Name: מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: חקור התנהגות תאי שמרים מזנים שונים באמצעות מכשיר מיקרו-זורם דו-שכבתי. השיטה מאפשרת הדמיה בו-זמנית ללא זיהום צולב ומספקת שליטה מדויקת בתנאים דינמיים לחקר תגובות תאיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

י.ג. נתמך על ידי מלגה מאי.די. בי. לפי הוא בחור אלון ועמית סגל של אדמונד י ‭. ‬ ספרא לביואינפורמטיקה באוניברסיטת תל אביב ‭. ‬ מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומי למדע המענק 1499/10.

1. יצירת מאסטר ויסקי קלטת 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר או להדפיס את הפריסה רצויה microchannel, להתרחב, על נייר. במקרה שלנו העיצוב מורכב משני ערוצים בצורת אות V, כל 3 מ&quot;מ רחב (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי זכוכית שקופית עם שכבות של נייר דבק. מספר השכבות יקבע את הגובה של הערוץ (כ 60 מיקרומטר לשכבה). אנחנו השתמשנו 3 שכבות נייר דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את עיצוב הפריסה על משטח שטוח. יישר את השקופית על תבנית העיצוב. בזהירות לחתוך את הסרט בשקופית הזכוכית עם אזמל על פי הפריסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנייר הדבק מכל האזורים של שקופית הזכוכית, למעט אלו בפריסה של microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השקופית בתנור חימום על 65 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות. לנקות בעדינות עם אתנול. </li></ol> 2. בודת מכשיר microfluidic PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את מרכיבי הבסיס וריפוי של PDMS כפי שהומלץ על ידי היצרן. אנו משתמשים 10:01יחס בין הבסיס לסוכן ריפוי. יוצק על 30 מ&quot;ל של תערובת PDMS לתוך צלחת פטרי לגובה של ~ 0.5 סנטימטר. הדגה PDMS בואקום במידת צורך. להטביע את שקופיות הזכוכית בPDMS עם נייר הדבק בדוגמת פונה כלפי מעלה. הצבת התבנית לאחר PDMS מונעת היווצרות בועות אוויר בין השקופיות ובתחתית צלחת. תרופה ל48 שעות על 65 מעלות צלזיוס, ולוודא את הצלחת היא אופקית באמצעות רמת בועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת פטרי חדשה 90 מ&quot;מ לשפוך 3 מ&quot;ל של PDMS תערובת, וכתוצאה מכך שכבה על 0.5 מ&quot;מ עמוק. (אם coater ספין זמין, ניתן להשתמש בו בשלב זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה ולרפא כמו ב2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לחתוך את מכשיר microfluidic לגודל רצוי עם אזמל. שכבה זו ניתן לכנות &quot;שכבת הזרימה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור חתיכה בגודל דומה של השכבה הדקה PDMS מהמנה השנייה פטרי. זו ניתן לכנות &quot;שכבת הבארות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אגרופן ביופסיה בגודל המתאים (אנו משתמשים מזהים מ&quot;מ 1.2) כדי לנקב חורים לפתחי הכניסה והשקעים בשכבת הזרימה. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שכבת הבארות בשקופית זכוכית עבה על פריסת העיצוב ואגרוף את הבארות, באמצעות 2 מ&quot;מ אגרופן ביופסית זהות, בתיאום עם את microchannels על הפריסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה שתי שכבות PDMS כמו גם 24 מ&quot;מ coverslip זכוכית x 60 מ&quot;מ עם אתנול. להתייבש באוויר ולשמור על ניקיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלזמה לטפל גם coverslip הזכוכית ובארות השכבה PDMS או באמצעות חרט סטנדרטי הפלזמה (עבור מליטה שאינה הפיכה) או מוחזק ביד 6 treater עטרה למליטה הפיכה. זהירות למקם את שכבת הבארות על גבי coverslip לגרום להידבקות (איור 3). לשפשף בעדינות את כל בועות אוויר (במידת צורך). </li></ol> 3. ניסוי הדמיה ניידת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש לך את המדיה הרצויה מוכן במזרקים המתאימים מחוברים לצינורות פלסטיק גמישים בקוטר הפנימי של 0.02 &quot;(Tygon) במשאבת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ס זני cerevisiae לשלב הרצוי בYPD הנוזלי. מערבולת ביסודיות והמקום 300 μl של כל זן לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות μl 1 מתוך Concanavalin (סיגמא) 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לכל באר. לשטוף את Concanavalin עודף מכל באר מים פעמים על ידי pipetting בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד Concanavalin מתייבש, לשטוף פעמים עם 300 זנים של μl בינוני SC חסר גלוקוז. כביסת גלוקוז השיורי מקירות התא מסייעת דבקות ראויה לConcanavalin א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ורטקס ביסודיות. פיפטה μl 0.75 או פחות מכל השעית תא לתוך היטב משלו (איור 3). לשטוף בעדינות את תאי שייר עם מדיום עשיר. את שני השלבים הבאים צריכים להתבצע במהירות כדי למנוע מתאים מתייבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלזמה לטפל בשבב ואת הבארות באופן יסודי באמצעות treater עטרת כף יד, נזהר שלא לפגוע בבארות באופן ישיר. זהירות למקם את השבב על הבארות, הקדשת תשומת לב לתיאום בין השניים (צעד זה יכול להיעשות תחת סטריאוסקופ). לחץ בעדינות על לדבוק בשתי השכבות של פ&quot;דטרשת נפוצה. לאט לאט למלא את המכשיר לחלוטין עם כ 50 מדיום עשיר μl, ולוודא אין בועות אוויר השאיר בתוך הערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבור את המכשיר, החדרת הצינורות אל פתחי הכניסה המתאימים ולהתחיל זרימת מדיה. תדאג שלא בועות אוויר הוכנס למכשיר כמו אלה יכולים להיות מסובכים להסרה, וזאת ניתן להשיג על ידי ניתוק כניסה או יציאה ועדינות קשה על המכשיר שבו הבועות, נזהר שלא לשבור את coverslip הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תחת מיקרוסקופ ולמצוא נקודתי הדמיה מתאימות בכל אחד גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים תחת זרימה בינונית עשירה ל1 שעות או יותר כדי לאפשר התאוששות במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את הניסוי: אנו משתמשים זרימה מתמדת מכל אחת משתי משאבות המזרק כדי למנוע זרימה חוזרת של התקשורת, שינוי ספיקות יחסי כרצונך. הגדרת משאבת A ל 0.8 מ&quot;ל / שעה והמשאבה B ל -0.2 תוצאות מ&quot;ל / שעה במדיום זורם מעל 80% מרוחב התעלה (איור 4). זה יכול להיות דינאמי גנתלה על ידי שינוי שתי הספיקות. התנאים החדשים לייצב בתוך שניות לאורך כל אורכו של הערוץ 2. </li></ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה אנו מציגים שיטה פשוטה ליצירת benchtop מכשיר microfluidic המאפשר בו זמנית מספר זני שמרים הבאים בתנאים דינאמיים. לאחר מספר זנים בערוץ אחד מספק כלי אמין להשוואה בין דינמיקה של תגובות תא בודדות בזנים מרובים. אחד יתרונות של הגישה שלנו הוא היכולת להמציא את המכשיר בטכניקות פשוטות ללא צורך בחדר נקי. למעשה, יש לנו גם בצע את פרוטוקול דילוג על פעולות טיפול בפלזמה (בצעדים 2.9 ו -3.6) וקבל תוצאות טובות, ולכן ללא כל ציוד מעבדות פלזמה עדיין יכולות לבצע את הפרוטוקול. <p class="jove_c...

