איטרטיבי אופטימיזציה של דופלקסים DNA להתגבשות של מכלולי SeqA-DNA

ניסוי זה מפרט כיצד להשיג גבישים באיכות עקיפה של חלבון הקשור ל-DNA המכיל מכפלת טנדם מתילציה GATC. חזור על הפעולה כדי להעדיף אריזת גביש של קומפלקס ה-DNA של החלבון. התחל עם העיצוב הרציונלי של אורך ה-DNA, מרווח ה-GATC וקצוות ה-DNA, המשך עם האוליגונוקלאוטידים המשלימים החד-גדיליים כדי לטהר את ה-DNA ולאחר מכן אנל ליצירת דופלקס ה-DNA המתילציה של האמי, ואז ערבב פנימה את הרצף המטוהר A ליצירת הקומפלקס.

לאחר מכן, מצא תנאים אופטימליים לגידול גבישים באיכות עקיפה של קומפלקס ה-DNA של החלבון עם ניסויי התגבשות באמצעות מסכי מטריצה דלילים מסחריים. תוצאות מוכחות. שתף את ההשפעה של אורך DNA משתנה, מרווח וקצוות GATC על איכות העקיפה של גבישי ה- CQ A DNA.

מטרת עבודה זו היא להשיג גבישים באיכות עקיפה של CK הקשורים ל-DNA, אך היא יכולה גם לעזור להבין את המשתנים הכלליים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון דופלקסים של DNA להתגבשות של קומפלקסים אחרים של DNA חלבוני המדגימים הליך זה ישמשו בצ'אנג, A עבור עמית דוקטורט מהמעבדה שלי. מחקר זה משתמש בגרסה של חלבונים מווסתים לשכפול DNA. חפש a שיוצר דימרים יציבים ויש לו אזור קישור מקוצר בין האיזציה שלו לתחומי קשירת ה-DNA.

גרסה זו מגבילה את קשירת ה- DNA לחזרות GATC טנדם המופרדות אך ורק על ידי סיבוב אחד על ה- DNA טרנספורמציה ראשונה BBL 20 1D שלושה תאים עם הפלסמיד המקודד DEMETRIC seq A בשליטת צלחת המקדם T 7. תגובת הטרנספורמציה על צלחות אגר LB המכילות 100 מיקרוגרם למיליליטר, אמפיצילין ומניחים בחממת החיידקים למשך הלילה. בחרו מושבות מעורבות והתחילו תרבות לילה בקנה מידה קטן.

למחרת בבוקר חיסון תרבית ליטר אחד עם 10 מיליליטר של חיסון הלילה. כאשר התרבית נמצאת בשלב היומן, הוסף שני מיליליטר של 0.5 IPTG מולארי כדי לגרום לייצור חלבון. המשיכו את הדגירה במשך שלוש שעות בשייקר אורביטלי של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 3, 300 גרם למשך 10 דקות. ריס, השהה את פלטת התאים בטיהור, חצץ שקרים על ידי סוניקציה ונקה את הליזאט על ידי צנטריפוגה ב 39, 000 פעמים G למשך 40 דקות. כעת טען את ה-S supernatant על עמוד הפרין מאוזן עם מאגר טיהור.

כדי לנטרל את חלבון ה-CK. השתמש בשיפוע ליניארי לנתרן כלורי מולרי אחד חלבון CK בסביבות 0.7 נתרן כלורי מולארי. משוך את ה-CK המכיל שברים ודלל כדי להוריד את חוזק היונים של הדגימה.

לאחר מכן טען את הדגימה לעמודת כרומטוגרפיה של חילופי קטיון E השווה למאגר טיהור. החל שיפוע מלח ליניארי על לולאת חלבון CK טהור בסביבות 0.4 נתרן כלורי מולרי. שלב את ה-CK המכיל שברים.

