מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים
November 9th, 2012
אנו מציגים שיטה פשוטה לייצר מכשירים המסוגלים החלת תנאים דינמיים דומים לזנים שונים מרובים microfluidic, ללא צורך בחדר נקי או ליתוגרפיה הרכה.
המטרה הכוללת של השיטה הבאה היא לדמות את ההתנהגות של תאים בודדים מזנים שונים של שמרים באותם תנאים דינמיים. זה מושג על ידי ייצור מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתי, או שהשכבה התחתונה תכיל כל אחד מהזנים השונים בנפרד, והשכבה העליונה תספק את תנאי הזרימה הדינמיים כשלב שני. זני שמרים שונים מונחים בבארות והמכשיר נסגר, ויוצר תעלה אחת עם מספר זנים מופרדים.
לאחר מכן, אנו מדמים את תגובות התאים לשינויים במדיום דינמי על ידי שליטה בקצבי הזרימה בשתי הכניסות של ערוץ Y, התוצאות מראות זנים שונים הנתונים לאותם תנאים דינמיים וללא זיהום צולב בין בארות. למכשיר מיקרופלואידי זה מספר יתרונות מרכזיים על פני מערכות קיימות אחרות. זה מאפשר הדמיה של מספר זנים נפרדים באותם תנאים דינמיים.
כמו כן, חשוב מכך, ניתן לייצר אותו בקלות בכל מעבדה ללא צורך בציוד מיוחד. השיטה הזו הגיעה מדיון כיצד לעקוב אחר תגובותיהם של מבודדים שונים מהמזרח הפראי למעברי רעב. התחל, צייר או הדפס את פריסת המיקרו-ערוץ הרצויה לקנה מידה.
לאחר מכן, כסו שקופית זכוכית בשכבות סקוטש כדי להשיג את הגובה הרצוי של התעלה, הניחו את עיצוב הפריסה על משטח ישר ויישרו את המגלשה מעל תבנית העיצוב. כעת חותכים בזהירות את הקלטת על מגלשת הזכוכית בהתאם לפריסה. הסר את הסקוטש מכל אזורי מגלשת הזכוכית.
קבל את אלה בפריסה של ערוץ המיקרו. מכניסים את השקופית לתנור חימום של 65 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן נקו בעדינות עם אתנול.
מערבבים את רכיבי הבסיס והריפוי של PDMS לפי המלצת היצרן. שופכים כ -30 מיליליטר תערובת PDMS לצלחת פטרי לגובה של כ -0.5 סנטימטרים. הסר את ה-PDMS בוואקום במידת הצורך.
טבלו את מגלשת הזכוכית ב-PDMS כשהסקוטש המעוצב פונה כלפי מעלה. הצבת התבנית לאחר ה-PDMS מונעת היווצרות בועות אוויר בין המגלשה לצלחת ריפוי תחתון למשך 48 שעות ב-65 מעלות צלזיוס, וודא שהצלחת אופקית באמצעות מפלס בועות בצלחת פטרי חדשה של 90 מילימטר. יוצקים שלושה מיליליטר תערובת PDMS.
ניתן לבצע שלב זה על קודן ספין אם זמין. DGAs וריפוי כפי שהוצג קודם לכן. כעת גזרו בעדינות את שכבת הזרימה של המכשיר המיקרופלואידי לגודל הרצוי בעזרת מנקב ביופסיה.
צור חורים לכניסות והיציאות בשכבת הזרימה. חותכים גם שכבת בארות בגודל דומה מצלחת הפטרי השנייה ומניחים על עבה. החלק מעל פריסת העיצוב.
לאחר מכן נקב בארות בהתאם למיקרו-ערוצים בפריסה באמצעות אתנול, נקה את שתי שכבות ה-PDMS ואת החלקת כיסוי הזכוכית וייבש באוויר. לאחר מכן, טפל בהחלקת כיסוי הזכוכית ובשכבת הבארות PDMS עם תחריט פלזמה סטנדרטי להדבקה בלתי הפיכה או מטפל קורונה כף יד להדבקה הפיכה. הנח בזהירות את שכבת הבארות על גבי החלקת הכיסוי כדי לגרום להידבקות.