תאים כל זמן מגיבים לסביבה דינמית, על ידי שינוי חילוף החומרים שלהם, פרופיל שעתוק והפונקציות סלולריות. כדי ללמוד על תופעות אלו, שיטות שניתן לכמת שינויים נדרשות. סוג אחד של readout לתגובות כאלה הוא השינוי בלוקליזציה של גורמי שעתוק קשורים לחץ בתגובה ללחץ תזונתי. מכשירי microfluidic 1 היו בשימוש באופן דינמי לתפעל תנאים סביבתיים לתאי 2-4. הם מציגים מספר יתרונות להדמית תא חייה: הסביבה של התאים ניתן לשלוט במדויק ובאופן דינמי השתנתה; תאים יכולים להיות חי בהדמיית בכל העת, לרבות במניפולציה של תנאים חיצוניים, וכרכים מגיבים מינימאליים נדרשים. עיצוב פשוט מאוד למכשיר microfluidic, המאפשר להתחלפות בין שני תנאים, הוא מכשיר בצורת אות V 2. אנו משתמשים באופן שגרתי מכשירי Y בצורה המאפשרים microfluidicיישום של שינויים דינמיים בתאים בערוץ. אנו משתמשים במכשיר זה כדי לעקוב אחר שינויי לוקליזציה של גורמים מתויגים fluorescently לחץ הקשורים שעתוק בתאי שמרים. אנו עוקבים אחר שינויים אלה תחת תנאים משתנים תזונתיים. לדוגמה, אנו יכולים לספק לדופק (או סדרה של פולסים) של גלוקוז המכיל בינוני תוך תקופה של אי גלוקוז בינוני, ברזולוציה של זמן עדינה מאוד. לעתים קרובות בניסויים כאלה, אחד הוא מעוניין בהשוואת התשובות של זני תאים שונים (לדוגמה, מוטציות שונות, או מבודד בר שונה). ערוץ Y בצורה מוגבלת לזן אחד בכל ערוץ - אם זן אחד או יותר משמש, אין דרך פשוטה להבדיל בין הזנים. כדי להתגבר על זה, ערוצים שונים ניתן להשתמש. אם אנחנו רוצים להחיל את תנאי הדינמיקה זהות לזנים רבים, ברצוננו לשלב את מושג ה-Y ערוץ עם מספר רבים של ערוצים. ישנם שני אתגרים ביישום פתרון זה: זה יכול להיות קשה ליישם tהוא אותם תנאים באותו זמן לכל הערוצים, וקיים מגבלה גיאומטרית למספר ערוצי Y שיכול להיות מצויד במכשיר אחד. לפיכך, אנו מחפשים את הדרך לצפייה במספר זנים בערוץ אחד בתנאים דינאמיים. כאן אנו מתארים מכשיר microfluidic 2 שכבתי המיועד לזנים מרובים הדמיה בערוץ 1 באותם תנאים דינמיים. השכבה התחתונה מורכבת הדק PDMS עם שורה של חורים. שכבה זו מחוברת לcoverslip זכוכית יצירת בארות שלתוכו אנו מניחים את הזנים השונים, דבקותם בConcanavalin לזכוכית. השכבה השנייה היא מכשיר microfluidic בצורת אות V שנוצר באמצעות שיטת נייר הדבק 5. לאחר שהניח את הזנים בבארות השכבה השנייה מיושרת במהירות ובמצורפת לראשון, יצירת ערוץ אחד עם כמה בארות המכילות את הזנים השונים. מכשיר זה מאפשר סופי לאחר מספר זנים בערוץ אחד, שבו כלזנים כפופים לאותם תנאים באותו הזמן בדיוק. כל תהליך התכנון וייצור יכולים להיעשות על benchtop, תוך שימוש באמצעים פשוטים, ללא יתוגרפיה הרכה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> PDMS-SYLGARD 184 </td><td> Dow Corning ארה&quot;ב </td><td></td></tr><tr><td> ייבוש אבק </td><td> Nalgene </td><td> 5310-0250 </td></tr><tr><td> ביופסית בוקרים </td><td> טד פלה בע&quot;מ </td><td> אריס Uni-Core 15076 (2 מ&quot;מ), 15074 (1.2 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> משאבות מזרק </td><td> Chemyx </td><td> היתוך 200 </td></tr><tr><td> קורונה treater </td><td> מוצרי אלקטרו technic </td><td> BD-20 </td></tr><tr><td> צינורות Tygon </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Concanavalin- </td><td> סיגמא </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> נייר דבק </td><td> 3M ויסקי </td><td> קלטת שקופה 1/2 &quot; </td></tr></tbody></table>

