איטרטיבי אופטימיזציה של דופלקסים DNA להתגבשות של מכלולי SeqA-DNA

ניסוי זה מפרט כיצד להשיג קריסטלים באיכות דיפרקציה של חלבון הקשור ל-DNA המכיל רצף GATC חצי-מתילת (hemi methylated) בסידור טנדמי. חזור על הפעולה כדי לעודד אריזה קריסטלית של קומפלקס החלבון-DNA. התחל בתכנון רציונלי של אורך ה-DNA, המרווח בין רצפי ה-GATC וקצוות ה-DNA, המשך עם אוליגו-נוקלאוטידים משלימים בעלי גדיל יחיד כדי לטהר את ה-DNA, ולאחר מכן בצע התמראה (anneal) ליצירת דופלקס DNA חצי-מתיל, ולבסוף ערבב את seq A המטוהר כדי ליצור את הקומפלקס.

בשלב הבא, מצאו את התנאים האופטימליים לגידול גבישים באיכות דיפרקציה של קומפלקס החלבון-DNA, באמצעות ניסויי התגבשות המשתמשים במסכי מטריצה דלילה (sparse matrix screens) מסחריים. תוצאות מוכחות. שתפו את ההשפעה של שינוי אורך ה-DNA, המרווחים בין רצפי GATC והקציונות על איכות הדיפרקציה של גבישי ה-CQ A DNA.

מטרת עבודה זו היא להשיג גבישים באיכות דיפרקציה של CK הקשור ל-DNA, אך היא יכולה לסייע גם בהבנת המשתנים הכלליים שיש להביא בחשבון בעת תכנון דופלקסים של DNA לצורך התגבשות של קומפלקסים אחרים של חלבון-DNA. הדגמה של נוהל זה תשמש את Chang, A, עמית דוקטורט מהמעבדה שלי. מחקר זה משתמש בווריאנט של חלבוני בקרה של רפליקציית DNA. Seek a המגבש דימרים יציבים ובעל אזור מקשר (linker) מקוצר בין דומייני ה-ization והקישור ל-DNA.

וריאנט זה מגביל את קישור ה-DNA לחזרות GATC טנדם המופרדות באופן בלעדי על ידי סיבוב אחד של ה-DNA. ראשית, בצע טרנספורמציה לתאי BBL 20 1D שלושה עם הפלסמיד המקודד ל-DEMETRIC seq A תחת בקרת פרומוטר T7. פזר את תגובת הטרנספורמציה על צלחות אגר LB המכילות 100 micrograms per milliliter ampicillin והנח אותן באינקובטור חיידקי למשך לילה.

בבוקר למחרת, יש להחדיר לתרבית של ליטר אחד 10 מיליליטר מהאינוקולום של הלילה הקודם. כאשר התרבית נמצאת בשלב הלוג (log phase), יש להוסיף שני מיליליטר של IPTG בריכוז 0.5 מולארי כדי להשרות ייצור חלבון. יש להמשיך את הדגירה למשך שלוש שעות במנער אורביטלי בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר מכן, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגציה ב-3,300 G למשך 10 דקות. השעו את משק התאים בבופר טיהור A באמצעות סוניקציה, והצלילו את הליסאט על ידי צנטריפוגציה ב-39,000 ×G למשך 40 דקות. כעת, טענו את הסופרנאט על עמודת הפרין שהושרה עם בופר טיהור.

להשגת אלואוציה של חלבון ה-CK. השתמש במדרג ליניארי עד לריכוז של 1 molar של sodium chloride; חלבון ה-CK יוצא באלואוציה בריכוז של כ-0.7 molar של sodium chloride. אסוף את הפראקציות המכילות את ה-CK ומדלל אותן כדי להוריד את העוצמה היונית של הדגימה.

לאחר מכן, טען את הדגימה לעמודת כרומטוגרפיית חילוף קטיונים E שהושווה עם באפר טיהור. החל גרדיאנט מלח ליניארי כדי לשחרר חלבון CK טהור בריכוז של כ-0.4 molar sodium chloride. איחד את הפראקציות המכילות CK.

