היכרות עם פונקצית עורקי שריר חלק Kv7 אשלגן ערוץ באמצעות אלקטרופיזיולוגיה קלאמפ תיקון וMyography לחץ

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את הפעילות של KV שבע תעלות אשלגן בתאי שריר חלק של עורק מזנטרי טרי, ולקשר זאת למדידות קוטר העורק שנרשמו בתנאים פיזיולוגיים. זה מושג על ידי הסרה כירורגית תחילה של ארקייד כלי הדם המזנטרי מחולדה. השלב השני הוא לנתח ולנקות את קטעי העורקים המזנטריים.

לאחר מכן, מקטעים מסוימים משמשים לבידוד תאי שריר חלק בודדים למדידות אלקטרופיזיולוגיות של KV שבעה זרמי אשלגן. השלב האחרון הוא קנולציה של מקטעי עורקים שלמים למדידות מיו לחץ של התכווצות או התרחבות עורקים בתגובה למודולטורים הפרמקולוגיים של KV שבע תעלות אשלגן. בסופו של דבר, השילוב של אלקטרופיזיולוגיה של מהדק תיקון ומיוגרפיה בלחץ משמש כדי להראות כיצד עלייה או ירידה בפעילות של KV שבע תעלות אשלגן משפיעה על התכווצות העורקים המזנטריים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שימוש בתעלות שיבוט המתבטאות בקווי תאים, הוא שהזרמים נרשמים מתאים לא מתורבתים המבטאים באופן מקורי את התעלות וניתן לבודד את זרמי ה-KV מסוגים אחרים של תעלות אשלגן שעשויות להיות מופעלות באותם תאים. מיוגרפיית הלחץ מאפשרת להקליט את התגובות התפקודיות מאותה רקמה ממנה נגזרים התאים המבודדים, והשיטה רגישה יותר ופיזיולוגית יותר מתכשירים אחרים כמו טבעות עורקים או רצועות עורקים. ד"ר בארת מאני, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי, ידגים את טכניקות הקנולציה העורקית ומיוגרפיית הלחץ וד"ר לובה ברוגמן, עוזרת מחקר במעבדה שלי, תדגים את הליכי בידוד התאים ותוכנית הטלאים.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך קטע של 10 עד 12 סנטימטר בשני קצוות המעי הדק של חולדה. לאחר מכן בודד את המעי יחד עם כלי הדם המחוברים אליו. לאחר מכן, הצמד את קטע המעי הדק.

מורחים את המזנטריה על הצד הקרוב של החדר כך שהענף הראשי של העורק המזנטרי העליון נמצא במרכז וסדר הענפים הבא מקרין מהמרכז. לאחר מכן הנח את הפינים רק על מקטעי המעי המדמיינים דרך מיקרוסקופ חיתוך מואר. נקה בזהירות את רקמת השומן ואת רקמת החיבור המקיפה את העורקים מסדר שני עד רביעי קרוב למעיים באמצעות מיקרו מלקחיים ומספריים.

החזק את הוורידים הסמוכים כדי להקל על ניקוי רקמת השומן ורקמת החיבור והימנע ממתיחה מיותרת של העורקים. כעת העבירו שניים עד שלושה מקטעים של העורק המזנטרי לתוך צלחת תרבית רקמה בגודל 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר של תמיסת בידוד קר כקרח. הניחו את המנה על קרח לאחר מכן, חתכו את מקטעי העורק המזנטרי לחתיכות באורך של שלושה עד ארבעה מילימטרים באמצעות PEs הפיפטה שלכם עם קצה מלוטש באש.

העבירו את מקטעי העורקים לבקבוקון זכוכית המכיל שני מיליליטר של תמיסת בידוד חמה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן דגרו אותו למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, שאפו בזהירות את תמיסת הבידוד של 37 מעלות צלזיוס בעזרת פיפטה אחורית.