יש לרכז לשלושה מיליגרם למיליליטר ולאחסן באחסון. עיצוב חוצץ משלים אוליגונוקלאוטידים ללא מתילציה ומתילציה. הכינו דגימות של מיקרומול אחד מכל DNA גדיל בודד ליופיליזציה ב-800 מיקרוליטר של חיטוי, מערבולת מים מזוקקים כפולה והניחו בצד למשך 15 דקות עכשיו ו-800 מיקרוליטר.

חיממו מראש פעמיים מאגר טעינה לכל דגימה עבור 20 עד 30 נוקלאוטידים אוליגונוקלאוטידים ארוכים מכינים ג'ל דנטורציה גדול של 10%. לאחר הפילמור, הסר את המסרק ושטוף היטב את הבאר. הרכיבו את הג'ל וממלאים את המאגרים העליונים והתחתונים במאגר פועל TBE חד פעמי.

הפעל מראש את הג'ל ב-750 וולט כדי לחמם את הג'ל ל-55 מעלות צלזיוס. לאחר מכן עצור את הריצה ושטוף היטב את הבארות עם מאגר רץ. כעת מחממים את האוליגונוקלאוטידים ל 90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.

מערבולת וסיבוב. הדגימות ממשיכות מיד להעמיס את הג'ל. הפעל את הג'ל בסביבות 700 וולט עד שהאוליגונוקלאוטיד נודד.

באמצע הדרך על ג'ל פולי אקרילאמיד 10%, אלף פנול כחול נודד עם אוליגונוקלאוטידים באורך של כ-20 בסיסים וקסילן סיל ff באורך של כ-60 בסיסים. פרק את הג'ל מהמנגנון והסר את המרווחים על משטח ישר. הסר צלחת זכוכית אחת וכסה את הג'ל בניילון.

לאחר מכן הפוך את הג'ל, הסר את צלחת הזכוכית השנייה וכסה את הג'ל בניילון. לאחר מכן, סמן את הרצועות באמצעות אור UV וצלחת פלורסנט מאחורי הג'ל. כדי לראות את צל ה-DNA עם סכין גילוח, כרתו את הרצועה וחתכו אותה לחתיכות קטנות.

העבירו כל דגימה לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. מוסיפים תשעה מיליליטר של חיץ אלוציאני ומדללים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בערבוב. העבירו בזהירות את התמיסה לצינור צנטריפוגה חיטוי באמצעות קצה פיפטה לטעינת ג'ל.

כדי להימנע מהעברת חתיכות אקרילאמיד, הוסף מיליליטר אחד של שלושה מילי-נתרן אצטט pH שבע פלוס 25 מיליליטר דגירה של 100% אתנול צונן במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות. צנטריפוגה ה- DNA המשקע. לאחר מכן יבש את הכדורים על שואב המהירות בחום בינוני השהה כל כדור ב-400 מיקרוליטר של חיטוי, מים מזוקקים כפולים והעבירו לצינור טרי.

הוסף 40 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי ב-pH שבע ומיליליטר אחד של מערבולת אתנול 100% ודגירה למשך 30 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-18,000 פעמים. G, שטפו את כדורי ה-DNA עם 100 מיקרוליטר של אתנול קר 70% כדי להסיר כל שאריות מלח במשך שש דקות ב-18,000 פעמים. G לאחר מכן השליכו את האתנול וייבשו את הכדור על שואב מהירות.

כעת שלח מחדש כל גלולה ב -100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים. קבע את ריכוז האוליגונוקלאוטידים על ידי ספקטרומטריה. כדי להכין את דופלקסי ה-DNA המתיליים מערבבים תחילה ריכוזי מולו שווים של הגדילים הבודדים המשלימים.

לאחר מכן מחממים את התערובות ל 95 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך חמש דקות כדי להניע את הגדילים. תן לדגימות להתקרר לאט לטמפרטורת החדר בתוך אמבט המים. שלב נפחים שווים של 81 חלבון CQ מטוהר מיקרו-מולרי ו-81 DNA מתילציה של מכפלת מיקרומולרי.

