Name: איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: למד שיטה חדשה לאיתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי באמצעות קולטן TVA. טכניקה זו מאפשרת ניתוח בקצב גבוה של מעגלים עצביים במערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות שון וילן לסיוע בהצלת ריאנטים VSV רקומביננטי, וDidem גוז וריאן Chrenek לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי HHMI (CLC), ו# NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שימוש בוירוסים כדי ללמוד מעגלים עצביים הוא שיטת תפוקה גבוהה יחסית של ניתוח נוירונים מקושרים. עם זאת, שהניב גם virions RABV VSV ואינו טריוויאלי. למרות שהפרוטוקול מפורט לעיל להצלת וירוס מcDNA מסופק, זה עדיין אירוע הסתברות נמוכה. הרמות של כל אחד מN, P, ופלסמידים L צריכות להיות מותאמות היטב, וניסויים רבים ומשכפל צריכים לעשות כדי להבטיח הצלה נגיפית. היווצרותו של חלקיק ribonucleotide שילוב VSV גנום הרנ&quot;א מלא היא אירוע הסתברות נמוכה, ולכן עלול לקחת כמה ניסיונות. טכניקה זו עשויה לדרו...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;תרבית רקמות&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>תאי כליה של חולדה צעירה (BSRT7)</td><td>זמין על פי בקשה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccinia (vTF7-3)</td><td>זמין על פי בקשה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלסמידים pN, pP, pl</td><td>זמין על פי בקשה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידום כלורי</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלורי</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>תאי HEK 293T</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית בטיפול TC, 60 mm</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים מלבני עם צוואר נטוי ופק עם פתח אוורור, 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>מצע: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7.4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: סרום עגל עוברי</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>סוכן טרנספקציה Lipofectamine 2,000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>מזרק: מזרק Luer-Lock בנפח 5 ml</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מזרק</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: PEI לינארי בעוצמה גבוהה</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;צנטריפוגה ויראלית&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>מערכת סינון ואקום עליונה למבחנה של 150 ml, נקבוביות 0.45 &amp;mu;m, של Corning</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות אולטרצנטריפוגה דופן דקה, שקיפות גבוהה, 38.5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>אולטרצנטריפוגה</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>רוטור אולטרצנטריפוגה SW28</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;הזרקה לעכבר&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>מיקרופיפטות קפילריות</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסי</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Ump</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>בקר מיקרו של ארבעה ערוצים</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>מנוע שולחן M.TXB עם בקר חוגה C.EMX-1, 115 וולט</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>ידית H.10, החלפה מהירה</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>מקדח מדורג, 0.5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מיקרו&amp;#8211;אלקטרודה</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>קסילאזין</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>מחט הזרקה 30 gauge</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>משחה עינית מגנה</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>יוד</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;כלי ניתוח ודיסקציה&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה סטנדרטית</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עדינה</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>מספרי קפיץ של ואנאס</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>ידית סקאלפל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>להבי סקאלפל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>חוטי תפירה</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;דיסקציה וצביעת נוגדנים&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>פראפורמלהיד</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>סליין פוספט (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;נוגדנים&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>נוגדנים</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Dylight 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;קיבוע רקמות&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>לשוניות מיקרוסקופ Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי 22 x 22, עובי 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>אלסטומר סיליקון</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>לק שקוף לציפורניים</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>סוכן למניעת דהייה Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

