Name: הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: למד שיטת הנדסת רקמות של המעי הקטן בעכבר באמצעות גישת יחידות אורגנואיד על פיגום. פרוטוקול זה מספק בסיס ליצירת רקמות מעי מונדסות ותורם לתחום הרפואה הרגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

טרייסי ג Grikscheit, אריק ר Barthel, ופרדריק ג&#39;סאלה נתמכת על ידי המכון בקליפורניה הרגנרציה רפואה (CIRM), מספרי המענק RN2-00946-1 (TCG) וTG2-01168 (ארב, מדרשה). אליסון ל שפר הוא חברה של אוניברסיטת מנתחי Ethicon חוקר. Yashuhiro Torashima ממומן על ידי המלגה של בית החולים לילדים בלוס אנג&#39;לס סבן מכון מחקר פיתוח הקריירה.

1. הכנת יחידות Organoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשירים מתאימים לנתיחת עכבר (מספריים ומלקחיים) צריכים להיות מעוקרים על ידי חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומני להרדים את עכבר התורם על פי פרוטוקולי IACUC מקומיים. ודא כי בעל החיים מתים לפני שימשיכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו אמצע כדי לקבל גישה לחלל הצפק. שולי עור יכולים להשתקף כנדרשים כדי לשפר את החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסח את המעי הדק ומחלק אותו רק דיסטלי לרצועות של Treitz. הפרד את המעי הדק מלפדרו באמצעות נתיחה בוטה חדה ועדינה. זהה את צומת ileocecal ולחלק את 5 מ&quot;מ המעי הדק הפרוקסימלי לזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, פתח את מעי אורכו לאורך גבול antimesenteric בצלחת פטרי עם 10 מ&quot;ל 4 מעלות צלזיוס, מלוח &quot;סטרילי הנקס נאגר (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X אנטיביוטיקה נגד פטריות (אנטי אנטי, Invitrogen) פתרון. נקה את הצואה מהמעי פתח עםתסיסה עדינה לאחר מכן להעביר מעי נפתח לצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל עם 10 מ&quot;ל של 4 מעלות צלזיוס, HBSS סטריליים / 1X אנטי אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המעי נפתח שלוש פעמים ב10 מ&quot;ל של 4 מעלות צלזיוס, HBSS / 1X סטריליים אנטי אנטי במבחנה. כל שטיפה ניתן לבצע עם רעד קל של צינור המ&quot;ל 15 למשך 30 שניות. אחרי שלחץ, רקמת המעי שוקע לתחתית של התחתית. השלך חומרים צפים, שהיא פסולת mesenchymal. הסר את פתרון הכביסה בזהירות עם pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר במעי השטוף בצלחת פטרי עם 10 מ&quot;ל של 4 מעלות צלזיוס, HBSS סטריליים / 1X אנטי אנטי פחות מ 1 מ&quot;מ ריבועים באמצעות מספריים. אסוף את החומר הטחון עם pipet אוטומטי ולמקם אותו לתוך מבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב 500 סל&quot;ד לדקות 8. בטל supernatant, המכיל שומן וmesenchyme. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את החומר טחון, שטוף עם 10 מ&quot;ל של HBSS סטריליים / תוספת אנטי אנטי 1X 0.125 מ&quot;ג / המ&quot;ל dispase (Invitrogen) ו800 יחידות / מ &#39;סוג l collagenase 1 (וורטינגטון, לייקווד ניו ג&#39;רזי). כדי להכין 40 מ&quot;ל של תמיסת העיכול, לשקול את 5 מ&quot;ג dispase, 142 מ&quot;ג של collagenase, ולהוסיף עד HBSS סטריליים לנפח של 40 מ&quot;ל. הכן את הפתרון זה עתה את כל יחידות דיור organoid זמן מוכנות, ולשמור ב 4 ° C עד מוכן לשימוש. הוסף פתרון העיכול ישירות לגלולה מצעד 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת מבחנה המכילה את החומר טחון, שטוף עם פתרון העיכול על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזר את המבחנה ועוד לשבש את רקמת עיכול על ידי טחינה דקה עם pipet מ&quot;ל 10. חזור על בין 20 ל 50 פעמים עד שמראה אחיד מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המבחנה למשך 5 דקות ב 800 סל&quot;ד. בטל supernatant, המכיל תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את תגובת העיכול עם 10 מ&quot;ל של 4 מעלות צלזיוס שינוי הנשר הבינוני של סטרילי Dulbecco (DMEM, Invitrogen) בתוספת 10% בסרום, v / v חום מומת עוברי שור (HI-FBS, Invitrogen). Resuspend פלהt ולנער את הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המבחנה למשך 5 דקות ב 800 סל&quot;ד. הסר את supernatant זהירות עם pipet אוטומטי עד הטיפין האחרונות. השתמש pipet פלסטיק חד פעמי לטיפין האחרונות, כדי למנוע resuspending הגלולה. </li></ol> 2. טעינה של Polyglycolic חומצת הפיגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופס, פיגומי 2-מ&quot;מ ארוך 5-מ&quot;מ קוטר חיצוני גליליים מחומצת polyglycolic הארוגה (עובי 2-מ&quot;מ גיליון, 60 מ&quot;ג צפיפות סנטימטר-3 בתפזורת; נקבוביים%&gt; 95, סיבי קונקורדיה, RI קובנטרי) כפי שמתוארת במס. 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצץ 2 מ&quot;מ הדיסטלי של pipet microliter הפנוי 1000 קצה עם מספריים מוכנים עם אתנול 70% במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הפיגום לתוך צלחת תרבות 4-כן. טען את יחידות organoid גבי הפיגום עם pipet microliter 1000, קודם ללום ואז על פני השטח החיצוניים. השתמש במלקחיים כדי להבטיח ציפוי של לומן. אל תפגעו או לפרוץ צורה הגלילית של הפולימר. </li&gt; </ol> 3. השתלה לעכבר מארח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכבר המארח syngeneic באותו הרקע כתורם אם הוא זמין. אחרת, להעסיק סוכרתי nonobese immunocompromised / חמור בשילוב בעלי חי immunodeficient או NOD / SCID (ג&#39;קסון מעבדות, סקרמנטו קליפורניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להרדמה כללית עם isoflurane. גילוח, הכנה ולעטוף בבטנו של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו אמצע 5 מ&quot;מ כדי לזכות בכניסה לחלל הצפק. זיהוי וכסח omentum יותר בזהירות. הנח את הפולימר הטעון על גבי omentum ולעטוף אותו ברקמות. אל תקרע omentum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הפולימר לomentum עם תפר 5-0 monocryl. מחזיר בעדינות את omentum עם הפולימר העטוף בתנוחה אנטומית שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את החתך בבטן בשכבות באמצעות תפרי vicryl 4-0. הפעל את סגירת השרירים ולדאוג שלא לפגוע באיברים הפנימיים בבטן מתחת לחתך. השתמש תפרים לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאבים לאחר ניתוח לנהל עם 2 מ&quot;ג / קילו ketoprofen (Ketofen, בריאות בעלי חי Fort Dodge) במים סטריליים כwheal סמוך לחתך תת עורי. בעלי חיים צריכים להיות מוערכים מדי יום ואם בעל החיים הוא מפגינים סימנים של כאב או מצוקה, מנה נוספת של ketoprofen יכולה להינתן ביום ניתוח לאחר 2. ביום שלאחר הניתוח השלישי, בעלי החיים צריכים להיות התאוששו לחלוטין ללא עדות לכאב או מצוקה. אם כאב או מצוקה ממשיך ביום ניתוח לאחר 3, זה נחשב נורמלי ויש להתייחס בהתאם לפרוטוקולי מתקן טיפול IACUC ובעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העכבר כדי להתאושש ומעי רקמה המהונדס לגדול במשך ארבעה שבועות. תן גישה כרצונך חיה למכרסם צ&#39;או (המעבדה דיאט 5001, מדד מנהלי רכש תזונה, סנט לואיס מיזורי) ומים עם מ&quot;ג Septra 200 מ&quot;ג / 5 מ&quot;ל לכל 40 (היי טק Pharmacal, Amityville ניו יורק) בשעת 1:100 דילול. </li></ol> 4. קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומאנלי להרדימו מארח ארבעה שבועות לאחר השתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח מחדש את החתך המקורי ומשקף את עור cephalad כדי להקל על גישה לחלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שכבת השריר ולזהות את מבנה רקמות המהונדסות כעולם של רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את ההידבקויות למבנה מהקרביים intraabdominal באמצעות נתיחה חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן ההבניה בפורמלין לפרפין מאוחר הרכבה, או להשתמש ברקמה הטריה למבחנים ביוכימיים כגון PCR בזמן אמת או בידוד חלבון. </li></ol>