מכשיר microfluidic ללימוד זני distinct מרובים

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

המחקר של תגובות תא לשינויים סביבתיים מציב אתגרים ניסיוניים רבים: תאים צריכים להיות צלמו בתנאים משתנים, לעתים קרובות באופן השוואתי. צלחות Multiwell משמשות באופן שגרתי להשוואת זנים רבים ושונים או קווים סלולריים, אבל תאפשרנה שליטה מוגבלת על דינמיקת הסביבה. התקני microfluidic, לעומת זאת, מאפשרים שליטה דינמית מעולה על התנאים סביבו, אבל זה מאתגר לתמונה ולהבחין יותר מכמה זנים בם. כאן אנו מתארים שיטת קלות ובמהירות לייצור מכשיר מסוגל ליישם תנאים משתנים באופן דינאמי לזני שמרים שונים מרובים בערוץ 1 microfluidic. המכשיר תוכנן ויוצר באמצעים פשוטים, ללא צורך ביתוגרפיה הרכה. הוא מורכב מערוץ זרימה בצורת אות V מצורף לשכבה שנייה מחסה microwells. הזנים ממוקמים בmicrowells הנפרד, וצלמו תחת בדיוק מאותם תנאים דינאמיים. אנו הדגמהnstrate השימוש במכשיר למדידת תגובות לוקליזציה חלבון לפולסים של שינויים תזונתיים בזני שמרים שונים.

כדי להדגים את ההפרדה בין זנים שונים שצלמנו שני זני שמרים הנבדלים בבארות חלופיות. הדמית בארות מלאות לא מראות זליגת תא בין הבארות (איור 5 א, ב). שני הזנים יש MSN2 גורם השעתוק תויג YFP. כדי לבחון את ההשפעה של שינויים בתנאי סימולטני באופן דינמי, שהחלפנו את הספיקות בשני הערוצים, יצירת צעד של מדיום לא גלוקוז, אשר הביא בלוקליזציה של Msn2-YFP לגרעין (האיור 5c, ד). התגובה נמדדה בכל הבארות התרחשה באותו הזמן, מראה את המכשיר יכול לשמש ליישום של תנאים דינמיים ...

אנו מציגים שיטה פשוטה לייצר מכשירים המסוגלים החלת תנאים דינמיים דומים לזנים שונים מרובים microfluidic, ללא צורך בחדר נקי או ליתוגרפיה הרכה.

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

מחקר של תגובות תאים לשינויים סביבתיים מציב אתגרים ניסיוניים רבים: יש צורך לצלם תאים תחת תנאים משתנים, לעיתים קרובות ב...