שיטות קלסיות לחקר מעגלים עצביים הן תפוקה נמוכה למדי. וירוסי Transsynaptic, במיוחד pseudorabies (PRV) ונגיף כלבת (RABV), ולאחרונה שלפוחי וירוס stomatitis (VSV), ללימוד מעגלים, יותר ויותר פופולריים. שיטות תפוקה גבוהות אלה להשתמש וירוסים שמשדרים בין הנוירונים בשני כיווני אנטרוגרדית או מדרדר. לאחרונה, RABV שונה לאיתור מדרדר monosynaptic פותח. (איור 1 א). בשיטה זו, גליקופרוטאין הגן (G) נמחק מהגנום הנגיפי, והצטייד במצרכים רק בנוירונים ממוקדים. הספציפיות זיהום מושגת על ידי החלפת G chimeric, מורכב מהתחום התאי של ASLV-גליקופרוטאין ותחום cytoplasmic של RABV-G (/ RG), לנורמלי 1 RABV-G. G chimeric זה במיוחד מדביק תאים המבטאים את הקולטן TVA 1. גן קידוד TVA יכול היה דelivered על ידי שיטות שונות 2-8. בעקבות זיהום RABV-G של נוירון TVA מבטא, RABV יכול לשדר לנוירונים אחרים, הקשורות בsynaptically כיוון מדרדר ידי הטבע של G שלו אשר היה השותף נמסר-עם קולט TVA. טכניקה זו מתייגת מספר רב יחסי של תשומות (5-10%) 2 על סוג תא מוגדר, מתן דגימה של כל תשומות על סוג תא תנע מוגדר. אנחנו שונים לאחרונה בטכניקה זו כדי להשתמש VSV כ9 נותב transsynaptic. VSV יש מספר יתרונות, כולל המהירות של ביטוי גנים. כאן אנחנו פירוט מערכת איתור נגיפית חדשה באמצעות VSV השימושי לחקור microcircuitry עם רזולוציה מוגברת. בעוד אסטרטגיות המקוריות שפורסמו על ידי Wickersham et al. 4 ו אייר et al. תיוג 9 היתר של כל הנוירונים שמשליכים על נגוע, תחילה TVA-להביע תאים, כאן VSV תוכנן לשידור רק לטלביזיהתאים המבטאים-(האיור 1B). וירוס pseudotyped הראשון עם RABV-G להתיר זיהום של מורד הנוירונים של נוירונים המבטאים TVA-. לאחר הדבקת האוכלוסייה ראשונה זה של תאים, הווירוס יכול להדביק תאים שוחרר TVA מבטא בלבד. בגלל ההתפשטות הנגיפית transsynaptic מוגבלת לתאים המבטאים TVA-, נוכחות של העדר קישוריות מסוגי תאים מוגדרים ניתן לחקור ברזולוציה גבוהה. תרשים זרימה ניסיונית של ניסויים אלה מוצג באיור 2. כאן אנו מציגים מודל מעגל, שכיוון של-הסלקטיביות ברשתית העכבר. אנו בודקים את הקישוריות של תאי התפרצות כוכבי amacrine (צקים) לתאי הגנגליון ברשתית (RGCs).

שיטה של ​​התחקות נוירונים הקשורים synaptically מתוארת. אנו משתמשים סגוליים TVA של תא במעלה זרם כדי לבחון אם אוכלוסיית תא של עניין מקבלת קלט סינפטי מסוגי תאים מוגדרים מבחינה גנטית.