<ol><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).</li>
<li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).</li>
<li>Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+method+for+the+preparation+of+rat+intestinal+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures.</a> J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicellular+approach+forms+a+significant+amount+of+tissue-engineered+small+intestine+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse.</a> Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).</li>
<li>Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+tissue-engineered+stomach+demonstrates+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation.</a> J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).</li>
<li>Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cell+proliferation+is+dependent+on+the+site+of+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection.</a> Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).</li>
<li>Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+corrective+pullthrough+surgery+in+a+mouse+model+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease.</a> J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).</li>
<li>Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+regarding+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).</li>
<li>Shew, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+concerns+in+malrotation+and+midgut+volvulus%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus.</a> Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).</li>
<li>Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+long-term+results+and+prognostic+factors+after+conservative+surgery+for+small+bowel+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).</li>
<li>Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+after+surgery+for+acute+mesenteric+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia.</a> Surgery. , 121-239 (1997).</li>
<li>Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+biopsy-proven+parenteral+nutrition-associated+liver+fibrosis+and+biochemical+cholestasis+in+children+with+short+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome.</a> J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).</li>
<li>Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+short+bowel+syndrome%3A+the+cost+of+comprehensive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care.</a> Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).</li>
<li>Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+and+multivisceral+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Intestinal and multivisceral transplantation in children.</a> Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).</li>
<li>Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+intestinal+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Current status of intestinal transplantation in children.</a> J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מציגים פרוטוקול לייצור רקמת מעי מהונדס בעכבר באמצעות organoid גישת יחידות על פיגום. השלבים הקריטיים ביותר הם אלה של הכנת יחידות organoid. יש להקפיד לנקות כראוי ומכאני לעבד את הרקמה, אבל טיפול שווה יש להקפיד שלא לoverdigest או overtriturate יחידות organoid לאחר העיכול מתבצע (שלב 1.11). אם זה נעשה, יחידות organoid יכולות להיות מופחתות לתאים בודדים, אשר יכולה להיות שאבדו בsupernatant של 1.12 צעד, ולא סביר שישרוד כדי לייצר רקמת מעי מהונדס, כנישת תאי גזע מעיים לא יישמר בזה מקרה. </...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 114170-112 </td><td></td></tr><tr><td> אנטיביוטיקת Antimycotic 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Gibco </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> סוג collagenase 1 </td><td> וורטינגטון </td><td> LS004194 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז גבוהה DMEM 1X </td><td> Gibco </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> FBS המומת חום </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td></td></tr><tr><td> Biofelt 100% PGA </td><td> קונקורדיה רפואית </td><td> FELT01-1005 </td><td> להכנת פולימר כמו במס.4 </td></tr><tr><td> חומצת פולי-L-לקטית </td><td> Durect </td><td> B6002-1 </td><td> להכנת פולימר כמו במס. 4 </td></tr><tr><td> סוג אני קולגן, זנב חולדה </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C3867-1VL </td><td> להכנת פולימר כמו במס. 4 </td></tr><tr><td> Ketoprofen 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> לבריאות בעלי חי דודג&#39; פורט </td><td> 71-KETOI-100-50 </td><td></td></tr><tr><td> LabDiet 5001 המכרסם צ&#39;או </td><td> LabDiet </td><td> 5001 </td><td></td></tr><tr><td> Septra 200/40 מ&quot;ג מ&quot;ג לכל 5 מ&quot;ל, USP </td><td> היי טק Pharmacal </td><td> 50383-824-16 </td><td></td></tr><tr><td> , USP isoflurane </td><td> תרופות פניקס </td><td> 57319-507-06 </td><td></td></tr></tbody></table>

