Name: Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: חקור מודל קרטיטיס סטרומה הרפטית חוזרת בעכברים ללימוד זיהומי HSV ומנגנוני מחלה בעין. שיטה זו מאפשרת הערכת שפיכת נגיפים וניטור התקדמות מחלה לאורך חמישה שבועות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר ג&#39;יי Pepose עזר ללמד את המודל אלינו. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות EY11885 מענקים (PMS), EY21247 (PMS) ומענק בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון למחלקת עיניים.

הערת טיפול בבעלי חיים: משככי כאבים אינם משמשים במודל זה כמו שהם אנטי דלקתיים ולכן הייתי פוסלים את המודל. 1. הכנת הווירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול HSV-1 בתאי Vero (80% confluent) באמצעות דילול התחלתי של 0.01 ריבוי של זיהום (בבקבוק T-150, כ 5 x 10 יחידות יוצרות פלאק 5) עבור 3-4 ימים עד שכל תאים מעוגלים למעלה והם משתחררים ממקומם בקלות על ידי להכות את הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה לצינורות סטריליים צנטריפוגות וצנטריפוגות ב Sorvall המקרא RT ב 4 ° C ו3500 סל&quot;ד במשך 15 דקות. לאחר הסרת supernatant (ראה 1.3), resuspend גלולה גדולה מכל צינור 50 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל בסך הכל תקשורת. Sonicate לדקות 1 בשתי התפרצויות 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת supernatant והכניס לתוך צינורות 50 מ&quot;ל סטריליים Oak Ridge וצנטריפוגות ב9000 סל&quot;ד, לשעה 1 ב 4 ° C בקמן צנטריפוגה J2-21. זה הוא לייצר גלולה נגיפית קטנה. השלך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב sonicate מ -1.2 שנינותח גלולה מ -1.3 וsonicate שוב למשך 45 שניות. צנטריפוגה בSorvall המקרא RT ב 1500 סל&quot;ד במשך 5 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant. זה מהווה את מניית וירוס הaliquoted ואוחסן ב -70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וירוס כייל נוגדנים על תאי Vero. אני בדרך כלל צלחת 10 0 ל10 -8 דילול (כל אחת להיות דילול 10-קיפול) 2x מ2 סטי דילול נפרדים. טיטרציה של וירוס מבוצעת על צלחות סטריליות 12-כן. </li></ol> 2. זיהום מאוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק כל עכבר עם 0.1 מ&quot;ל של חומר הרדמת משקל cocktail/20 גרם עכבר גוף (קטמין, 60 מ&quot;ג / ק&quot;ג + Xylazine 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג שדילול בHBSS). קוקטייל זה משמש כי זה אחד האמצעים הכי הבטוחים להרדמה, כאשר המינונים מתאימים משמשים ואת ההשפעות של תרופה זו הן מאוד קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עכברים מורדמים לשרוט את הקרנית של עין ימין עם מחט מד 30 באמצעות מיקרוסקופ לנתח על מנת להבטיח שהקרנית אינה מחוררת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל rece עכברived הזרקת intraperitoneal של 1 מ&quot;ל של נסיוב אדם נקווה (Sigma, Temecula, קליפורניה; תגובתיות אנטי HSV עם מינון אפקטיבי לנטרול נגיף 50% מ1:800) כדי להגן על קרניות מניזק במהלך הזיהום העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר העכברים עם או אטבי אוזניים או באוזן אגרוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל העכברים מוספרו; באמצעות pipettor μl 20, אנחנו מדביקים כל עין עם 10 6 pfu (5 μl). אנחנו מדביקים רק עין אחת, ובדרך כלל עין הימנית. גם אנחנו שמים 5 μl של HBSS לעין השנייה כדי לשמור אותו הלח בזמן שהם מורדמים. 5 ul הוא מספיק כדי לשמור על לחות של העיניים מאז ההליכים מתבצעים בפחות מ 10 דקות, ואת בעלי החיים במינון עם הרדמה בהתאם. זיהום הוא אשר על ידי ניגוב עכברים 3 ימים לאחר פגיעה עם מוליך כותנת סטרילי שהיה hydrated ב1 מ&quot;ל של תקשורת Vero. אז 100 μl מתווסף לתאי Vero גודלו בצלחות 48-כן. צלחות אלה ניטור יומיומי להשפעות cytopathic<html> (CPE). </li></ol> 3. אקטיבציה של עכברים מהחביון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מורדמים לפחות 5 שבועות לאחר הדבקה ראשונית. יש לציין שיש לנו מחדש עכברים עד הזיהום עיקרי הבא שנה אחת ולא נצפו הבדלים משמעותיים בתגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהרדים הם ממוקמים TM20 transilluminator Chromato-Vu, אשר פולט קרינה UV-B באורך גל של 302 ננומטר שיא כאלה שרק עין אחת חשופה לאור UV-B. כל עכבר חשוף לmJ של אור UV-B סנטימטר 250 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקטיבציה נקבעה על ידי ניגוב עיניים עם מוליך הכותנה סטרילי הממוקם ראשון ב1 מ&quot;ל של תקשורת ביום Vero 0 (לפני החשיפה לקרינת UV-B לשליטה לשופכים ספונטניים) ולאחר מכן בימים 1-7 לאחר קרינת UV-B. החומר הספוגי מוערך כמתואר ב2.5). למטליות שיש להם וירוס מדבק כמות הנגיף גחך על ידי assay פלאק הסטנדרטי באמצעות 12 גם צלחות. