היכרות עם פונקצית עורקי שריר חלק Kv7 אשלגן ערוץ באמצעות אלקטרופיזיולוגיה קלאמפ תיקון וMyography לחץ
14 בספטמבר 2012
מדידות של Kv7 פעילות ערוץ (KCNQ) אשלגן בmyocytes העורק המבודד (באמצעות תיקון לצבוט טכניקות אלקטרו) במקביל למדידות של תגובות הכווץ / מרחיב (באמצעות myography לחץ) יכולות לחשוף פרטים חשובים על התפקידים של Kv7 ערוצים בפיזיולוגיה של שריר חלק של כלי דם ו פרמקולוגיה.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את הפעילות של תעלות אשלגן KV seven בתאי שריר חלק שחולצו באופן טרי מעורקי העורק המזנטרי (mesenteric artery), ולקשר זאת למדידות של קוטר העורק שנרשמו בתנאים פיזיולוגיים. הדבר מתבצע תחילה על ידי הסרה כירורגית של קשת כלי הדם המזנטרית מחולדה. השלב השני הוא דיסקציה וניקוי של מקטעי העורקים המזנטריים.
בשלב הבא, נעשה שימוש בחלק מהקטעים כדי לבודד תאי שריר חלק בודדים לצורך מדידות אלקטרופיזיולוגיות בשיטת patch clamp של זרמי אשלגן KV7. השלב האחרון הוא קנולציה של קטעים עורקיים שלמים למדידות pressure myography של התכווצות או התרחבות עורקית בתגובה למודולטורים פרמקולוגיים של תעלות אשלגן KV7. בסופו של דבר, השילוב של אלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp ושל pressure myography משמש להדגמה כיצד עלייה או ירידה בפעילות של תעלות אשלגן KV7 משפיעה על התכווצות עורקים מזנטריים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בערוצים משובטים המבוטאים בתרבימי תאים, הוא שהזרמים נמדדים בתאים שאינם מתורגבים, המבטאים את הערוצים באופן טבעי, וניתן לבודד את זרמי ה-KV מסוגים אחרים של ערוצי פוטסיום שעשויים להיות פעילים באותם תאים. מיאוגרפיית לחץ מאפשרת להקליט תגובות תפקודיות מאותה רקמה ממנה הופקו התאים הבודדים, והשיטה רגישה יותר ופיזיולוגית יותר מהכנות אחרות, כגון טבעות עורקיות או רצועות עורקיות. ד"ר Bareth Mani, פוסט-דוקטורטורנט מהמעבדה שלי, ידגים את טכניקות הקניולציה העורקית ומיאוגרפיית הלחץ, וד"ר Luba Brueggeman, פרופסורית לסייעת מחקר במעבדתי, תדגים את נהלי בידוד התאים וה-patch clamp.
כדי להתחיל בהליך זה, השתמשו במספריים כירורגיים כדי לחתוך מקטע של 10 עד 12 סנטימטרים משני קצותיו של מעי דק של חולדה. לאחר מכן, בודדו את המעי יחד עם כלי הדם המחוברים אליו. לאחר מכן, קבעו את מקטע המעי הדק באמצעות סיכות.
פרס את המזנטריום (קרום המעי) על הצד הקרוב של התא כך שהענף הראשי של העורק המזנטרי העליון (superior mesenteric artery) יהיה במרכז, והענפים הבאים בסדר הענפיה יקרינו ממנו כלפי חוץ. לאחר מכן, מקם את הנעצים על מקטעי המעי בלבד, תוך צפייה דרך מיקרוסקופ דיסקציה מואר. הסר בזהירות את רקמת השומן ואת רקמת החיבור המקיפות את העורקים מסדר שני עד רביעי בקרבת המעיים, באמצעות פינצטה מיקרוסקופית ומספריים.
החזיקו את הוורידים הסמוכים כדי להקל על פינוי הרקמה השומנית ורקמת החיבור ולמנוע מתיחה מיותרת של העורקים. כעת העבירו שני עד שלושה מקטעים של העורק המזנטרי (mesenteric artery) לכלי תרבית רקמה בנפח 35 מילימטר המכיל שני מיליליטר של תמיסת בידוד קרה במיוחד. הניחו את הכלי על קרח לאחר מכן, וחלקו את מקטעי העורק המזנטרי לחתיכות באורך של שלושה עד ארבעה מילימטר באמצעות פיפטה מסוג PEs עם קצה שעבר ליטוש באש.