הנדסת רקמות של המעי בדגם murine

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

מעי דק רקמה מהונדסת (Tesi) בהצלחה שמש כדי להציל את לואיס חולדות לאחר כריתת מעי דק מסיבית, וכתוצאה מכך חזר למשקלים לפני ניתוח תוך 40 יום. 1 בבני אדם, כריתת מעי דק מסיבית יכולה לגרום לתסמונת מעי קצרה, malabsorptive פונקציונלי המדינה שמעניקה תחלואה משמעותית, תמותה ועלויות שירותי בריאות, כולל תלות Parenteral תזונה, אי ספיקת כבד ושחמת כבד, ואת הצורך בהשתלת איברי multivisceral. 2 במאמר זה, אנו מתארים ולתעד בפרוטוקול שלנו ליצירת רקמות מהונדסות מעי במודל של עכברים עם גישה רבה תאית organoid יחידות על פיגום. יחידות Organoid הן אגרגטים תאיים הנגזרים מהמעי המכילים אלמנטים הן ריריים וmesenchymal, 3 קשר בין המשמר את הנישה של תאי גזע במעי. 4 במחקר מתמשך ובעתיד, את המעבר שלנו לטכניקההעכבר יאפשר חקירה של התהליכים המעורבים בהיווצרות Tesi על ידי ניצול הכלים המהונדסים הזמינים במין זה. 5 הזמינות של זני עכברי מדוכאי חיסון גם תאפשר לנו ליישם את הטכניקה לרקמת מעי אנושית ולייעל את היווצרות Tesi האנושי xenograft עכבר לפני המעבר שלו לבני אדם. השיטה שלנו מעסיקה (GMP) ריאגנטים וחומרים שכבר אושרו לשימוש בחולים אנושיים, ולכן מציעים יתרון משמעותי על פני גישות המסתמכות על רקמות חי decellularized ייצור נאות. המטרה הסופית של שיטה זו היא התרגום שלה לבני אדם כאסטרטגיה טיפולית רפואת רגנרטיבית לתסמונת מעי קצרה.

איור 1 מציג סכמה כללית לפרוטוקול המתועד כאן. התוצאה הסופית של פרוטוקול זה היא מבנה כדורי של גלובוס או מעי עכברי רקמות מהונדס עם לומן, ריריות, submucosa, ומקיף 2A muscularis. איור מראה גלובוס אופייני בהשוואה לפיגום פולימרים. 2B איור התחלה מציגה אותו המבנה bivalved חריפות לחשוף לומה. איור 3 מדגים קטע מוכתם eosin hematoxylin / פרפין רכוב צולב של מבנה מוצלח אופייני לאחר 4 שבועות של דגירה. במס. 4, שהיי...

מאמר זה ולהציג את הווידאו הנלווה הפרוטוקול שלנו ליצירת רקמות מהונדסות מעי בעכבר, באמצעות גישת organoid יחידות על פיגום.

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

מעי דק בהנדסת רקמות (TESI) שימש בהצלחה להצלת חולדות לואיס לאחר כריתה מסיבית של המעי הדק, מה שהוביל לחזרה ל...