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. הערכה קלינית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מוערכים למחלת עיניים קלינית על ידי משקיף רעול פנים באמצעות מיקרוסקופ לנתח משקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אטימות קרניות הוא דורג בסולם של 0 עד 4, שבו 0 מציין stroma ברור, 1 מציין עננות סטרומה קלות, 2 עולים אטימות מתונות עם תכונות איריס מובחנות, 3 מציינים אטימות צפופות עם אובדן פרטי קשתית מוגדרת פרט שולי תלמידים, ו 4 מציין אטימות מוחלטות ללא נוף אחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neovascularization הוא דורג בסולם של 1 עד 8 על ידי חלוקת הקרנית ל 4 רבעים שווים וקביעת היקף כלי דם בכל אחד מהרבעים הללו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Blepharitis נמדד באופן הבא: 0, ללא נגעים; 1, עפעף מינימאלי נפיחות, 2, פריקים מתון נפיחות ופריכות עיניים; 3, נפיחות חמורה, נשירת השיער periocular מתון, ונגעים בעור, ו 4, נפיחות חמורות בעיניים עצומות מוקרם, אובדן חמור periocular שיער, ונגעים בעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדות לדלקת קרום המוח incluטוליפ גב כפוף, שיער פרוע, וליקויים נוירולוגיים ברורים. עכברים מורדמים כשהם מגלים סימנים מובהקים של דלקת קרום המוח. </li></ol> 5. נציג תוצאות הדגם החוזר אשר תואר לעיל פורסם לראשונה על ידי Shimeld, et al. 1-3. הם בדקו והמעבדה שלנו כבר משתמשת בגרסה שונה של מודל זה לפרסם כתבי יד רבים במהלך שנתי 4-15. המודל המשמש להגדרת התפקיד שציטוקינים מחזות אינטרפרון-γ במחלה החוזרת HSV-1 10. כפי שמוצג באיור 3, עכברים שחסרו IFNγ מחלה גרועה קרנית מוצגת מאשר עכברים פראיים מסוג 14. הוא גם שמש בהצלחה להגדיר את הערך הטיפולי של כמה חיסון שונה בונה 6,10,11. שים לב כי במקרה אחד החיסון נבדק עבד היטב מונע אבל לא להוכיח להיות טיפולי יעיל 6. עם זאת,כאשר חיסון נגיפי שכפול פסול נבדק, זה לא היה יעיל רק מונע, אבל היה גם מאוד יעיל טיפולי 10,11, ראה איור 5 בהתייחסות 10. לאחרונה יש לנו להשתמש במודל זה כדי לקבוע אם הבדלים בין מינים היו להבחין בעכברים שעברו HSK החוזר. כאיור 1 מדגים, C57BL / 6 עכברי זכרים להציג אטימות באופן משמעותי פחות מאשר לעשות קרנית C57BL נקבה / 6 עכברים. כמו כן, כאשר neovascularization קרנית הוערך, עכברי זכרים הפגינו צמיחת כולים משמעותיים פחות חדשה בקרנית מאשר נקבות עכברים (איור 2). אנו בודקים כעת אם זה פנוטיפ הוא זן ספציפי על ידי ביצוע ניתוח דומה בזנים אחרים של עכברים. אנו גם לקבוע אם ההבדל הוא עקב המחסור בטסטוסטרון או הנוכחות של אסטרוגן. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig1.jpg" /> איור 1. מחלות קרניות בC57BL זכר ונקבה / 6 זני עכבר לאחר הפעלה מחדש מושרה UV-B. עכברים נגועים סמוי היו מושרים על מנת להפעיל מחדש עם קרינת UV-B ועכברים היו במעקב לאטימות קרניות במשך 35 ימים. המספרים של עכברים המשמשים למחקרים אלה היו כדלקמן: זכרים, n = 15; נקבות, n = 15. תוצאות מצביעות ± SEM ממוצע. * הייתה מחלה משמעותית יותר וירוס מושרה בעכברי C57BL / 6 מין נקבה, בימים 14-35 (P = 0.001-0.01). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig2.jpg" /> איור 2. מחלות קרניות בC57BL זכר ונקבה / 6 זני עכבר לאחר הפעלה מחדש מושרה UV-B. עכברים נגועים סמוי היו מושרים על מנת להפעיל מחדש עם קרינת UV-B ועכברים היו במעקב במשך neovascularization קרנית במשך 35 ימים. המספרים של עכברים המשמשים למחקרים אלה היו כדלקמן: זכרים, n= 15; נקבות, n = 15. תוצאות מצביעות ± SEM ממוצע. * הייתה מחלה משמעותית יותר וירוס מושרה בעכברי C57BL / 6 מין נקבה, בימים 14-28 (P = 0.001-0.01).