העבירו את מקטעי העורקים לבקית זכוכית המכילה 2 mL של תמיסת בידוד שחוממה מראש ל-37 °C. לאחר מכן, דגרו אותם למשך 30 דקות ב-37 °C. לאחר 30 דקות, שאבו בזהירות את תמיסת הבידוד ב-37 °C באמצעות פפית פסטור.
הוסיפו לכך שני מיליליטר של תמיסת אנזים חמה, ולאחר מכן דגרו למשך 35 דקות בטמפרטורה של 37 °C. מיד לאחר הדגירה למשך 35 דקות בתמיסת האנזים, הניחו את המבחנה על קרח, שאבו את תמיסת האנזים והוסיפו שני מיליליטר של תמיסת בידוד קרה מאוד. חזרו על הליך זה ארבע פעמים.
לאחר מכן, במיליליטר אחד של תמיסת בידוד קרה מאוד, טריט בעדינות את מקטעי העורק באמצעות פיפטה אחורית מלוטשת, 10 עד 20 פעמים, כדי לשחרר תאי שריר חלק בודדים מעורקי המזנטריום. ודא את מראה המיוציטים מדי פעם על ידי הנחת טיפה מתליהיית התאים על צלחת של 35 מילימטר ובחינתם תחת המיקרוסקופ.
לתאי שריר חלק מעורקים (MA SMCs) בריאים צריך להיות מראה חלק ומוארך. לאחר מכן, העבירו כ-100 עד 200 µL של תרחיף תאים לתא ההקלטה באמצעות פיפטת פסטור מלוטשת, והמתינו 15 דקות עד להיצמדות התאים. בשלב זה, מלאו את קצה פיפטת ה-patch בתוך תמיסה פנימית ללא amphotericin B, על ידי טבילת קצה הפיפטה בתוכה.
לאחר מכן, הפעילו יניקה מהקצה השני באמצעות מזרק של 10 מיליליטר המחובר באמצעות צינור, והוסיפו pipette solution מהחלק העליון. השתמשו בקצה של einor micro loader pipette עד שהפיפטה תהיה מלאה בערך עד מחציתה בתמיסה. הסירו בועות אוויר על ידי נקישה עדינה של הפיפטה.
לאחר מכן, הכניסו את הפיפטה למחזיק האלקטרודה. השתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להוריד את הפיפטה אל פניו של מיוציט מוארך. כאשר ההתנגדות של הפיפטה עולה ל-6 עד 10 mega ohms, הפעילו שאיבה כדי להשיג giga seal.
במקביל, הגדירו את מתח ההחזקה (holding voltage) לאפס מיליוולט בזמן ההמתנה לניקוב הממברנה. לאחר מכן, השריקו פולסי מתח של 100 מילי-שנייה ל-10+ מיליוולט ולאחר מכן ל-10- מיליוולט. השתמשו במגבר כדי לפצות על הטרנזיינט המהיר של קיבול הפפיטה (pipette capacitance) המתרחש בו-זמנית עם הופעת קיבול התא השלם.
זרמים חיוביים קטנים, מתמשכים וחולפים של 2 עד 10 pA, בטוהר ובאמפליטודה, מעידים על נוכחותם של תעלות KV7 תפקודיות. פרפורציה מוצלחת באמצעות amphotericin B תפחית את התנגדות הגישה ל-35 MΩ או פחות. כדי להקליט את קשר המתח-זרם של KV7, החילו מדרגות מתח למשך חמש שניות בטווח מתחים שבין 84- mV, שבהם ההסתברות לפתיחה של תעלות KV7 היא מינימלית, ל-16+ mV, שבהם ההסתברות לפתיחה של תעלות KV7 מגיעה למישור (plateau). לאחר חמש שניות בכל מתח בדיקה, חזרו למתח ההחזקה ב-4- mV למשך 10 שניות.
בנוהל זה, תלו באופן רפוי שתי תפרים דקים מניילון שהוכנו מראש בכל צד. בסמוך לקנולה מזכוכית, העבירו בזהירות את מקטע עורק המזנטרי המפוצל מתא ההפרדה לתא השתבת השריר בלחץ (pressure myo graft chamber), תוך החזקת קצה אחד של המקטע באמצעות פינצטה מיקרוסקופית. לאחר מכן, תחת תצפית במיקרוסקופ הפרדה מואר, החזיקו קצה אחד של מקטע העורק והחליקו אותו בעדינות על גבי הקנולה השמאלית מזכוכית.