המטרה הכוללת של השיטה הבאה היא לדמות את התנהגותם של תאים בודדים מזנים שונים של שמרים תחת אותם תנאים דינמיים. דבר זה מושג על ידי ייצור של התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי, כאשר השכבה התחתונה תכיל כל אחד מהזנים השונים בנפרד, והשכבה העליונה תספק את תנאי הזרימה הדינמיים כשלב שני. זני שמרים שונים מונחים בבארות וההתקן נסגר, מה שיוצר תעלה אחת עם מספר זנים מופרדים.בשלב הבא, נדמיין את תגובות התאים לשינויים דינמיים במצע. באמצעות בקרת קצבי הזרימה בשתי הכניסות של תעל T, התוצאות מראות זנים שונים החשופים לאותם תנאים דינמיים, ללא זיהום צולב בין הבארות. למכשיר מיקרופלואידי זה מספר יתרונות מרכזיים על פני מערכות קיימות אחרות. הוא מאפשר דימוי של מספר זנים נבדלים תחת אותם תנאים דינמיים.בנוסף, באופן חשוב, ניתן לייצר אותו בקלות בכל מעבדה ללא צורך בציוד מיוחד. שיטה זו נוצרה מתוך דיון על אופן מעקב אחר תגובותיהם של בידודים שונים של שמרים פראיים מהמזרח למעברי הרעבה. ראשית, שרטטו או הדפיסו במقياس המתאים את פריסת המיקרו-ערוצים הרצויה.בשלב הבא, כסו תבנית זכוכית בשכבות של סרט הדבקה (scotch tape). כדי להשיג את הגובה הרצוי של התעלה, הניחו את תכנון הפריסה על משטח שטוח ויישרו את התבנית מעל דגם הפריסה. כעת, חתכו בזהירות את הסרט על תבנית הזכוכית בהתאם לפריסה. הסירו את סרט ההדבקה מכל אזורי תבנית הזכוכית.קבלו אותם בפריסה של המיקרו-ערוץ. הניחו את הזרימה בתנור חימום בטמפרטורה של 65 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, נקו בעדינות באמצעות אתנול.ערבבו את רכיבי הבסיס והמעבדה (curing components) של ה-PDMS לפי המלצות היצרן. שפכו כ-30 milliliters של תערובת ה-PDMS לתוך צלחת פטרי לגובה של כ-0.5 centimeters. במידת הצורך, בצעו ניקוי גזים (degassing) של ה-PDMS בוואקום.טבלו את פלטת הזכוכית בתוך ה-PDMS כאשר סרט ההדבקה המדוגם פונה כלפי מעלה. הנחת הדגם לאחר ה-PDMS מונעת היווצרות בועות אוויר בין הפלטה לתחתית הכלי. השקיעו שלוש מיליליטר של תערובת PDMS בתוך צלחת פטרי חדשה בקוטר 90 מילימטר. השאירו להקשיה למשך 48 שעות בטמפרטורה של 65 °C, תוך וידוא שהצלחת מונחת בצורה אופקית באמצעות פלס בועות.ניתן לבצע שלב זה באמצעות מכשיר spin coder אם הוא זמין. בצעו DGAs והקשיה כפי שהודגם קודם לכן. כעת, גזרו בעדינות את שכבת הזרימה של המכשיר המיקרופלואידי לגודל הרצוי באמצעות מחורר ביופסיה (biopsy puncher).צרו חורים עבור הכניסות והיציאות בשכבת הזרימה. כמו כן, גזרו שכבת בארות בגודל דומה מהצלחת פטרי השנייה והניחו אותה על זכוכית עבה. החליקו מעל פריסת התכנון.לאחר מכן, פנצו בארים בהתאמה למיקרוchannels במערך באמצעות אתנול, נקו את שתי שכבות ה-PDMS ואת כיסוי הזכוכית והניחו אותם להתייבש באוויר. בשלב הבא, טפלו בכיסוי הזכוכית ובשכבת ה-PDMS של הבארים באמצעות מכשיר plasma etcher סטנדרטי להדבקה בלתי הפיכה, או corona treater ידני להדבקה הפיכה. הניחו בזהירות את שכבת הבארים מעל כיסוי הזכוכית כדי ליצור הידבקות.