Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור זיהום חוזר של נגיף ההרפס הסימפלקס (herpes simplex virus או HSV). דבר זה מושג תחילה על ידי הדבקת עכברים באופן שיגרום להם להדבקה חבויה (latent infection) ללא נזק לקרנית. לאחר שהחבויות הוקמה באופן מלא, השלב הבא הוא להפעיל מחדש את הנגיף באמצעות חשיפה לאור UVB; בשלב הסופי, נאסף דגימת דמעות לצורך זיהוי של שחרור נגיפי, ולאחר מכן העכבר נצפה במשך חמישה שבועות לפחות כדי לעקוב אחר המחלה.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את חומרת המחלה המתרחשת בעכברים באמצעות דירוג מחלה של קרטיטיס סטרומלית הרפטית. זוהי מחלה המשפיעה על אנשים רבים ברחבי העולם. מחלה ספציפית זו היא אחת הסיבות המובילות לעיוורון זיהומי.

יש לנו מודל שאנו משתמשים בו בעכברים כדי לדמות את המחלה הספציפית הזו. קיימים מודלים אחרים שיכולים למעשה לדמות מחלה זו, אך אנו סבורים שזהו הייצוג הטוב ביותר של המחלה הספציפית הזו. ברצוני להקדיש מספר דקות היום ולהכיר את האנשים שיופיעו בסרטון זה.

זוהי קלואי, שעובדת איתי במהלך המספר חודשים האחרונים. וזהו ניפו, סטודנט קיץ שעובד במעבדה. התחילו את הניסוי על ידי גידול של HSV-1 על תאי Vero למשך שלושה עד ארבעה ימים עד להגעה ל-80% confluence בבקבוק T150.

עד לשלב זה התאים יהיו מעוגלים וניתן יהיה להסירם בקלות על ידי הקשה על הבקבוק. העבירו את תרחיף התאים למבחנות קוניות סטריליות של 50 milliliter, ולאחר מכן סובבו את התאים במשך 15 דקות. בצעו סבוב ב-1,510 ×g בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius בצנטריפוגת שולחנית.

בשלב הבא, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנות Oak Ridge סטריליות בנפח 50 milliliter, ולאחר מכן חלקו סך של חמישה milliliters של מצע בין כל אחת מהמבחנות הקוניות לצורך ריסוספנזיה (Resus). תלו את המשקעים הגדולים, ולאחר מכן בצעו סוניקציה למשקעים שהורחפו למשך דקה אחת, בשני פרקים של 32nd. לאחר צנטריפוגציה של הנוזל העליון בצנטריפוגה רצפתית מהירה, ייווצר משקע ויראלי קטן.

לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), יש לשלב את המשקעים עם כדורי נגיף קטנים ולבצע סוניקציה פעם נוספת למשך 45 שניות. כעת, יש לצנטריפוג שוב את תמיסת התאים והנגיפים שעברו סוניקציה בצנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות ב-280 ×g ובטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן לחלק את הנוזל העליון למנות לאחסון כמלאי נגיפים בטמפרטורה של 70°C- לצורך בדיקת טיטר (titer plate).

דילולים עשריים של נגיף מתוך עליון מאגר הנגיף, מ-10⁰ ועד 10⁻⁸, פעמיים משתי סדרות דילול נפרדות של תאי Vero בפלטות סטריליות של 12 בארים. התחל את הליך ההדבקה על ידי הרדמת העכבר. העכבר חייב להישאר מורדם לחלוטין למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר לספיגת הנגיף לפני שהעכבר יתעורר.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, השתמש במחט בכיל 30 כדי לשרוט את קרנית העין הימנית. כעת, סמן את בעל החיים באמצעות ניקוב האוזן. לאחר מכן, הזרק לעכבר 1 mL של סרום אנושי מאוחד (pooled human serum) כדי להגן על הקרניות מפני נזק במהלך הזיהום הראשוני.

לאחר מכן, השתמש בפיפט של 20 µL כדי להדביק את העין שנשרטה ב-10⁶ plaque forming units, והנח 5 µL של HBSS בעין השנייה כדי לשמור עליה לחה בזמן שהבעל חיים תחת הרדמה לצורך אישור ההדבקה. הרטב מקל צמר sterile באמצעות 1 mL של Vero media. שלושה ימים לאחר ההדבקה, דגם את העין המודבקת בעזרת המקל, ולאחר מכן העבר 100 µL מהמדיום שנדגם לתאי Vero הגדלו בלוחות של 48 בארות לפחות חמישה שבועות לאחר ההדבקה הראשונית.

בצעו סבב (swab) לעין המזוהמת של עכבר הרדום כפי שהודגם זה עתה. סמנו את ביצוע הסבב כיום אפס על מכסה פלטת 48 הבארים כדי לשלוט על מצמוצים ספונטניים. לאחר מכן, הניחו את העכבר במכשיר טרנסלומינטור (transluminator) המסוגל להפיץ UVB באורך גל שיא של 302 nanometers, באופן שבו עין אחת בלבד תיחשף לאור ה-UVB, וחשפו את העכבר ל-250 millijoules של אור UVB לסנטימטר רבוע.

לאחר מכן, בצעו דגימה באמצעות מטבון מהעין מדי יום, מהיום הראשון ועד היום השביעי. עבור אותן דגימות המכילות נגיף זיהומי לאחר הקרנת UVB, קבעו את כמות הנגיף באמצעות בדיקת פלאק (plaque assay) סטנדרטית בלוחיות של 12 בארות כדי להעריך את העכברים להיבטים של מחלה קלינית בעיניים. מקמו את העכבר תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (binocular dissecting microscope).

עכירות קרנית מדורגת על סולם של אפס עד ארבע, כאשר אפס מעיד על סטרומה שקופה, אחת מעידה על עכירות סטרומלית קלה, שתיים מעידות על עכירות מתונה שבה הקשתית עדיין ניתנת להבחנה, שלוש מעידות על עכירות צפופה עם אובדן של פרטי הקשתית מלבד שולי האישון, וארבע מעידות על עכירות מוחלטת ללא יכולת ראייה אחורית.

ניאובסקולריזציה (צמיחה של כלי דם חדשים) מדורגת על סולם של אחת עד שמונה על ידי חלוקת הקרנית לארבעה רבעים שווים וקביעת היקף הווסקולריזציה בכל אחד מהרבעים הללו. באיור ראשון זה, עכברים עם זיהום חבוי הועמדו לרבב באמצעות הקרנה ב-UVB, ולאחר מכן העכברים נוטרו לבדיקת עכירות של הקרנית במשך 35 ימים. נתונים אלו מדגימים כי עכברי C 57 black six זכרים מראים עכירות של הקרנייה נמוכה משמעותית מזו של עכברי C 57 black six נקבות, שכן נצפתה מחלה משמעותית יותר המושרה על ידי הנגיף בעכברי C 57 black six נקבות בימים 14 עד 35.

באופן דומה, כאשר נבדקה נאווסקולריזציה קרנית תחת אותם תנאים ניסיוניים, עכברים זכרים הפגינו פחות צמיחה של כלי דם חדשים בקרנית מאשר עכברים נקבות, ושוב, קיימת מחלה משמעותית יותר המושרה על ידי הנגיף בעכברי C 57 black six נקבות בימים 14 עד 28. בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו להרדימ את העכברים באופן מלא כך שיהיו ישנים למשך 20 עד 30 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שרכשתם הבנה כיצד להשתמש במודל העכבר של קראטיטיס סטרומלית חוזרת כדי לחקור מחלה אנושית זו.