אבטחו את הקצה באמצעות תפריה מניילון. לאחר מכן, שטפו בעדינות את הלומן על ידי הזרמת נוזל דרך כלי הדם המותקן כדי להסיר דם ושאריות. לאחר מכן, יש לסגור את השסתום למזרק השמאלי, כך שצד זה יציג עמוד נוזל סטטי שביחס לו מותאם הלחץ מהצד הימני. בעזרת המיקרו-מניפולטור, מקמו את הקנולה מזכוכית הימנית והניידת קרוב יותר למקטע העורק, ומשכו את הקצה הימני של המקטע מעליה.
לבסוף, קבע את מקטע העורק באמצעות תפרי ניילון וגזור את קצות החוטים העודפים. כעת, התקן את יחידת גרף הלחץ על הבמה מעל מיקרוסקופ המיקרוגרף של הלחץ. חבר את עמוד הלחץ לצדה הימני של תא הגרף ולאחר מכן הנח את המכסה מעל התא.
העלו בהדרגה את מזרק ה-10 milliliter לאורך 15 דקות ובדקו אם יש דליפות בכלי הדם עד שמתמר הלחץ P one קורא 80 millimeters mercury. התאימו את המרחק בין הקנולות במידת הצורך; יש להתאים את המרחק כך שמקטע העורק המועמד תחת לחץ יהיה כמעט ישר וייצור תבנית דמוית כתף בנקודות הקשירה. בדקו את חיוניותו של כלי הדם המותקן באמצעות סופרפוזיה זמנית של 60 millimolar potassium chloride למשך 30 שניות. כלי דם חיוני מתכווץ במהירות עם הוספת potassium chloride ומתרחב מיד לאחר שטיפתו.
לאחר מכן, הוסיפו את החומר הנבדק המרוכז לתמיסת האמבט; השתמשו בפיפט כדי לשאוב אותו הלוך ושוב בעדינות ליד קצה התא כדי לערבב את החומר הנבדק בתמיסת האמבט, ובכך להגיע לריכוז הסופי המתאים בתא בנפח 10 milliliter. ניתן לעקוב אחר שינויים בנפח קוטר הכלי לאחר הוספת החומר הנבדק בתמונת הווידאו בשידור חי, וכן לתעד אותם בחלון ניתוח התמונות תוך כדי מהלך הניסוי. איור זה מציג סדרה של עקומות זרם רצופות שהוקלטו בתגובה למדרגות מתח לפני הטיפול, כפי שמוצג בשחור, ולאחר הייצוב בנוכחות 100 nanomolar zinc perion במיאוציט בודד של עורק מזנטרי, כפי שמוצג באדום; אלו הם זרמים מייצגים עבור הביקורת ועבור 100 nanomolar zinc perion.
הפסים האפורים מציינים את מרווח הזמן שבו נמדדו אמפליטודות זרם ממוצעות. עבור גרפי זרם-מתח, מתחי המדרגה מסומנים מימין בחצי חצים. זהו מהלך הזמן של הגברת זרם KV7 על ידי 100 nanomolar של zinc perion שנמדד ב-voltage clamp רציף ב-minus 20 millivolts. מוצגים כאן עקומות זרם-מתח ממוצעות שנגזרו מצפיפות זרם KV7 שהוקלטו לפני, במהלך טיפול ב-100 nanomolar של zinc perion, ובמהלך טיפול ב-10 micromolar של חוסם תעלות KV7 מסוג XC 9 9 1; הרפיה שאישרה zinc ion של עורק מסנטרים (mesenteric artery) שקוצר מראש עם 100 picomolar של arginine vasopressin.