רכז ל-3 mg/mL ושמור בתנאי אחסון. תכנון באפר עבור אוליגונוקלאוטידים משלימים, לא מתילתיים ומתילתיים. הכן דגימות של 1 µmol מכל גדיל DNA בודד ליופיליזড ב-800 µL של מים מזוקקים פעמיים שעברו אוטוקלאב, ערבב בוורטקס והמתן 15 דקות, ולאחר מכן הוסף 800 µL.

הוסיפו תמיסת טעינה (loading buffer) בריכוז פי 2 שחוממה מראש לכל דגימה עבור אוליגונוקלאוטידים באורך של 20 עד 30 נוקלאוטידים והכינו ג'ל דנטורטיבי בריכוז 10%. לאחר הפולימריזציה, הסירו את המסרק ושטפו את הבארות ביסודיות. הרכיבו את הג'ל ומלאו את מאגרי החלק העליון והתחתון בתמיסת TBE running buffer בריכוז פי 1.

הריצו את הג'ל מראש במתח של 750 וולט כדי לחמם אותו ל-55 degrees Celsius. לאחר מכן, עַצרו את ההרצה ושטפו היטב את הבארים עם באפר הרצה. כעת, חממו את האוליגונוקלאוטידים ל-90 degrees Celsius למשך שתי דקות.

בצעו ערבול (Vortex) וסבב בצנטריפוגה. העבירו את הדגימות מיד להטענה לג'ל. הפעילו את הג'ל במתח של כ-700 וולט עד להגירה של האוליגונוקליאוטיד.

במרכז ג'ל poly acrylamide בריכוז 10%, צבע ה-phenol blue נודד יחד עם אוליגנוקלאוטידים באורך של כ-20 בסיסים, וצבע ה-xylene cyanol FF נודד יחד עם אוליגנוקלאוטידים באורך של כ-60 בסיסים. פרקו את הג'ל מהמכשיר והסירו את המפרידים (spacers) על משטח שטוח. הסירו פלטת זכוכית אחת וכסו את הג'ל בניילון נצמד.

לאחר מכן הפכו את הג'ל, הסירו את לוחית הזכוכית השנייה וכסו את הג'ל בניילון נצמד. בשלב הבא, סמנו את הפסים באמצעות אור UV ולוחית פלואורסצנטית מאחורי הג'ל. כדי לראות את צל ה-DNA, גזרו את הפס באמצעות להב תער וחלקו אותו לחתיכות קטנות.

העבירו כל דגימה לשפופרת סטרילית של 15 מיליליטר. הוסיפו תשעה מיליליטר של בופר אלוציה (elucian buffer) ודללו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תוך כדי ערבוב.

כדי למנוע מעבר של חלקי אקרילאמיד, הוסיפו 1 mL של סודיום אצטט 3 mM ב-pH 7 בתוספת 25 mL של 100% ethanol מקורר, והדגירו בטמפרטורה של 20°C- למשך שלוש שעות לפחות. צנטריפוגו את ה-DNA שהשקיע. לאחר מכן, ייבשו את המשקעים ב-speed vac בחום בינוני, השביו כל משקע ב-400 µL של מים מזוקקים פעמיים שעברו אוטוקלאב, והעבירו למבחנה נקייה.

הוסיפו 40 µL של נתרן אצטט בריכוז 3 M ב-pH 7 ו-1 mL של 100% ethanol, ערבבו ב-vortex והדגרימו למשך 30 דקות ב-20°C-. לאחר סנטריפוגציה למשך 15 דקות ב-18,000 ×g, שטפו את משקעי ה-DNA עם 100 µL של 70% cold ethanol כדי להסיר שאריות מלח, וסובבו למשך שש דקות ב-18,000 ×g. לאחר מכן, השליכו את האתנול וייבשו את המשקע ב-speed vac.

כעת השביחו מחדש כל משקע ב-100 µL של מים מזוקקים פעמיים שעברו אוטוקלאב. קבעו את ריכוז האוליגוניוקלאוטידים באמצעות ספקטרומטריה. כדי להכין דופלקסים של DNA המהמתילים חלקית, ערבבו תחילה ריכוזים מולריים שווים של הגדילים הבודדים המשלימים.

לאחר מכן, חממו את התערובות בבן-מארי בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות כדי לבצע דנטורציה (anil) של הגדילים. הניחו לדגימות להצטנן באיטיות לטמפרטורת החדר בתוך בן-מארי. ערבבו נפחים שווים של 81 µM חלבון CQ מטהר ו-81 µM DNA המתילי.

לאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. אחסנו ב-4 °C עד לשימוש. סננו תנאי התגבשות באמצעות מסכי מטריצה דלילה (sparse matrix screens) מסחריים. לאחר זיהוי עובדות התגבשות ראשוניות, בצעו אופטימיזציה של התנאים להצמחת גבישים באיכות דיפרקציה. השתמשו בחומר הגנה מפני קיפאון (cryoprotectant) עבור גבישי ה-CK DNA שהתקבלו.

הגדילו את כמות ה-PEG 400 בתמיסת ההתגבשות לריכוז סופי של 25% או הוסיפו 20% glycerol לתמיסת ההתגבשות. דגמו גבישים בודדים באמצעות לולאת ניילון (nylon loop flash). הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי.

כעת יש לבחון את גבול העקיפה של כל גביש ב-100 k. כדי לקבל את מבנה הגביש של המוטיב המקוצר של CK הקשור ל-Hemi methylated DNA, אנו מבצעים אופטימיזציה רצופית של שלושה פרמטרים ב-DNA: המרווח בין רצפי GATC של Hemi methylated, אורך הדופלקס והיעדרן או נוכחותן של בליטות 5'. מחקר זה משתמש בווריאנט DME של seek a עם מוטציה נקודית בדומיין הטרמינלי הקצית המונעת ליגציה נוספת, ובלינקר מקוצר המגביל את קישור ה-DNA למבנה טנדמי.

בבדיקות הזזה של ניידות חשמלית של DNA, חזרות GATC המופרדות אך ורק על ידי סיבוב אחד מעידות על כך שחלבון ה-CK המודגש נקשר באופן מועדף לחזרות GATC המופרדות על ידי תשעה עד 10 זוגות בסיסים. לפיכך, סריקות ראשוניות משתמשות בדופלקסים באורך של 23 עד 24 זוגות בסיסים המכילים שתי חזרות GATC הממתילת למחצה, המופרדות על ידי תשעה או 10 זוגות בסיסים.

שלושה דופלקסים הניבו גבישים בעלי צורה טובה. למרות ששום אחד מהגבישים לא הראה עקיפה ברזולוציה גבוהה, הנתונים הצביעו על כך שהפרדה של תשעה זוגות בסיסים מסוג A-G-A-T-C הייתה מועדפת לקריסטליזציה. באופן בלתי צפוי, הגברה של האינטראקציות של שלד החריץ על ידי הכללת דינוקלאוטיד CG בין שני אתרי ה-GATC לא שינתה את מגבלת העקיפה של הגבישים.

לעומת זאת, אופטימיזציה של אורך הבליטות (overhangs) שינתה באופן דרמטי את המגעים המולקולריים ואת מורפולוגיית הגביש. מבנה הגביש של חלבון CK זה הקשור לדופלקס DNA בעל מתילציה חלקית אישר כי הפנים החופשית של דופלקס ה-DNA אינה משתתפת במגעים גבישיים למרות הגודל היחסי של החלבון וה-DNA; מרבית האינטראקציות בין השותפים הסימטריים מתווכות על ידי אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-DNA. באופן מעניין, במקרה ספציפי זה, ההשפעה החיובית של בליטת דינוקלאוטיד בקצה ' 5 אינה נובעת מיצירת DNA פסאודו-רציף.

במקום זאת, קצה ה-5' של הגדיל המתילated בולט הרחק מצירים של ה-DNA ומקיים אינטראקציה עם מולקולת ה-CK הפרוקסימלית של הקומפלקס, מה שמסביר מדוע נדרשו שני נוקלאוטידים בדיוק כדי לשנות את האריזה הגבישית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי הדרכים לניקוי חלבונים ותכנון דופלקסים של DNA עבור גבישה של קומפלקסי חלבון-DNA. חשוב לזכור שלמרות שפרוטוקול זה תוכנן להגביש את קומפלקס ה-CK DNA, האופטימיזציה הרציונלית של אורך ה-DNA, הרצף והקצוות מספקת מסגרת כללית לתכנון דופלקסים של DNA עבור גבישה של קומפלקסי חלבון-DNA אחרים.