סרטון זה ידגים את הטכניקה שלנו להפקת מעי דק מהונדס רקמתית בעכבר, תוך שימוש בגישה של יחידות אורגנואידים על פיגומים. בניסוי זה, בעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות של ועדת המוסד לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם ומסגרת הטיפול בבעלי חיים של מכון המחקר סבון בבית החולים לילדים, לוס אנג'לס. השלב הראשון הוא השגת מעי עכבר שלם.העכבר שהורדם והומת באופן הומני והמכשירים מחוטאים ב-70% ethanol במים, ומבוצע חתך בקו האמצע כדי להגיע לחלל הפריטונאום. המעי הדק מוצא מהגוף ונחתך מיד לאחר ה-ligament of trites. לאחר מכן הוא מופרד מהמסנטרים ומכלי הדם שלו באמצעות דיסקציה חדה ועמומה.לבסוף, התעבים נכרתו חמישה מילימטרים פרוקסימלית לשסתום האיליאוקולית. המעי הדק שהוצא מוצג ביחס לגודלו. כעת נגש לפתוח את המעי לאורכו לאורך הגבול האנטי-מזנטרי בתוך תמיסת Hank's buffered saline עם תמיסת אנטיביוטיקה ואנטי-פטריית 1X.לאחר מכן מנקים את המעי מחומר פצואלי בתוך הצלחון, ולאחר מכן שוטפים שלוש פעמים עם HBSS באמצעות מבחנה. רקמת המעי שוקעת לתחתית המבחנה, והחומר הצף הוא פסדתי מזכימתי וניתן להשליכו. את תמיסת השטיפה מסירים בזהירות באמצעות פיפטה.לאחר מכן קוצצים את המעי בעזרת מספריים לחתיכות שגודלן פחות ממילימטר רבוע. את החומר הקצוץ אוספים באמצעות פפית אוטומטית. החומר הקצוץ והשטוף מוכן כעת לעיכול.תמיסת העיכול מכילה DASE בריכוז 0.125 milligrams per milliliter וקולגנאז בריכוז 800 units per milliliter ב-HBSS עם אנטיביוטיקה ואנטי-פטרייתי. שימו לב לצבע החום של תמיסת העיכול בהשוואה ל-HBSS עם אנטיביוטיקה ואנטי-פטרייתי. התמיסה הוכנה זה עתה, ו-10 milliliters ממנה מתווספים לחומר הגרוס.מדגירים זאת בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות על גבי רוטטור. את הרקמה מפרקים עוד יותר על ידי פיפטור (pipette) כפי שמוצג כאן. פעולה זו חוזרת 20 עד 50 פעמים עד לקבלת מראה אחיד.קצה פיפטה של 10 מיליליטר הוא בגודל אופטימלי. לשם כך, התגובה מופסקת באמצעות שלושה מיליליטר של DMEM בטמפרטורה של 4°C עם 10% fetal bovine serum. החומר עובר סנטריפוגציה למשך 10 דקות.במהירות של 500 RPM, שופכים את הנוזל העליון (supernatant) וסוחפים מחדש את המשקע (pellet) ב-10 מיליליטר של DMEM בטמפרטורה של 4 מעלות עם 10% fetal bovine serum. לאחר מכן, מבצעים צנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות של 800 RPM כדי לשחזר את כל הרקמה, למעט תאים בודדים שנותרים בנוזל העליון ונשפכים. המשקע מכיל את יחידות האורגנואידים, כאשר החומר הקל יותר בחלק העליון, המסומן על ידי הפינצטה, הוא חומר פסולת.מתחת לשכבה זו, מסירים את ה-DMEM עם הסרום באמצעות פפט. יש להקפיד לא להשעיות את המשקע בתוך הפפט. ניתן להסיר את הנטיפות האחרונות בצורה בטוחה יותר באמצעות פפט פלסטיק חד-פעמית.כאן מוצג פיגום הפולימר מפוליגליקוליק אסיד (PGA) ששימש בניסויים שלנו. שני המילימטרים הדיסטליים של טיפ פחית חד-פעמי בנפח 1000 µL נגזרים באמצעות מספריים סטריליים. אנו טוענים את הפולימר ביחידות אורגנואידים בתוך פלטות גידול בעלות ארבעה דפנות כדי לצמצם את התפשטות החומר הרחק מהפולימר.יחידות האורגנואידים נטענות אל תוך הפיגום באמצעות פיפטה, תחילה אל תוך הלומן ולאחר מכן על פני השטח החיצוני. פינצטה שנייה משמשת להבטחת ציפוי הולם של הלומן, תוך הקפדה שלא לפגוע בצורה הגלילית של הפולימר. העכבר המארח המשמש במקרה של תורם טרנסגני הוא עכבר סוכרת לא-obese עם דיכוי מערכת חיסונית.בעלי חיים עם תסמונת Deficiency של שרשרת גמא בתוך מחלה חסרת חיסון משולבת חמורה (Severe combined immunodeficiency gamma chain deficient) או עכברים מסוג NSG. לחלופין, ניתן להשתמש במארחים סינגנואיים לצורך השתלה. לאחר השראת הרדמה כללית, גולחים את הבטן, מכינים אותה ומכסים בבדי סטריליות.מבוצעת חתך קו אמצע באורך 0.5 סנטימטר. השתקע הגדול (greater Omentum) מזוהה ומוצא בזהירות מהבטן. הפולימר הטעון עטוף בשתקע ומקובע באמצעות תפר Monocryl 5-0.חשוב ביותר לוודא שהאומנטום (omentum) לא נקרע, אחרת התאים עלולים לדלוף אל תוך ה-Peritoneum. הפולימר הטעון שקיבע את האומנטום מוחזר לבטן, הנסגרת בשכבות. לצורך הסגירה נעשה שימוש בתפר Vicryl 4-0 בשיטה של תפרים נפרדים (interrupted).ראשית לשכבת השריר ולאחר מכן לעור עבור אלגזיה פוסט-אופרטיבית, שני מיליגרם לקילוגרם. Ketoprofen במים סטריליים מוזרק כגלגל תת-עורי סמוך לחתך. ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, בעל החיים המארח מושמד באופן הומני והחתך המקורי נפתח מחדש. המבנה ההנדסי של הרקמה מזוהה כגלובולה ועשוי להיות דבוק לקיבה ולאיברים הפנימיים של חלל הבטן.ההדבקות מופרדות בחתך חד, ומוצא חלק (Steroid) של מעי מהונדס רקמתית. מוצג כאן החלק שהוצא בהשוואה ישירה לפולימר ההתחלתי. בתמונה זו, לומן המעי המהונדס נפתח בחתך חד כדי לחשוף את פנימיו.ניתן לקבע את הרקמה לצורך ניתוח היסטולוגי או להשתמש בה כשהיא טרייה לבדיקות ביולוגיות מולקולריות שונות, כפי שהדגמנו בפרסומים אחרים. מוצגת כאן מיקרוגרפ של צביעת המטין ואוזין בהגדלה נמוכה של מבנה מעי דק טיפוסי שהונדס רקמטית בהצלחה. החץ השמאלי מצביע על הלומן המרופף ברירית המעי, והחץ הימני מראה את הלבלב של המארח.שהנדבק למבנה (The construct).