יש לשפשף בעדינות כדי להוציא בועות אוויר. הכינו את המדיום הרצוי במזרקים מתאימים וחברו אותם לצינור tigon המועבר דרך משאבת מזרקים. לצילום תאים.השתמשו בחוזקים. עברו לשלב הרצוי, ערבבו את התרבית היטב באמצעות Vortex, והעבירו 300 µL למבחנות מיקרו-צנטריפוגה. הניחו בעדינות 1 µL של con canna A לכל באער בשכבת באערי ה-PDMS.שטפו עודפי concanavalin A מכל באר פעמיים על ידי פיפטינג עדין של מים בזמן שה-concanavalin A מתייבש. שטפו את הזנים פעמיים עם 300 µL של מצע SC ללא גלוקוז. שטיפת שאריות גלוקוז מדפנות התאים מסייעת להיצמדות תקינה ל-conval.לאחר ערבול (vortexing), העבירו באמצעות פיפט כ-0.5 µL מתחילת תרחיף התאים לתוך בארות בודדות. שטפו בעדינות תאי שאריות באמצעות מצע עשיר. את שני השלבים הבאים יש לבצע במהירות כדי למנוע מהתאים להתייבש.כשלב אופציונלי, בצעו טיפול בפלזמה לשבב ולבארות, תוך הקפדה לא לפגוע בבארות באופן ישיר. לאחר מכן, תחת סטריאוסקופ, מקמו בזהירות את השבב על הבארות תוך תשומת לב רבה ליישור ביניהן. לחצו בעדינות כדי להדביק את שתי שכבות ה-PDMS.מלאו באיטיות את המכשיר באופן מלא עם כ-50 µL של מצע עשיר, תוך וידוא שלא נותרו בועות אוויר בתוך התעלה. כעת חברו את המכשיר על ידי הכנסת הצינורות לכניסות המתאימות והתחילו את זרימת המצע. הקפידו שלא ייווצרו בועות אוויר בצינורות, שכן אלו עלולות להיתקע במכשיר ולפגוע בזרימה.המשיכו להנחת המכשיר תחת מיקרוסקופ ואתרו נקודות דימוי מתאימות בכל באר. השאירו את התאים תחת זרימה של מצע עשיר למשך שעה אחת או יותר במידת הצורך, כדי לאפשר התאוששות.התחילו את הניסוי עם הגדרת זרימה קבועה. הגדירו את משאבה A ל-0.8 milliliters per hour ואת משאבה B ל-0.2 milliliters per hour. עבור המדיום, הגדירו זרימה המכסה מעל 80% מרוחב התעלה.ניתן לשנות באופן דינמי את התנאים במכשיר על ידי שינוי קצבי הזרימה היחסיים. התנאים החדשים מתייצבים בתוך שניות לאורך כל התעלה. כדי להדגים את ההפרדה בין זנים שונים, צולמו שני זני שמרים שניתן להבחין ביניהם בבארות לסירוגין.שימו לב כי בניסוי זה אין דליפה של תאים בין הבארות. לשני הזנים יש את גורם השעתוק MSN2 המסומן ב-YFP, כדי לבחון את ההשפעה הסימולטנית של תנאים המשתנים באופן דינמי. קצבי הזרימה בשני ערוצי הכניסה שונו כדי ליצור שלב של מצע ללא גלוקוז.דבר זה הוביל למיקום של MSN two בגרעין. חשוב לציין כי ניתן לנתח את מסלול הזמן של רמות MSN two YFP בגרעין בתאים בודדים. לפיכך, ניתן להשתמש במכשיר המיקרופלואידי מ-PDMS להחלת תנאים דינמיים בו-זמנית למספר בארות.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למנוע את התייבשות התאים במהלך הרכבת המכשיר. לאחר רכישת מיומנות בטכניקה זו, ניתן לבצעה בקלות ללא צורך בליתוגרפיה רכה.