<ol><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+model+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+latent+infection+and+induction+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+protects+the+mouse+eye+from+damage+after+herpes+simplex+virus+infection+by+limiting+spread+of+virus+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system.</a> J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).</li>
<li>Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+model+of+recurrent+herpes+simplex+viral+keratitis+induced+by+ultraviolet+B+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).</li>
<li>Keadle, T. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+ameliorates+corneal+disease+in+a+mouse+model+of+recurrent+herpetic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis.</a> Microbial Path. 38, 13-21 (2005).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+recombinant+glycoprotein+D+subunit+vaccine+on+the+development+of+primary+and+recurrent+ocular+infection+with+herpes+simplex+virus+type+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inf.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice.</a> J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+IL-1+and+TNF-a+are+required+for+recurrent+herpetic+keratitis+in+NIH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).</li>
<li>Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+cytokine+expression+in+a+murine+model+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Immunol.+Inflam%22%5BJournal%5D)">Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+and+CD8%2B+cells+are+key+participants+in+the+development+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> Microbial Path. 32, 255-262 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+immunization+with+a+virion+host+shutoff-defective%2C+replication-incompetent+herpes+simplex+virus+type+1+strain+limits+recurrent+herpetic+ocular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection.</a> J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+vaccination+with+vhs%28-%29+herpes+simplex+virus+reduces+the+severity+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+aminoguanidine+on+primary+and+recurrent+ocular+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection.</a> Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).</li>
<li>Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL3+protects+mice+from+corneal+pathology+during+recurrent+HSV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection.</a> Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).</li>
<li>Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+gamma+is+not+required+for+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Virology. 380, 46-51 (2008).</li>
<li>Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Interferon-gamma+by+an+adenovirus+vector+blocks+herpes+simplex+virus+Type+1+reactivation+in+vitro+and+in+vivo+independent+of+RNase+L+and+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways.</a> J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הדגם החוזר של קרנית סטרומה herpetic (HSK) המתואר כאן מאפשר לחוקר ללמוד HSK האנושי במודל שהוא מתאים יותר למה שהוא ציין במהלך מחלה האנושית. לכן, העוצמות של המודל הן כי מחלה מתרחשת בהקשר של מערכת חיסון שיש כבר על ידי גירוי במחלה ראשונית. מאז העכברים האלה כבר יש תגובה חיסונית לHSV-1, את הגורמים שהפעלה מחדש של תגובה חיסונית שעשויים שונים מאלה שיצרו אותה במקור. לכן, התערבות טיפולית כדי למנוע HSK הראשוני לא תמיד מובילה לשיפור של HSK החוזר, אשר יש לנו שמוצגות בפרסומים שונים בעת הערכה הראש...