הוסף אליו שני מיליליטר תמיסת אנזים חמה, ואז דגר אותו למשך 35 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. מיד לאחר הדגירה של 35 דקות בתמיסת האנזים, הניחו את הבקבוקון על קרח, שאפו את תמיסת האנזים והוסיפו שני מיליליטר תמיסת בידוד קר כקרח. חזור על הליך זה ארבע פעמים.

לאחר מכן, במיליליטר אחד של תמיסת בידוד קר כקרח, חזור בעדינות על מקטעי העורקים עם הפיפטה האחורית המלוטשת. 10 עד 20 פעמים כדי לשחרר תאי שריר חלק בודדים של העורק המזנטרי. ודא את הופעת המיוציטים מעת לעת על ידי הנחת טיפה של תרחיף התא על צלחת של 35 מילימטר וצפייה בהם תחת המיקרוסקופ.

SMCs MA בריאים צריכים להיות בעלי מראה מוארך חלק. לאחר מכן, העבירו כ-100 עד 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתא ההקלטה בעזרת פיפטה דביקה מלוטשת ואפשרו לתאים להיצמד למשך 15 דקות. בשלב זה, מלאו את קצה פיפטת התיקון באמפוטריצין B, תמיסה פנימית חופשית על ידי הטיית קצה הפיפטה בתוכו.

לאחר מכן הפעל יניקה בקצה השני באמצעות מזרק של 10 מיליליטר המחובר באמצעות חתיכת צינור, הוסף מידע על טרין B המכיל תמיסת פיפטה מלמעלה. בעזרת קצה פיפטה מיקרו מעמיס einor עד שהפיפטה מתמלאת בערך חצי בתמיסה. הסר בועות אוויר על ידי הקשה עדינה על הפיפטה.

לאחר מכן, הכנס את הפיפטה למחזיק האלקטרודה. השתמש במניפולטור מיקרו כדי להוריד את הפיפטה אל פני השטח של מיוציט מוארך. כאשר התנגדות הפיפטה עולה לשישה עד 10 מגה אוהם, הפעל יניקה כדי להשיג איטום ג'יגה.

במקביל, הגדר את מתח ההחזקה לאפס מילי-וולט בזמן ההמתנה לניקוב הממברנה. לאחר מכן, החל צעדי מתח של 100 מילי-שניות על פלוס 10 מילי-וולט ולאחר מכן על מינוס 10 מילי-וולט. השתמש במגבר כדי לפצות על קיבול הפיפטה המהיר החולף במקביל להופעת קיבול התא השלם.

זרמים חיוביים מתמשכים קטנים חולפים שניים עד 10 מגבר פיקו, טהור ומשרעת מצביעים על נוכחות של שבעה ערוצים KV פונקציונליים. הניקוב המוצלח עם אמפוטריצין B יפחית את התנגדות הגישה ל -35 מגה אוהם או פחות. כדי להקליט את יחס המתח של KV שבעה זרם, החל חמש שניות מהמתח על מתחים הנעים בין מינוס 84 מילי-וולט שבהם ההסתברות הפתוחה של KV שבעה ערוצים היא מינימלית עד פלוס 16 מילי-וולט שבהם ההסתברות הפתוחה של KV שבעה ערוצים מגיעה לרמה לאחר חמש שניות בכל מתח בדיקה, צעד אחורה למתח ההחזקה במינוס ארבעה מילי-וולט למשך 10 שניות.

בהליך זה, יש לתלות באופן רופף שני תפרי ניילון עדינים שהוכנו מראש מכל צד. בסמוך לצינורית הזכוכית, העבירה בזהירות את קטע העורק המזנטרי המנותח מתא הניתוח לתא השתלת מיו בלחץ על ידי החזקת קצה אחד של הקטע באמצעות זוג מיקרו מלקחיים. לאחר מכן, דמיינו באמצעות מיקרוסקופ ניתוח מואר, החזיקו קצה אחד של קטע העורק והחליקו אותו בעדינות על צינורית הזכוכית השמאלית.