ואז דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. יש לאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש במסך לתנאי התגבשות באמצעות מסכי מטריצה דלילים מסחריים. לאחר שזוהו מובילי התגבשות ראשוניים, מטב את התנאים לגידול גבישים באיכות עקיפה כדי לבכות ולהגן על גבישי ה-DNA של CK שנוצרו.

או להגדיל את כמות ה-PEG 400 הקיימת בתמיסת ההתגבשות לריכוז סופי של 25% או להוסיף 20% גליצרול לתמיסת ההתגבשות. הוציאו קריסטלים בודדים עם פלאש לולאת ניילון. הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי.

כעת בדוק את גבול העקיפה של כל גביש ב-100 k. כדי להשיג את המבנה הגבישי של המוטנט המקוצר של CK הקשור ל-DNA שעבר מתילציה של Hemi, אנו מייעלים ברצף שלושה פרמטרים על ה-DNA, המרווח בין רצפי GATC שעברו מתילציה של Hemi, אורך הדופלקס והיעדר או נוכחות של חמישה תלויים ראשוניים. מחקר זה משתמש בגרסת DME של seek a עם מוטציה נקודתית בתחום הקצה הסופי המונעת קשירה נוספת ומקשר מקוצר המגביל את קשירת ה-DNA לטנדם.

חזרות GATC מופרדות אך ורק על ידי סיבוב אחד במבחני שינוי הניידות החשמלית של ה- DNA מצביעים על כך שחלבון ה- CK השונה קושר באופן מועדף חזרות GATC המופרדות על ידי תשעה עד 10 זוגות בסיסים. לכן, מסכים ראשוניים משתמשים בדופלקסים של 23 עד 24 זוגות בסיסים באורך המכיל שני מכפלות מתילציה . חזרות GATC מופרדות על ידי תשעה או 10 זוגות בסיסים.

שלושה דופלקסים הניבו גבישים מעוצבים יפה. בעוד שאף אחד מהגבישים לא סטה לרזולוציה גבוהה. הנתונים אכן הצביעו על כך שהפרדת A-G-A-T-C של תשעה זוגות בסיסים הייתה עדיפה להתגבשות, מה ששיפר באופן בלתי צפוי את אינטראקציות עמוד השדרה של החריץ על ידי הכללת דינוקלאוטיד CG בין שני אתרי ה-GATC, לא שינה את גבול העקיפה של הגבישים.

לעומת זאת, אופטימיזציה של אורך התלויים שינתה באופן דרמטי את המגעים המולקולריים ואת המורפולוגיה הגבישית. המבנה הגבישי של חלבון CK זה הקשור לדופלקס DNA מתילציה אישר כי הפנים החופשיות של דופלקס ה-DNA אינן עוסקות במגעי גביש למרות הגודל היחסי של חלבון ו-DNA, רוב האינטראקציות בין בני זוג סימטריים מתווכות על ידי אינטראקציות DNA של חלבון, חלבון וחלבון. מעניין שבמקרה הספציפי הזה, ההשפעה המיטיבה של תליית חמישה דינוקלאוטידים ראשוניים אינה נובעת מהיווצרות DNA רציף פסאודו.

במקום זאת, חמשת הקצה הראשוני של גדיל המתילציה מקרין הרחק מצירי ה-DNA ומקיים אינטראקציה עם מולקולת ה-CK הפרוקסימלית של הקומפלקס, מה שמסביר מדוע נדרשו שני נוקלאוטידים כדי לשנות את אריזת הגביש. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר חלבונים ולעצב דופלקסים של DNA להתגבשות קומפלקס DNA חלבוני. חשוב לזכור שלמרות שפרוטוקול זה היה מכשיר לגיבוש קומפלקס ה-DNA CK, האופטימיזציה הרציונלית של רצף אורך ה-DNA והקצוות מספקת מסגרת כללית לתכנון דופלקסים של DNA להתגבשות קומפלקסים אחרים של DNA חלבוני.