<table><tbody ><tr ><td >DMEM</td ><td >Sigma</td ><td >D5796</td ><td></td ></tr><tr ><td >סרום עוברי בקר (Fetal Bovine Serum)</td ><td >Atlanta Biologicals</td ><td >S11150</td ><td></td ></tr><tr ><td >סרום אנושי</td ><td >Sigma</td ><td >S7023</td ><td></td ></tr><tr ><td >L-Glutamine</td ><td >Cellgro</td ><td >25-005-C1</td ><td></td ></tr><tr ><td >פניצילין/סטרפטומייצין (Pen/ Strep)</td ><td >Sigma</td ><td >P4333</td ><td></td ></tr><tr ><td >Fungizone</td ><td >Invitrogen</td ><td >15290018</td ><td></td ></tr><tr ><td >צנטריפוגה</td ><td >Sorvall</td ><td >Legend RT</td ><td></td ></tr><tr ><td >צנטריפוגה</td ><td >Beckman</td ><td >52-21</td ><td></td ></tr><tr ><td >טרנס-אילימינטור (Transilluminator)</td ><td >UVP</td ><td >95-0452-02</td ><td></td ></tr><tr ><td >סוניקטור (Sonicator)</td ><td >Branson</td ><td >Sonifier 450</td ><td></td ></tr><tr ><td >מבחנות Oak Ridge</td ><td >Nalgene</td ><td >Z 720410</td ><td></td ></tr><tr ><td >בקבוקונים- 7150</td ><td >Corning</td ><td >430823</td ><td></td ></tr><tr ><td >פלטות- 12 בארות</td ><td >Corning</td ><td >CLS 3513</td ><td></td ></tr><tr ><td >פלטות- 48 בארות</td ><td >Corning</td ><td >CLS 3548</td ><td></td ></tr><tr ><td >מבחנות קוניות סטריליות- 30 ml</td ><td >Corning</td ><td >CLS 430828</td ><td></td ></tr><tr ><td >מקלון סטרילי עם קצה צמר</td ><td >Fisher</td ><td >23-400-125</td ><td></td ></tr><tr ><td >מחטים 30G</td ><td >Becton-Dickinson</td ><td >305106</td ><td></td ></tr><tr ><td >מחטים 25G</td ><td >BD</td ><td >305122</td ><td></td ></tr><tr ><td >מזרק 10 ml</td ><td >BD</td ><td >309602</td ><td></td ></tr><tr ><td >מזרק 10 ml</td ><td >BD</td ><td >309604</td ><td></td ></tr></tbody></table>

keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד hsk אנוש

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

מחל herpetic עין, קרנית סטרומה herpetic כינה (HSK), היא זיהום שעלול להיות מסנוור של הקרנית שגורמת ליותר מ -300,000 ביקורים קליניים בכל שנה לטיפול. בין 1 ל 2 אחוזים מחולים עם מחלה קלינית חווים אובדן הראייה של הקרנית הנגועה. הרוב המכריע של מקרים אלה הם התוצאה של הפעלה מחדש של זיהום סמוי על ידי הרפס סימפלקס סוג אני וירוס ולא כתוצאה ממחלה חריפה. מעניין, הזיהום החריף הוא המודל המשמש לרוב ללימודי מחלה זו. עם זאת, התחושה הייתה שמודל חוזר של HSK יהיה יותר משקף את מה שמתרחש במהלך מחלה קלינית. את המודלים של בעלי החיים חוזרים לHSK העסיקו שני ארנבות ועכברים. היתרון של ארנבים הוא שהם חווים מחדש מהשהית העדר כל גירוי ידוע. עם זאת, קשה לחקור את התפקיד שהרבה גורמים אימונולוגיים לשחק בHSK החוזר, משום שמודל הארנב אין immunמשאבי ological והגנטיים שיש עכבר. אנחנו בחרנו להשתמש במודל העכבר לHSK חוזר כי יש לו את היתרון של להיות שם משאבים רבים זמינים וגם אנחנו יודעים מתי נתרחש מחדש בגלל מחדש נגרמים עקב חשיפה לקרינת UV-B. עד כה, מודל זה אפשר מעבדות אלה משתמשים בו כדי לקבוע מספר גורמים חיסוניים שחשובים למחלה זו. זה גם אפשר לנו לבחון גם ריפוי ויעילותו.