איור זה מציג את מהלך הזמן של שינויים בקוטר החיצוני של כלי הדם בתגובה למתן 100 picomolar arginine vasopressin, ולאחריו מתן 100 nanomolar zinc ion. לאחר צפייה בסרטון זה, תגייעו להבנה טובה של אופן הכנת עורקים לצורך בידוד תאים בודדים או למדידה במיאוגרפיה של לחץ לבדיקת התכווצות עורקית ותגובות הרחבה. בנוסף, עליכם לדעת כיצד להקליט זרמי KV seven בבידוד מזרמים אחרים במיוציטים עורקיים שבודדו acabado.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד במדידת הפעילות של תעלות אשלגן מסוג Kv7 בתאי שריר חלק של עורקים מזנטריים ובהצלבתה עם שינויים בקוטר העורקים. המתודולוגיה משלבת אלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp ומיוגרפיית לחץ כדי להעריך את השפעותיה של פעילות תעלות Kv7 על תגובות כלי דם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה וסקולרית
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- תעלות Kv7 (KCNQ) ממלאות תפקיד מכריע בתפקוד השריר החלק בכלי הדם.
- הבנת פעילותן יכולה לספק תובנות לגבי בריאות כלי הדם ומחלות של כלי הדם.
- טכניקות patch clamp מאפשרות מדידה מדויקת של זרמים בערוצי יונים.
- מיוגרפיית לחץ (Pressure myography) מעריכה את התגובות הפיזיולוגיות של כלי דם.
מטרת המחקר
- למדידת פעילות ערוצי Kv7 בתאי שריר חלק arteriolar מבודדים.
- לקשירת פעילות Kv7 לתגובות של התכווצות והרחבה עורקית.
- לשיפור ההבנה של הפיזיולוגיה והפרמקולוגיה של השריר החלק בכלי הדם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הסרה כירורגית של קשת כלי הדם המזנטריים מחולדה.
- דיסקציה וניקוי של מקטעי עורק מזנטריים.
- בידוד של תאי שריר חלק למדידות patch clamp.
- קניולציה של מקטעי עורקים להערכות של מיוגרפיה תחת לחץ (pressure myography).
תוצאות עיקריות
- הוצג הקשר בין פעילות תעלות Kv7 לבין שינויים בקוטר העורקים.
- הוצג כיצד מודולטורים פרמקולוגיים משפיעים על תגובות כלי דם.
- סופקו תובנות לגבי התפקידים הפיזיולוגיים של תעלות Kv7 בשריר חלק.
- הודגשה החשיבות של שילוב טכניקות אלקטרופיזיולוגיה ומיוגרפיה.
מסקנות
- ערוצי Kv7 משפיעים באופן משמעותי על התנהגות השריר החלק בכלי הדם.
- הבנת תפקודם יכולה לספק מידע לאסטרטגיות טיפוליות למחלות וסקולריות.
- מחקר זה מבסס מסגרת למחקר עתידי על ערוצי יונים בפיזיולוגיה וסקולרית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת התפקוד של תעלות האשלגן Kv7 בשריר חלק עורקי מספקת תובנה מכניסטית לגבי ויסות טונוס כלי דם, המהווה גורם מרכזי הקובע את לחץ הדם ואת ההתנגדות ההיקפית. גישה משולבת זו של אלקטרופיזיולוגיה ומיוגרפיה מאפשרת הפחתת סיכונים עבור מטרות טיפוליות על ידי קישור פעילות תעלות יונים לתגובות כלי דם פיזיולוגיות, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בתהליכי גילוי תרופות למערכת הדם והלב. המתודולוגיה מקלה על בדיקת השערות בשלב מוקדם עבור תרכובות המשפיעות על כיווצות כלי דם, ומסייעת בקבלת החלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) בנתיבי פיתוח פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של ויסות ערוצי Kv7 במיוציטים עורקיים מקוריים, ובכך מבהיר את תפקידם במסלולי כיווץ וכיווץ כלי דם (vasoconstriction ו-vasodilation).
- ערך תפעולי: מספק תיקוף תפקודי של Kv7 כמטרה וסקולרית על ידי קורלציה בין זרמי הערוץ לבין שינויים בקוטר העורק תחת לחץ פיזיולוגי.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הדגמה של האופן שבו סוכנים פרמקולוגיים (למשל, יון אבץ, XC991) משנים את פעילות ה-Kv7 ואת טונוס כלי הדם, ובכך מספק ביסוס למידת הביטחון במטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: קובע מערכת בדיקה הניתנת לשחזור למדידת מערכות יחסים של זרם-מתח ב-Kv7 בתאים שבודדו לאחרונה, תוך מזעור ארטיפקטים ממערכות של ביטוי יתר.
- ערך תפעולי: משלב אלקטרופיזיולוגיה של patch clamp עם pressure myography ליצירת פלטפורמה סטנדרטית ורלוונטית פיזיולוגית לסריקת תעלות יונים.