משפשפים בעדינות את בועות האוויר. הכן את המדיה הרצויה במזרקים מתאימים וחבר לצינורות טיגון המושחלים דרך משאבת מזרק. להדמיית תאים.
השתמש בחוזקות. עבור לשלב הרצוי, מערבל את התרבית ביסודיות והעביר 300 מיקרוליטר לצינורות מיקרו צנטריפוגה. הנח בעדינות מיקרוליטר אחד של קון קנה A לכל באר של שכבת בארות ה-PDMS.
שטפו עודפי קונה A מכל באר פעמיים על ידי פיפטינג עדין של מים בזמן שהקון ב-A מתייבש. שטפו את הזנים פעמיים עם 300 מיקרוליטר של מדיום SC חסר גלוקוז. שטיפת שאריות גלוקוז מדפנות התא מסייעת להיצמדות נכונה להחלמה.
לאחר מערבולת, התאים מזרימים ביסודיות כ-0.5 מיקרוליטר מתרחיף התאים לבארות בודדות. שוטפים בעדינות תאים שנותרו עם מדיום עשיר. יש לבצע את שני השלבים הבאים במהירות על מנת למנוע התייבשות של תאים.
כפלסמת צעד אופציונלית, התייחס לשבב ולבארות תוך היזהרות לא לפגוע ישירות בבארות. ואז תחת סטריאוסקופ, הניחו בזהירות את השבב על הבארות תוך שימת לב רבה ליישור בין השניים. לחץ בעדינות כדי להדביק את שתי השכבות של PDMS.
מלאו לאט את המכשיר לחלוטין בכ-50 מיקרוליטר של מדיום עשיר, וודאו שלא נותרו בועות אוויר בתוך התעלה. כעת חבר את המכשיר, הכנס את הצינורות לכניסות המתאימות והתחל את זרימת המדיה. הקפד שלא ייווצרו בועות אוויר בצינור מכיוון שאלו עלולות להיתקע במכשיר ולהרוס את הזרימה.
המשך למקם את המכשיר מתחת למיקרוסקופ ומצא נקודות הדמיה מתאימות בכל אחד מהם. ובכן שמור על התאים בזרימה עשירה ובינונית למשך שעה או יותר במידת הצורך. כדי לאפשר התאוששות.
התחל את הניסוי עם הגדרת זרימה קבועה. שאבו A עד 0.8 מיליליטר לשעה ושאבו B ל-0.2 מיליליטר לשעה. לבינוני זורם מעל 80% מרוחב התעלה.
אנו יכולים לשנות באופן דינמי את התנאים במכשיר על ידי שינוי קצבי הזרימה היחסיים. התנאים החדשים מתייצבים תוך שניות לאורך כל הערוץ כדי להדגים את ההפרדה בין זנים שונים. שני זני שמרים מובחנים מצולמים בבארות חלופיות.
שימו לב שאין דליפת תאים בין בארות בניסוי זה. לשני הזנים יש את גורם השעתוק MSN 2 המתויג עם YFP כדי לבדוק את ההשפעה בו-זמנית של תנאים משתנים דינמית. קצבי הזרימה בשני ערוצי הקלט שונו כדי ליצור שלב ללא מדיום גלוקוז.