רוב המחקרים של מחלת קרנית herpetic משתמשים במודל זיהום עיקרי. עם זאת, זיהום ראשוני עם HSV-1 אינו בדרך כלל להוביל למחלות אנושיות. כאן אנו מתארים מודל חוזר של מחלה בקרנית herpetic, אשר באופן הדוק יותר מחקה מחלות אנושיות.

Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

מחלה הרפטית של העין, המכונה קרטיטיס סטרומלית הרפטית (HSK), היא זיהום של קרנית העלול לגרום לעיוורון, הגורם למעל 300,000 מקרים קליניים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור זיהום חוזר של נגיף ההרפס הסימפלקס (herpes simplex virus או HSV). דבר זה מושג תחילה על ידי הדבקת עכברים באופן שיגרום להם להדבקה חבויה (latent infection) ללא נזק לקרנית. לאחר שהחבויות הוקמה באופן מלא, השלב הבא הוא להפעיל מחדש את הנגיף באמצעות חשיפה לאור UVB; בשלב הסופי, נאסף דגימת דמעות לצורך זיהוי של שחרור נגיפי, ולאחר מכן העכבר נצפה במשך חמישה שבועות לפחות כדי לעקוב אחר המחלה.בסופו של דבר, ניתן להעריך את חומרת המחלה המתרחשת בעכברים באמצעות דירוג מחלה של קרטיטיס סטרומלית הרפטית. זוהי מחלה המשפיעה על אנשים רבים ברחבי העולם. מחלה ספציפית זו היא אחת הסיבות המובילות לעיוורון זיהומי.יש לנו מודל שאנו משתמשים בו בעכברים כדי לדמות את המחלה הספציפית הזו. קיימים מודלים אחרים שיכולים למעשה לדמות מחלה זו, אך אנו סבורים שזהו הייצוג הטוב ביותר של המחלה הספציפית הזו. ברצוני להקדיש מספר דקות היום ולהכיר את האנשים שיופיעו בסרטון זה.זוהי קלואי, שעובדת איתי במהלך המספר חודשים האחרונים. וזהו ניפו, סטודנט קיץ שעובד במעבדה. התחילו את הניסוי על ידי גידול של HSV-1 על תאי Vero למשך שלושה עד ארבעה ימים עד להגעה ל-80% confluence בבקבוק T150.עד לשלב זה התאים יהיו מעוגלים וניתן יהיה להסירם בקלות על ידי הקשה על הבקבוק. העבירו את תרחיף התאים למבחנות קוניות סטריליות של 50 milliliter, ולאחר מכן סובבו את התאים במשך 15 דקות. בצעו סבוב ב-1,510 ×g בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius בצנטריפוגת שולחנית.בשלב הבא, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנות Oak Ridge סטריליות בנפח 50 milliliter, ולאחר מכן חלקו סך של חמישה milliliters של מצע בין כל אחת מהמבחנות הקוניות לצורך ריסוספנזיה (Resus). תלו את המשקעים הגדולים, ולאחר מכן בצעו סוניקציה למשקעים שהורחפו למשך דקה אחת, בשני פרקים של 32nd. לאחר צנטריפוגציה של הנוזל העליון בצנטריפוגה רצפתית מהירה, ייווצר משקע ויראלי קטן.לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), יש לשלב את המשקעים עם כדורי נגיף קטנים ולבצע סוניקציה פעם נוספת למשך 45 שניות. כעת, יש לצנטריפוג שוב את תמיסת התאים והנגיפים שעברו סוניקציה בצנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות ב-280 ×g ובטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן לחלק את הנוזל העליון למנות לאחסון כמלאי נגיפים בטמפרטורה של 70°C- לצורך בדיקת טיטר (titer plate).דילולים עשריים של נגיף מתוך עליון מאגר הנגיף, מ-10⁰ ועד 10⁻⁸, פעמיים משתי סדרות דילול נפרדות של תאי Vero בפלטות סטריליות של 12 בארים. התחל את הליך ההדבקה על ידי הרדמת העכבר. העכבר חייב להישאר מורדם לחלוטין למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר לספיגת הנגיף לפני שהעכבר יתעורר.לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, השתמש במחט בכיל 30 כדי לשרוט את קרנית העין הימנית. כעת, סמן את בעל החיים באמצעות ניקוב האוזן. לאחר מכן, הזרק לעכבר 1 mL של סרום אנושי מאוחד (pooled human serum) כדי להגן על הקרניות מפני נזק במהלך הזיהום הראשוני.לאחר מכן, השתמש בפיפט של 20 µL כדי להדביק את העין שנשרטה ב-10⁶ plaque forming units, והנח 5 µL של HBSS בעין השנייה כדי לשמור עליה לחה בזמן שהבעל חיים תחת הרדמה לצורך אישור ההדבקה. הרטב מקל צמר sterile באמצעות 1 mL של Vero media. שלושה ימים לאחר ההדבקה, דגם את העין המודבקת בעזרת המקל, ולאחר מכן העבר 100 µL מהמדיום שנדגם לתאי Vero הגדלו בלוחות של 48 בארות לפחות חמישה שבועות לאחר ההדבקה הראשונית.בצעו סבב (swab) לעין המזוהמת של עכבר הרדום כפי שהודגם זה עתה. סמנו את ביצוע הסבב כיום אפס על מכסה פלטת 48 הבארים כדי לשלוט על מצמוצים ספונטניים. לאחר מכן, הניחו את העכבר במכשיר טרנסלומינטור (transluminator) המסוגל להפיץ UVB באורך גל שיא של 302 nanometers, באופן שבו עין אחת בלבד תיחשף לאור ה-UVB, וחשפו את העכבר ל-250 millijoules של אור UVB לסנטימטר רבוע.לאחר מכן, בצעו דגימה באמצעות מטבון מהעין מדי יום, מהיום הראשון ועד היום השביעי. עבור אותן דגימות המכילות נגיף זיהומי לאחר הקרנת UVB, קבעו את כמות הנגיף באמצעות בדיקת פלאק (plaque assay) סטנדרטית בלוחיות של 12 בארות כדי להעריך את העכברים להיבטים של מחלה קלינית בעיניים. מקמו את העכבר תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (binocular dissecting microscope).עכירות קרנית מדורגת על סולם של אפס עד ארבע, כאשר אפס מעיד על סטרומה שקופה, אחת מעידה על עכירות סטרומלית קלה, שתיים מעידות על עכירות מתונה שבה הקשתית עדיין ניתנת להבחנה, שלוש מעידות על עכירות צפופה עם אובדן של פרטי הקשתית מלבד שולי האישון, וארבע מעידות על עכירות מוחלטת ללא יכולת ראייה אחורית.ניאובסקולריזציה (צמיחה של כלי דם חדשים) מדורגת על סולם של אחת עד שמונה על ידי חלוקת הקרנית לארבעה רבעים שווים וקביעת היקף הווסקולריזציה בכל אחד מהרבעים הללו. באיור ראשון זה, עכברים עם זיהום חבוי הועמדו לרבב באמצעות הקרנה ב-UVB, ולאחר מכן העכברים נוטרו לבדיקת עכירות של הקרנית במשך 35 ימים. נתונים אלו מדגימים כי עכברי C 57 black six זכרים מראים עכירות של הקרנייה נמוכה משמעותית מזו של עכברי C 57 black six נקבות, שכן נצפתה מחלה משמעותית יותר המושרה על ידי הנגיף בעכברי C 57 black six נקבות בימים 14 עד 35.באופן דומה, כאשר נבדקה נאווסקולריזציה קרנית תחת אותם תנאים ניסיוניים, עכברים זכרים הפגינו פחות צמיחה של כלי דם חדשים בקרנית מאשר עכברים נקבות, ושוב, קיימת מחלה משמעותית יותר המושרה על ידי הנגיף בעכברי C 57 black six נקבות בימים 14 עד 28. בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו להרדימ את העכברים באופן מלא כך שיהיו ישנים למשך 20 עד 30 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שרכשתם הבנה כיצד להשתמש במודל העכבר של קראטיטיס סטרומלית חוזרת כדי לחקור מחלה אנושית זו.

recurrent-herpetic-stromal-keratitis-mice-model-for-studying-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במאמר זה יתאר וידאו השימוש...

