.

השאירו את תגובת הסימון להמשיך במהלך הלילה בתוך שקית הכפפות. טהרו את הסינון כפי שמתואר בשלב ארבע. לאחר הרתחה, טהרו את הנגיף שעבר תגובת click והוסיפו בופר לליזה של הדגימה למשך 10 דקות.

טענו את הבארות עם הנגיף שנבחר ואת הביקורות ובצעו את האלקטרופורזה. השאירו את המיכל מכוסה בנייר אלומיניום כדי להגן על הגשש הפלואורסצנטי מפני אור. לאחר שעה אחת, השתמשו בסורק ג'לים פלואורסצנטי לסריקת הג'ל.

שימו לב כי וירוסים שלמים או וירוסים שאינם מסומנים ב-I לא אמורים לדחוק סימון פלואורסצנטי משמעותי עבור סימון HA; וירוסים שהופקו בריכוז גבוה יותר של HA מראים סימון פלואורסצנטי רב יותר בשל דרגה גבוהה יותר של שילוב HA. כמו כן, שימו לב כי הווירוס המסומן בסוכר מבטא תגי azi אך ורק בחלבון הקפסיד של הסיב. החל מתאיים בהסמכה של 80%, יש להקצות יומיים להדבקה בסימון azi, חמש שעות לקציר ולטיהור של הווירוס המסומן, לילה אחד לתגובת ה-click, ושעתיים לניתוח SDS page, לסך הכל שלושה וחצי ימים. לסיכום, הוצגו שתי שיטות לסימון azi ושתי תגובות כימיה של click עם azid alkin.

היישום והמשאבים העומדים לרשותכם צריכים לקבוע איזו שיטה או שיטות הן המתאימות ביותר למטרתכם. למרות שכל החומרים בפרוטוקול זה זמינים מסחרית, מצאנו כי סינתזה של סוכרי aceto של HA וגששי INE היא יעילה יותר מבחינה כלכלית ומאפשרת גמישות רבה יותר בשינויים של פני השטח של הנגיף.