שיטות קלאסיות לחקר מעגלים עצביים הן בעלות תפוקה נמוכה למדי. נגיפים טרנס-סינפטיים, ובמיוחד נגיף הפסאודורביס (PRV) ונגיף הכלבת...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח טכניקה חדשה לניתוח של מעגלים זעירים (microcircuitry) במערכת העצבים המרכזית. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הגדרת אוכלוסיית נוירונים להדבקה באמצעות ביטוי של קולטן TVA. כשלב שני, מוזרק נגיף טרנס-סינפטי למערכת העצבים המרכזית, המדביק את הנוירונים הראשוניים הנבחרים.בשלב הבא, הנגיף יתפשט באופן טרנס-סינפטי רק לנוירונים מחוברים המבטאים את רספטור ה-TVA. כדי לבחון האם נוירונים אלו מחוברים, הושגו תוצאות המראות כי ניתן להשתמש בטכניקה זו לניתוח מיקרו-מעגלים, בהסתמכות על תיקוף של סימון מיקרו-מעגלים ידועים כמחוברים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופיה, הוא היותה שיטה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח מעגלים נוירונליים.הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר קראנו את המחקר הראשון על מעקב ויראלי מוגבל לסינפסה אחת (mono synaptically restricted viral tracing) על ידי wickersham ועמתו. הרגשנו שניתן להנדס וירוסים באופן מעמיק יותר כדי לחקור נוירונים מחוברים בדרכים חדשניות. אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב לפרטים על השגתו של VSV מ-CD NA באמצעות מערכת VACCINIA T seven כדי לייצר תאים למעבר (passaging).ראשית, שאבו את המצע מארבעה צלחות בן 10 סנטימטר של תאי TV-H800 שהגיעו ל-80% התמסרות (confluency) ונשתלו ביום הקודם, והחליפו אותו ב-5 mL של DMEM ללא תוספות. בצעו טרנספקציה לכל צלחת עם 5 µg של הפלסמיד המקודד עבור הגליקופרוטאין המבוקש, בהתאם לנהלים הסטנדרטיים. כשיע hour שש לאחר הטרנספקציה, החליפו את המצע ב-DMEM מועשר ב-10% FBS. דגרו את הצלחות למשך לילה במדגרת תרביות רקמה המכוונת ל-34 °C עם 5% CO2, כדי לאפשר ביטוי של הגליקופרוטאין והצטברותו על פני השטח.לאחר הדגירה, שאבו את המצע והחליפו אותו בחמישה מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS, ולאחר מכן הדביקו כל צלחת ב-VSV המכיל את הגליקופרוטאין הכימרי MA rabies G בריבוי הדבקה (MOI) של 0.01 עד 0.1 והדגירו בטמפרטורה של 34 degrees Celsius למשך הלילה. לאחר 24 שעות, בדקו את רמות ההדבקה בכל צלחת באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. אם יותר מ-50% מהתאים הודבקו, אספו את המצע.החליפו בחמישה מיליליטרים של מצע טרי ולאחר מכן הקפיאו את המצע שנאסף במינוס 80 מעלות צלזיוס. חזרו על הליך האיסוף לאחר 24 שעות למשך שלושה ימים, כך שסך כל תקופת האיסוף תהיה ארבעה ימים. הקפיאו כל מנה של מצע שנאסף לאחר שהמנה האחרונה קפאה לחלוטין במינוס 80 מעלות צלזיוס, כאשר כל מנות המצע שנאספו נשמרות ב-37 מעלות צלזיוס עד לנקודה זו; בשלב זה צריכים להיות 80 מיליליטרים של מצע שנאסף. סננו את המצע שנאסף דרך מסנני 0.45 מיקרון על קרח.לאחר מכן, העבירו מנה של 36 milliliters של וירוס לשפופרת צנטריפוגה של Beckman, ורכזו את העלייה (supernatant) באמצעות אולטרצנטריפוגציה ב-80,000 times G למשך 90 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. ודאו כי הרוטור מאוזן כראוי; לאחר הצנטריפוגיה, העבירו את השפופרות לכלי המכיל 10% bleach והשתמשו בשואב (aspirator) כדי להסיר נוזלים מדפנות השפופרת. לאחר מכן, נערה את השפופרות המכילות את הווירוס במהירות של 120 RPM למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, והשעיקו מחדש את משקע הווירוס (viral pellet) בנפח המינימלי האפשרי, שבדרך כלל הוא סביב 30 microliters.