a-microfluidic-device-for-studying-multiple-distinct-strains

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פרוטוקול עבור ייצור של מכשירים microfluidic שיכולה לאפשר לכידת תא ותרבות. בגישה זו microstructures בדוגמת כגון חריצים בתוך ערוצי microfluidic המשמשים ליצירת מתח נמוך גזירה אזורים בתוך התא שבו ניתן לעגן.

מכשיר microfluidic עם דפוסי Groove לחקר התנהגות נייד

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

מקור: קאבין, מ. ט. ואחרים. ניתוח מיקרופלואידי חד-תאי של Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לצפייה בצמיחת חיידקים ברמת התא היחיד. הוא מראה כיצד תאי חיידקים לא ניידים, הכלואים בתעלות בקנה מידה מיקרו, מוזנים ומתוחזקים באופן רציף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההגדרה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של חלוקת תאים ומעקב אחר שושלת לאורך דורות שונים.

מעקב אחר צמיחת חיידקים ברזולוציית תא יחיד במערכת מיקרופלואידית

בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.

ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

דוח זה מתאר שיטה מבוססת שבב מיקרופלואידיג כדי להגדיר ניסוי של תרבות תא בודדת שבה ניתן להשיג שיוך ביעילות גבוהה וניתוח מיקרוסקופי של תאים בודדים מרובים.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

אנו מציגים מערכת מיקרופלואידית למחקרי תפוקה גבוהה על מכונות חיים מורכבות, המורכבת מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. השבב המיקרופלואידי מאפשר ניתוח של התנאים המיקרו-סביבתיים המורכבים והדינמיים ביותר ב-vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

אנו מציגים פרוטוקול למכשיר תרבית רציפה מיליפלואידי (MCCD), המאפשר גידול אוכלוסיות חיידקים בתנאים קבועים עם דלי חומרים מזינים (עד למאות ריכוזים ננומולריים) או בתנודות תזונה זמניות בקנה מידה זעיר.

מכשיר מיליליפלואידי מתרבות רציפה לחקר אשריכיה קולי בתנאים תזונתיים נמוכים ומשתנים

חקור התנהגות תאי שמרים מזנים שונים באמצעות מכשיר מיקרו-זורם דו-שכבתי. השיטה מאפשרת הדמיה בו-זמנית ללא זיהום צולב ומספקת שליטה מדויקת בתנאים דינמיים לחקר תגובות תאיות.

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

גלה סרטונים נוספים