- מוכנות הבדיקה: מאפשרת כימות של צפיפות זרם ותלות במתח של Kv7, התומכת בתיקוף פגיעות (hit validation) ובאופטימיזציה של מולקולות מובילות בתוכניות המתמקדות בתעלות יונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שימוש בעורקים מזנטריים של חולדה הרלוונטיים למחלה לדגמי פיזיולוגיה וסקולרית אנושית, ובכך להגברת הרצף התרגומי מתפקוד התעלות לתגובות ברמת הרקמה.
- ערך תפעולי: הדגמה של האופן שבו מודולטורים של Kv7 משפיעים על עורקים מכווצים מראש, תוך סימולציה של תנאים פתופיזיולוגיים הרלוונטיים ליתר לחץ דם ולתפקוד וסקולרי לקוי.
- ערך ניבוי: תמיכה בקידום מותאם סיכונים על ידי הצגת השפעות וסקולריות תלויות-מינון של מפעילים וחוסמים של Kv7, ובכך סיוע בהערכת המדד הטיפולי.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים (אפיון תעלות יונים) לבין תיקוף פרה-קליני (הערכה תפקודית של כלי דם), ובכך היא ממקמת את הסריקה של Kv7 כשלב להורדת סיכונים מנגנונית בין זיהוי המטרה לאופטימיזציה של מולקולת העופרת בגילוי תרופות למערכת לב-דם.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מעורבות ערוצי Kv7 במסלולי סיגנלינג וסקולריים באמצעות מדידה ישירה של זרם בתאי שריר חלק טבעיים.
- סריקה: מספק נתונים כמותיים של זרם Kv7 המוכנים לבדיקה עם הדירות גבוהה, מה שמאפשר השוואה אמינה של השפעות תרכובות בין כימוטיפים שונים.
- אנליטיקה: מספק קשרי זרם-מתח המופקים מרכיב voltage-clamp ומדדי קוטר עורקי, המאפשרים ניתוח רב-פרמטרי של תפקוד הערוץ ותגובה וסקולרית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אלקטרופיזיולוגיה תאית לבין פיזיולוגיה של עורקים ex vivo, ובכך תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים בין פעילות ערוצי יונים לבין טונוס וסקולרי.
- שימוש חוזר ארגוני: מקיים פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר ערוצי יונים אחרים (למשל, Kv, Ca2+, Cl-) בשריר חלק עורקי, ובכך ממקסם את ההשקעה בתשתיות לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ב-Kv7 כיעד כלי דם על ידי הדגמת השפעות תפקודיות ישירות של מודולציה של התעלה על כיווץ עורקים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה באמצעות קריאות משולבות של אלקטרופיזיולוגיה ומיוגרפיה מאותו מקור רקמה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת נשירה בשלבים מאוחרים באמצעות תיקוף מכניסטי מוקדם של יעדי כלי דם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד בעדיפות מותאמת סיכון של תרכובות המודולטיביות ל-Kv7, בהתבסס על נתוני יעילות משולבים ברמת התא והרקמה.
שיקולים ליישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של כלי דם, בידוד תאים, אלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp וטכניקות של pressure myography.
- תלות בציוד ייעודי הכולל מגברי patch clamp, מיקרו-מניפולטורים ומערכות pressure myography עם זיהוי קצוות בווידאו (video edge detection).
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי האלקטרופיזיולוגיה והפיזיולוגיה כדי להבטיח הכנת רקמות וניתוח נתונים עקביים.
- שיקולי התאמה כוללים בחירת כלי דם ספציפיים למין (למשל, עורקים מזנטריים של חולדה לעומת עכבר) ואופטימיזציה של פרוטוקולים לדיסוציאציה אנזימטית עבור מיטות כלי דם שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות תפוקה נמוכה של תאי שריר חלק חיוניים לכל מקטע עורקי ואתגר טכני בשמירה על שלמות העורקים במהלך קנולציה והפעלת לחץ.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:08
Dissection and Cleaning of Arteries
3:04
Cell Isolation for Patch Clamp Studies
4:50
Whole-cell Recording to Measure Kv7 Potassium Currents or Membrane Voltage
6:36
Use of Intact Artery Segments for Pressure Myography
9:00
Results: Kv7 Potassium Channel Function of Arterial Smooth Muscle using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography
10:33
Conclusion