לאחר השעיית הנגיף, יש לתתר את הנגיף על ידי הדבקה של פלטת 24 בארות עם תאי 2 9 3 T, באמצעות סדרת דילול עשרית מ-1 עד 1 מיליון, ותתר כיומיים לאחר ההדבקה. בהתאם לנהלים סטנדרטיים, ניתן לזהות תאים שהודבקו בנגיף באמצעות פלואורסצנציה. חשוב להשתמש בקו התאים המתאים לניסויים אלה.המטרה היא להביא לביטוי של קולטן TVA בסוגי התאים שברצוננו למפות. ניתן להשיג זאת על ידי ביטוי של קולטן TVA באמצעות אמצעים ויראליים או באמצעות אלל טרנסגני. ניסוי זה משתמש בעכברים טריפל-טרנסגניים בני שש עד 10 שבועות.עכברים המבטאים אלל TVA מותנה יורשבו עם עכברים המבטאים אלל chat-Cre. לאחר מכן, עכברים אלו יורשבו עם שורה המבטאת אלל TD-tomato פלורסצנטי. העכבר התרגני הסופי מבטא TVA ואלל TD-tomato מותנה בכל התאים המבטאים Cre, כולל תאי ה-starburst omicron המדוברים.ניתן להדמיות ביטוי זה באמצעות מיקרוסקופיה פלורסצנטית. בדקו את הקואורדינטות הסטריאוטקסיות עבור אזור העניין באטלס של מוח עכבר, והכינו את המכשיר הסטריאוטקסי על ידי הפעלת הבקר של המיקרו-מזרק והבאת הבוכנה ומחזיק האלקטרודה למקום. לאחר מכן, מלאו את המחט בשמן מינרלי כדי ליצור ממשק עם הנגיף, והניחו את המחט על הבוכנה תוך וידוי שאין בועות אוויר בתוך המחט.קררו את הווירוס והניחו אותו על קרח. הגדירו את המיקרו-מזרק (micro injector) לשאיבה והעבירו את מבחורת הווירוס אל מתחת לנימי המיקרו-מזרק. הנמיכו את קצה הנימה לתוך הווירוס שאבו את כמות הווירוס הדרושה לניסוי.לאחר מתן מנת buprenorphine טרום-ניתוחית, מורדמת בעל החיים כראוי בהתאם להנחיות המוסדיות. בצעו צביטה של בהוֹן וודאו כי תגובת הרפלקס אינה קיימת, לפני תחילת הפרוצדורה.הניחו את העכבר המורדם על פד חימום המונח על מעמד נייד למיקום העכבר. מרחו משחה לעיניים כדי למנוע התייבשות של קרנית העין בזמן שהחיה מורדמת. כעת, מקמו את העכבר במכשיר הסטראטוקסי (stereotaxic apparatus) על ידי הכנסה עדינה של מוטות האוזניים לתעלת השמע.וודאו שהראש מקביל לבסיס של הסטריאוטקסיס ואינו זז הצידה. לאחר מכן, כוונו את מוט הנשיכה כדי לסייע בייצוב הראש. הסירו את הפרווה באזור החתך.לאחר מכן, שטפו אזור זה שלוש פעמים באתנול, ולאחר מכן שלוש פעמים ביוד. לאחר ביצוע חתך סגיטלי בעור באמצעות מספריים כדי לחשוף את הגולגולת, דחפו את העור לאחור בעזרת ווים כירורגיים ביתיים. לאחר מכן, הגביהו את המיקרו-קפילרית באמצעות bgma והשתמשו במחווגים כדי להזיז את המיקרו-אינז'קטור לקואורדינטות של הגרעין הגנתי הלטרלי (lateral gent nucleus).לאחר איתור ה-LGN, קדחו חור קטן בגולגולת מעל נקודת ההזרקה. מקמו את הקפילרה מעל החור והורידו אותה לאט עד למיקום שנמצא ממש דורסלית לפני השטח של המוח. זהו מיקום האפס של קואורדינטת ה-dorsal ventral.הנימיקרו-קפילרית צריכה להיות חדה מספיק כדי לנקב את הקשיה (dura) של העכבר. לכן, הורד אותה באיטיות לעומק של 2.75 millimeters והזרק את כמות הווירוס הנדרשת במהירות של כ-100 liters per minute. השאר את המחט במוח למשך כשבע דקות כדי לאפשר דיפוזיה של הווירוס מאתר ההזרקה ולמנוע מהווירוס לנוע למעלה לאורך המחט.לאחר מכן, במהלך של שתי דקות, הרם את המחט באיטיות רבה מאתר ההזרקה ומחוץ למוח. לבסוף, תפר את אתר הניתוח ועקב אחר בעלי החיים עד להתאוששותם מההרדמה. ניתן buprenorphine בכל 12 שעות למשך יומיים.