תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש ב-Eliza רציפה בתפוקה גבוהה על מנת לנתח ביעילות מספר רב של סמנים ביולוגיים חדשים שהתגלו על ידי פרוטאומיקה. זה מושג על ידי הוספת דגימות תחילה ללוחית מקור, המשמשת ליצירת דילול לכל סמן ביולוגי ולאחסון פלזמה משוחזרת בין בדיקות. לאחר מכן, אלייזה מופעלת עבור כל חלבון על מנת לקבוע את הריכוזים שלהם בדגימות המטופלים.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את העלייה ברמות החלבון של סמנים ביולוגיים אלה בתחילת הביטויים הקליניים של מחלת השתל החריפה לעומת המארח. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שמנתחים עוקבים יכולים לנתח מספר חלבונים חדשים שלא תמיד זמינים עם פלטפורמות ריבוב. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת אבחנה של מחלת השתל החריפה נגד המארח.

מכיוון שסמנים ביולוגיים מאומתים בשיטה זו נחקרים כעת לטיפול קליני. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סיבוכים בהשתלת תאי גזע פואטיים פוסט-טראומטיים. ניתן ליישם אותו גם לגילוי ואימות סמנים ביולוגיים למחלות אחרות כגון השתלת ריאות, סיבוכים, סרטן ריאות, או פוטנציאלית כל מחלה שעבורה בדיקת דם אבחנתית תהיה שימושית.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שחשוב שהשלבים המרובים יבוצעו באופן עקבי כדי להבטיח שחזור ושונות אצווה נמוכה ביום שלפני הניסוי, סובב דגימות פלזמה מחושבות למשך 10 דקות ב-15, 300 RCF וארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד בין הקרישים בתחתית והשומנים בחלק העליון מהפלזמה. לאחר מכן צלחו 150 מיקרוליטר של פלזמה לא מדוללת מכל דגימה על צלחת תחתונה של 96 באר V על ידי פיפטינג ידני על פי מפות מוגדרות מראש. עטפו את הצלחת בפרפורם והניחו אותה בתא אנושי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד 72 שעות.

לאחר מכן, לאחר בנייה מחדש ודילול של IL שני קולטני אלפא וגורם גדילה אנושי, או נוגדנים לוכדים HGF לפי לוחית המפרט של היצרן, 50 מיקרוליטר של כל נוגדן לכל באר של 96 לוחות חצי באר קשירה גבוהים בהתאמה. לאחר מכן אוטמים את הצלחות הללו עם אוטם צלחות ומדגרים אותן למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. כעת יש לדלל את ה-reg three alpha עם מאגר הציפוי של היצרן על פי פרוטוקול היצרן ולצלחת 25 מיקרוליטר של התמיסה לכל באר של באר 3 84 ללא צלחת מקסור.

לאחר מכן אחסן את הצלחת הזו אטומה בארבע מעלות צלזיוס גם ביום הראשון של הניסוי. התחל בשטיפת לוחית הבדיקה של שני קולטני אלפא IL וחסימתה עם כתם ב-TBS. לאחר בנייה מחדש של התקן, הגדר עקומת תקן של שמונה נקודות לפי פרוטוקול היצרן.

הצלחת הבאה, 50 מיקרוליטר פלזמה לא מדוללת ו -50 מיקרוליטר מכל תקן בשכפול מלוח המקור ללוחית הבדיקה של ELIZA. לאחר מכן דגרו את הצלחת האטומה בטמפרטורת החדר על מסובב צלחת המוגדר ל -300 סל"ד. לאחר שעתיים, החזר את הפלזמה מלוחית הבדיקה של קולטן IL שני אלפא ELIZA והנח אותה בחזרה ללוחית מקור הפלזמה הלא מדוללת.

לאחר מכן, לאחר השלמת ה-EIA לפי פרוטוקול היצרן, קרא את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא צלחות המוגדר ל-450 עד 570 ננומטר עבור שלושת האלפא העשירים אלייזה העבירו תחילה 10 מיקרוליטר של פלזמה לא מדוללת ללוחית מקור תחתונה נפרדת, ולאחר מכן הוסיפו 90 מיקרוליטר של מאגר הדילול שסופק על ידי היצרן לכל באר כדי ליצור לוחית מקור דילול של 1 עד 10. לאחר השלמת ה-Reg שלוש אלפא אליזה, לפי פרוטוקול היצרן, הוסף את תמיסת העצירה לצלחת הבאר 384 וקרא את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא צלחות המוגדר ל-450 עד 620 ננומטר. לאחר בנייה מחדש ודילול של הפיל ו-tn FFR, נוגדני לכידה אחד לפי קוד מפרט היצרן כל באר של 96 לוחות חצי באר מחייבים גבוהים בהתאמה עם 50 מיקרוליטר של נוגדני הלכידה.