זה הביא ללוקליזציה של MSN 2 לגרעין. חשוב לציין, ניתן לנתח את מסלול הזמן של MSN גרעיני שתי רמות YFP בתאים בודדים. כך שניתן להשתמש במכשיר המיקרופלואידיקה PDMS ליישום תנאים דינמיים בו-זמניים על בארות מרובות.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לתת לתאים להתייבש במהלך הרכבת המכשיר. לאחר המאסטר, ניתן לבצע טכניקה זו בקלות ללא צורך בליתוגרפיה רכה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לצילום התנהגות תאים של שמרים בודדים מזנים שונים בתנאים דינמיים זהים באמצעות מכשיר מיקרו-נוזלי. המכשיר נועד למנוע זיהום צולב תוך אפשרות לצפייה במספר זנים בו זמנית.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרו-נוזלים
- צילום תאים
- ביולוגיה של שמרים
רקע
- הבנת התנהגות התאים בתנאים דינמיים חיונית למחקרים ביולוגיים שונים.
- שיטות מסורתיות לעיתים קרובות דורשות סביבות של חדר נקי וטכניקות ייצור מורכבות.
- מחקר זה נועד לפשט את התהליך תוך שמירה על שלמות הניסוי.
- מכשירים מיקרו-נוזליים מציעים שליטה מדויקת על תנאי הסביבה למחקרי תאים.
מטרת המחקר
- לפתח מכשיר מיקרו-נוזלי שיאפשר צילום של מספר זני שמרים בו זמנית.
- ליישם תנאי זרימה דינמיים על זנים שונים ללא זיהום צולב.
- לשפר את ההבנה של תגובות תאי השמרים לשינויים סביבתיים.
שיטות ששימשו
- ייצור מכשיר מיקרו-נוזלי בעל שתי שכבות.
- הצבת זני שמרים שונים בבארות נפרדות של המכשיר.
- יישום תנאי זרימה דינמיים באמצעות שיעורי זרימה מבוקרים.
- צילום תגובות התאים לשינויים במדיום.
תוצאות עיקריות
- המכשיר שמר בהצלחה על הפרדה בין זני השמרים השונים.
- הצילומים חשפו תגובות שונות של זני השמרים לאותם תנאים דינמיים.
- השיטה הדגימה יתרונות על פני מערכות קיימות מבחינת פשטות ויעילות.
- לא נצפתה זיהום צולב בין הבארות במהלך הניסויים.
מסקנות
- מכשיר מיקרו-נוזלי זה מספק גישה חדשנית לחקר מספר זני שמרים.
- השיטה מאפשרת ניסויים מבוקרים ללא צורך במתקנים מורכבים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לסוגי תאים אחרים ותנאי ניסוי שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Comparative analysis of multiple cell strains under identical dynamic conditions is critical for early discovery and target validation in biopharma R&D. This microfluidic device enables simultaneous, contamination-free imaging of distinct yeast strains, supporting robust hypothesis testing and mechanistic de-risking. Its accessible fabrication and dynamic control streamline workflows at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of cellular responses across multiple strains under controlled environmental shifts.
- Supports functional target validation by isolating strain-specific phenotypes in a shared dynamic context.
- Facilitates mechanistic de-risking by eliminating environmental variability as a confounder.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, contamination-free biological systems for downstream quantitative assays.
- Standardizes environmental exposure, enhancing reproducibility and assay reliability.
- Enables high-content imaging and multiplexed readouts for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns experimental conditions for translational biomarker discovery when using disease-relevant yeast models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent dynamic perturbations.
- Reduces risk of false positives by ensuring environmental uniformity across strains.
Pipeline & Workflow Integration
This device integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling parallel, quantitative analysis of multiple strains under synchronized dynamic conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by controlling environmental variables across strains.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic continuity when relevant to yeast-based disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, easily manufactured platform adaptable to diverse strain panels and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in comparative studies.
- Operational Value: Simplifies device fabrication and standardizes experimental setup across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling direct, quantitative strain comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying strain-specific responses under uniform conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic assembly and quantitative cell imaging.
- Needs access to basic PDMS fabrication tools and standard microscopy infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of environmental flow parameters.
- Adaptable to other model systems with similar size and adherence properties.
- Practical limitations include throughput constraints and manual alignment steps.