אבטח את הקצה באמצעות תפרי הניילון. לאחר מכן שטפו בעדינות את נוזל הלומן דרך הכלי המותקן כדי להסיר דם ופסולת. לאחר מכן יש לסגור את השסתום למזרק השמאלי כך שצד זה יציג עמוד נוזל סטטי שכנגדו מותאם הלחץ מצד ימין, באמצעות המניפולטור המיקרו מקם את צינורית הזכוכית הימנית הניתנת להזזה קרוב יותר לקטע העורק ומשוך את הקצה הימני של הקטע מעליו.

לבסוף, אבטח את קטע העורק בתפרי ניילון וחתוך את חוטי התפרים העודפים. כעת התקן את יחידת גרף הלחץ על הבמה מעל מיקרוסקופ מיקרוגרף הלחץ. חבר את עמוד הלחץ לצד ימין של תא הגרף ולאחר מכן הנח את המכסה מעל החדר.

הרם בהדרגה את מזרק ה-10 מיליליטר במשך תקופה של 15 דקות ובדוק אם יש נזילות בכלי עד שמתמר הלחץ P One קורא 80 מילימטר כספית התאם את המרחק בין הצינורית בעת הצורך, יש לכוונן את המרחק בצורה כזו שקטע העורק בלחץ יהיה ישר בערך ויוצר דפוס דמוי כתף שבו נוצרים הקשרים. בדוק את כדאיות הכלי המותקן על ידי היתוך העל החולף עם אשלגן כלורי 60 מילי-מולר למשך 30 שניות. כלי בר קיימא מתכווץ במהירות עם תוספת אשלגן כלורי ומתרחב מיד עם שטיפתו.

לאחר מכן, הוסף את חומר הבדיקה המרוכז לתמיסת האמבטיה ישירות פיפטה אותו קדימה ואחורה בעדינות בסמוך לקצה החדר כדי לערבב את חומר הבדיקה בתמיסת האמבטיה, והניב את הריכוז הסופי המתאים בתא של 10 מיליליטר. ניתן לעקוב אחר שינויי נפח בקוטר הכלי בעקבות הוספת חומר הבדיקה בתמונת הווידאו החי וגם לשרטט בחלון ניתוח התמונה בזמן שהניסוי מתבצע. איור זה מציג משפחה של עקבות זרם רציף שנרשמו בתגובה לצעדי מתח לפני הטיפול כפי שמוצג בשחור ובעקבות הייצוב בנוכחות פריון אבץ ננו-מולרי במיוציטים של עורק מזנטרי יחיד כפי שמוצג באדום, להלן הזרמים המייצגים לבקרה ולפריון אבץ 100 ננו-מולרי.

הפסים האפורים מציינים את מרווח הזמן שבו נמדדו אמפליטודות זרם ממוצעות עבור תרשימי מתח זרם, מתחי צעד מסומנים מימין על ידי ראשי חצים. זהו מהלך הזמן של שיפור זרם KV 7 על ידי פריון אבץ ננו-מולרי של 100 ננו-מולרי שנמדד עם מהדק מתח רציף במינוס 20 מילי-וולט. המוצג. להלן עקומות מתח הזרם הממוצעות הנגזרות מצפיפות זרם KV שבע שנרשמו בעבר במהלך הטיפול בפריון אבץ 100 ננו-מולרי, ובמהלך הטיפול ב-10 מיקרומולר של חוסם שבעה ערוצים KV XC 9 9 1 יון אבץ השרתה הרפיה של העורק המזנטרי מכווץ מראש עם 100 ארגינין וזופרסין פיקומולר.

איור זה מציג את מהלך הזמן של שינויים בקוטר החיצוני של כלי הדם בתגובה ליישום של 100 ארגינין וזופרסין פיקומולר, ואחריו יישום של 100 יון אבץ ננו-מולרי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין עורקים לבידוד תאים בודדים או למדידה גרפית של לחץ מיו של התכווצות עורקים, תגובות מרחיבות. בנוסף, עליכם לדעת כיצד לרשום KV שבעה זרמים בבידוד מזרמים אחרים במיוציטים עורקיים מבודדים טריים.