לאחר מכן דגרו את לוחות הבדיקה האטומים למשך הלילה בטמפרטורת החדר עבור צלחת הפיל ובארבע מעלות צלזיוס עבור צלחת TN FFR אחת. לאחר השלמת IL שני קולטני אלפא אלייזה מעבירים 60 מיקרוליטר של פלזמה לא מדוללת ללוחית מקור חדשה. ואז ב-60 מיקרוליטר של 1% BSA ב-PBS לכל באר כדי ליצור צלחת מקור פלזמה מדוללת אחת עד שתיים.

לאחר מכן שטפו וחסמו את לוחית הבדיקה HGF עם BLOTTO ב-TBS ולאחר מכן הגדירו את דילול העקומה הסטנדרטית של שמונה נקודות. לאחר שטיפת הצלחת, בעקבות לוחית הצעד החוסמת 50 מיקרוליטר, שכפל כמויות של פלזמה מדוללת אחת עד שתיים ושל כל תקן על לוחית הבדיקה EISA. לאחר מכן דגרו את הצלחת האטומה למשך הלילה בטמפרטורת החדר על מסובב צלחת הגדר 300 סל"ד.

למחרת בבוקר, החזר את הפלזמה המדוללת אחת או שתיים מלוח הבדיקה של HGF Eliza והנח אותה בחזרה בצלחת מקור הפלזמה המדוללת אחת עד שתיים. לאחר השלמת ה-EIA, על פי פרוטוקול היצרן, קרא את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא לוחות המוגדר ל-450 עד 570 ננומטר ביום השני של הניסוי. תחילה העבירו 10 מיקרוליטר של פלזמה לא מדוללת ללוחית מקור חדשה, ולאחר מכן 190 מיקרוליטר של 1% BSA ב-PBS כדי ליצור 200 מיקרוליטר של פלזמה מדוללת אחת.

לאחר מכן, לאחר השלמת הפיל, אלייזה, על פי פרוטוקול היצרן, קראה את הצפיפות האופטית באמצעות קורא לוחות המוגדר ל-450 עד 570 ננומטר. עבור TN FFR, אלייזה הוסיפה תחילה 25 מיקרוליטר של 1% BSA ו-PBS ללוחית המקור של 1 עד 20 וכתוצאה מכך 125 מיקרוליטר של פלזמה מדוללת אחת עד 25 לבאר. לאחר מכן, לאחר השלמת TN FFR EIA אחד לפי פרוטוקול היצרן, קרא את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא צלחות המוגדר ל-450 עד 570 ננומטר להעברה הראשונה של I-L-H-E-I-A, 60 מיקרוליטר של פלזמה מדוללת אחת עד שתיים ללוחית מקור חדשה, ולאחר מכן הוסף 180 מיקרוליטר של שמונה מדלל IL לכל באר כדי ליצור לוחית מקור פלזמה מדוללת אחת עד שישה.

לאחר מכן, לאחר השלמת ה-ILH Eliza לפי פרוטוקול היצרן, קרא את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא צלחות המוגדר ל-450 עד 570 ננומטר. לבסוף, לאחר השלמת כל האליזה, החלף את פלזמת הדיבור שאינה בשימוש ב-Eloqua והקפיא לשימוש עתידי. בגרף זה, הצפיפות האופטית עבור העקומה הסטנדרטית של שבע לוחות ELIZA שונים המודדים את ריכוזי האלפא הרגילים המתאימים ל-1084 החולים שנבדקו עבור הדוח הראשוני של שתל אלפא במערכת העיכול לעומת סמן ביולוגי של מחלת המארח מוצגות צפיפות אופטית עקבית בין הלוחות מבטיחה מדידות ריכוז חלבון עקביות בין הניסויים.

ריכוזי החלבונים בדגימות הפלזמה חושבו על ידי השוואת הצפיפות האופטית של הדגימה לצפיפות האופטית של העקומה הסטנדרטית. ניתן להשתמש בפלטפורמת טיפול נקייה רובוטית כדי להגדיל עוד יותר את יכולת השחזור תוך הפחתת נפח הפלזמה המשמשת את הפעלת אלייזה וצלחות באר יצירתיות. בעת תכנון הליך זה, חשוב להריץ תחילה EISs שהם פלזמה לא מדוללת כדי שניתן יהיה לשחזר אותה ולהשתמש בה בניסויים מאוחרים יותר לאחר פיתוחה.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרוטאומיקה לחקור סמנים ביולוגיים מועמדים בכל מחלה מעניינת באמצעות שימוש אוניברסלי ב-Eliza s. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאמת סמנים ביולוגיים מרובים באמצעות E רציף תוך שימוש בכמויות קטנות של פלזמה ומזעור מחזורים חופשיים.