באופן כללי, ניתן להבחין בהפצה טרנס-סינפטית של VSV כ-24 שעות לאחר ההזרקה. עם זאת, זמני המתנה ארוכים יותר יובילו להפצה רבה יותר. לאחר קטילת העכבר באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני, הוצא את העין לתוך 4%formaldehyde והדגרה במשך שעה אחת, תוך וידוא שהעין נותרת טבולה.לאחר מכן, העבירו את העין לצלוחית פטרי המכילה PBS. השתמשו בפינצטה מספר 55 כדי להסיר במהירות את הקרנית ולשחרר ולהפריד את הרשתית מרקמות אחרות. ניתוח של דגימה שלמה (whole mount).חתכו את הרשתית על גבי שלייד זכוכית כך שתשכב שטוחה. הניחו ספייסרים של סיליקון סביב קצוות כיסוי שלייד הזכוכית בעזרת מדיום קיבוע זהב ממושך, ולאחר מכן כסו בעזרת כיסוי זכוכית בעובי אפס לצורך ניתוח של חתכי רשתית. הניחו את הרשתית ב-30% sucrose ב-PBS עד שהרשתית תשקע.לאחר מכן, מקבילים את הרשתית בתערובת המורכבת מיחס של אחד-לאחד של OCT לתמיסת סוכרוז 30% למשך שלוש שעות. לבסוף, מקפיאים את הרשתית בהקפאה מהירה (flash freeze) ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד למועד החיתוך. תמונה זו מראה ניסוי של מהלך זמן המדגים זיהום של תאי TVA 800 ותאי 2 9 3 T על ידי vsv A/rg.הפאנלים העליונים מראים תאי TVA 800 שש שעות, יום אחד ויומיים לאחר ההדבקה. הפאנלים התחתונים מראים תאי 2 9 3 T באותן נקודות זמן. הנגיף מתפשט בין תאים המבטאים את TVA בתוך מספר שעות, בעוד שההפצה בתאי 2 9 3 T, שאינם מבטאים את רצפטור ה-TVA, אמנם מתרחשת, אך היא איטית בהרבה.סרגל המقياس מייצג 100 microns. תמונה זו מראה זיהום מייצג של תאי גנגליון ברשתית של עכברים שאינם מבטאים TVA. בעלי החיים הוזרקו ב-LGN עם נגיף vsv A/RG.בוצע פסיאודו-טיפוס (Pseudo typed) עם R-A-B-V-G ורקמה נגזרה יומיים לאחר ההזרקה. נראה כאן זיהום דליל, כאשר תאי הגנגליון ברשתית מסומנים בחץ צהוב. תמונה זו מראה זיהום צפוף יותר.ניתן להשיג זאת באמצעות TI גבוה יותר של הנגיף והזרקה באיכות טובה, כפי שניתן לראות כאן. ניתן לזהות סוגים שונים של תאי גנגליון ברשתית על בסיס מורפולוגיה, כולל תאי גנגליון בעלי ענפים קטנים (small arbor ganglion cells), תאי גנגליון מסוג melanopsin type one, תאי גנגליון רגישים לכיוון (direction selective ganglion cells או DS GCs) ו-on off DS GCs. כאן סרגל המقياس מייצג 50 microns, כפי שניתן לראות בתמונות הבאות מעכבר המבטא TVA.ההעברה של VSVA/RG מ-DS GCs מסוג on-off ל-Starburst omics עוקבת אחר התבנית הצפויה. ה-DS GCs מסוג on-off המסומנים בחץ לבן עם מילוי ירוק מעבירים את הווירוס למספר Starburst omics המסומנים בחץ צהוב. כפי שניתן לראות כאן, כל התאים הירוקים שאינם DS GCs מסומנים גם ב-Cree reporter, דבר המעיד על כך שהם Starburst omics המביעים TVA.תאי ה-DS GCs המסומנים בחצי חצים לבנים עם מילוי ירוק, ותאי ה-starburst omics המסומנים בחצי חצים צהובים, מחולקים לשכבות המתאימות של השכבה הפלקסיפורמית הפנימית של הרשתית (IPL); התאים שאליהם עובר הנגיף כוללים הן תאי on והן תאי off. Starburst omicron. המספרים באיור זה מציינים את השכבות של ה-IPL. לאחר השליטה בפעולה, ניתן לבצע את הניסוי כולו ביום אחד או יומיים, אם הוא מבוצע כראוי.המהירות של VSV היא אחד מיתרונותיו המרכזיים בעקבות פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיפוי מעגלים מבוסס opsin או channel red, על מנת לתקף את מעקב המעגלים הוויראליים ולנתח את תכונותיהם של קשרים סינפטיים אלה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין היטב את רוב השלבים השונים המעורבים במעקב אחר מעגלים ויראליים, החל מגידול הנגיף, דרך הזרקה in vivo, ועד לניתוח של נוירונים המסומנים פלואורסצנטית.