דגם גופיים Organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת מודל עכבר כפול אנושי עם מערכת חיסון אנושית ותאי כבד. היא כרוכה בהשתלת תאי כבד אנושיים ותאי גזע ואב המטופויטיים בעכבר מהונדס מדוכאי חיסון באמצעות הזרקה תוך ספלנית, מה שמוביל לקליטת תאי כבד והתפתחות תאי חיסון אנושיים.

פיתוח מודל עכבר אנושי עם תאי כבד אנושיים ותאי חיסון

לחץ תוך עיני מוגבר כרוני הנגרם באמצעות טיפול לייזר של meshwork trabecular בעיני עכבר. לחץ התוך עיני (IOP) הוא גבוה למשך מספר חודשים לאחר טיפול לייזר. הירידה של חדות ראייה ורגישות לקונטרסט של חיות ניסוי מנוטרת באמצעות בדיקת optomotor.

מודל עכבר לייזר המושרה של לחץ תוך עיני מוגבר כרוני לאפיון פגמים חזותיים

הקמנו ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו לצורך זיהוי של גנום נגיף ה-DNA מתמשך בתוך סעיפי רקמות של מודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מאפשר לימוד תהליך זיהום על ידי codetection של הגנום הנגיפי, מוצרי RNA שלו, וחלבונים נגיפיים או סלולריים בתוך תאים בודדים.

איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

העור הוא רקמת מטרה אחת של הפתוגן האנושי הרפס סימפלקס וירוס סוג 1 (HSV-1). כדי לחקור את מסלול הפלישה של HSV-1 לרקמה, הקמנו מודל זיהום ex vivo של יריעות אפידרמיס של עכברים המייצגות את שכבת העור החיצונית ביותר.

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת עכברים humanized (hu-NSG) באמצעות intrahepatic הזרקה של תאי גזע hematopoietic אנושי לתוך ממוזגים קרינה עכברים NSG neonatal. העכבר hu-NSG חשופה הידבקות ב- HIV טיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), משמש כמודל pathophysiological מתאימים לחקירות שכפול וההשהיה HIV.

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγnull מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

המתואר כאן הם שלוש גישות ניסיוני ללמוד את הדינמיקה של זיהום HIV בעכברים הומניזציה. הראשון מתיר את המחקר של אירועי זיהום כרונית, בעוד שני האחרונים מאפשר לימוד של אירועים חריפים לאחר זיהום ראשוני או נגיפי ההפעלה מראש.

כרונית, חריפה, ו-HIV ההפעלה מופעל מודלים העכבר חיסוני הומניזציה

מודל החיסונים הוא כלי רב ערך לאפיון תגובות נוירודלקתיות המושרה בvivo. בפרט, היא מספקת הערכה ברורה של קינטיקה ויראלית ותהליכים immunopathological משויכים המופעלים במערכת העצבים ההיקפית.

עכבר כרית הרגליים מודל לחקר ויראלי המושרה תגובות נוירודלקתיות

אנו מתארים את השימוש בקרנית חזירית כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של תרופות ניסיוניות.

רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי

רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD). CHS מבוסס על רגישות עם hapten תגובתי על ידי צביעת העור המגולח של החזה והבטן, עם אתגר עור אוזן לאחר מכן עם hapten מדולל, הגורם לתגובת נפיחות כי הוא מוערך בדרכים שונות.

צור רגישות יתר כמודל מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי

פרוטוקול זה יסביר כיצד לבסס מודל עכברי צלקות היפרטרופיות המגביר את איתות הטרנסדוקציה המכנית כדי לדמות צלקות דמויות אדם. שיטה זו כוללת הגברת מתח מכני על פני חתך ריפוי בעכבר ושימוש במכשיר מיוחד ליצירת רקמת צלקת מוגזמת הניתנת לשחזור לצורך ניתוחים היסטולוגיים וביואינפורמטיים מפורטים.

מודל עכבר של צלקות היפרטרופיות דמויות אדם המונעות על ידי מכניקה

חקור מודל קרטיטיס סטרומה הרפטית חוזרת בעכברים ללימוד זיהומי HSV ומנגנוני מחלה בעין. שיטה זו מאפשרת הערכת שפיכת נגיפים וניטור התקדמות מחלה לאורך חמישה שבועות.

Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

גלה סרטונים נוספים