viral-tracing-of-genetically-defined-neural-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מספקים מדריך מעשי קליעים נותבים...

חשיפת טופוגרפיה מעגלים עצביים Multi-Color

מעקב טרנס-סינפטי הפך לכלי רב עוצמה לניתוח זרמים מרכזיים המווסתים מטרות היקפיות באמצעות מעגלים רב-סינפטיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול המנצל את נגיף הפסאודו-כלבת הטרנס-סינפטי כדי לזהות ולמקם מעגל מוחי פונקציונלי, ואחריו טכניקות מעקב דרכי קלאסיות כדי לאמת קשרים ספציפיים במעגל בין קבוצות מזוהות של נוירונים.

Transsynaptic איתור ממטרות היקפית עם וירוס Pseudorabies אחריו רעלן כולרה ותיוג Biotinylated Dextran אמינים זוגי

תוך ניצול אסטרטגיה גנטית בינארית אנו מספקים פרוטוקול מפורט למעקב אחר מעגלים עצביים בעכברים המבטאים עוקבים טרנס-סינפטיים משלימים לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. מכיוון שייצור עוקבים ספציפיים לתא מקודד גנטית, הגישה הניסיונית שלנו מתאימה לחקור את היווצרותם והתבגרותם של מעגלים עצביים במהלך התפתחות המוח העוברי של עכברים ברזולוציית תא בודד.

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

כאן אנו מתארים הליך המבוסס על שימוש בחלקיקים לנטי-ויראלים לשינוי גנטי ארוך טווח של תאי גזע עצביים ו/או תאי אפנדימליים סמוכים להם בנישה הנוירוגנית הגחנית-תת-חדרית הבוגרת המאפשרת ניתוח נפרד של השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים, תלויות נישה על תאי גזע עצביים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

אנו מתארים טכניקה לתייג נוירונים והתהליכים שלהם באמצעות זריקות אנטרוגרדית או נותב מדרדר לגרעיני מוח באמצעות הכנה במבחנה. אנחנו שונה בשיטה הקיימת שלי n המבחנה electroporation נותב על ידי ניצול של שכותרתו fluorescently מוטציות עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק תיוג.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

פרוטוקול זה מתאר שחזורים בקנה מידה גדולה של אוכלוסיות נוירונים סלקטיבית, שכותרתו בעקבות זיהום מדרדר עם וירוס כלבת מהונדס להביע סמני ניאון, ואשכול עצמאי, ללא דעות מוקדמות מנתח המאפשר אפיון מקיף של מדדים מורפולוגיים בין subclasses העצבית ברורה.

שחזור בקנה מידה גדול ועצמאי, Clustering משוחדת בהתבסס על מדדי מורפולוגי לסווג נוירונים באוכלוסיות סלקטיבי

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

פרוטוקול זה מתכוון לייצר האינטרנוירונים מתוכנת באופן ישיר ב-vivo, באמצעות מערכת ויראלי מבוססי AAV במוח וכתבת ה-GFP FLEX סינפסין, המאפשרת זיהוי תאים וניתוח נוסף בvivo.

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.

מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למד שיטה חדשה לאיתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי באמצעות קולטן TVA. טכניקה זו מאפשרת ניתוח בקצב גבוה של מעגלים עצביים במערכת העצבים המרכזית.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

גלה סרטונים נוספים