tissue-engineering-of-the-intestine-in-a-murine-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול המפורט לכריתת מעיים במודל מורין. טכניקה זו מספקת תובנות לגבי ספיגת מרה הנגרמת על ידי כריתת איליקטומיה, הצטברות יתר ורעילות במעי העכבר.

מודל כריתת אילים מורין: חקר מטבוליזם מרה המושרה על ידי איליקטומיה במודל מורין

סרטון זה מדגים את יצירתו של מודל לולאה איליאלית לחקר חדירות המעי במודל עכבר. שיטה זו מספקת מודל חי להבנת תפקוד מחסום האפיתל והתגובה החיסונית הנובעת ממנו.

מודל Mouse Ileal Loop: מודל כירורגי לחקר חדירות המעי בעכבר

המאמר מתאר מתודולוגיה לייצור מטריצת acellular ממעי חולדה. הגזירה של פיגומי מעיים חשובה ליישומים עתידיים בתחום הנדסת רקמות, ביולוגיה של תאי גזע ובדיקות סמים.

Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

טכניקות הדמיה חיה קטנות מאפשרות בדיקות אבחון סדרתי והתערבויות טיפוליות in vivo. לאחרונה, היקף היישומים התרחב באופן משמעותי וכיום כולל הערכה של התפתחות גידולים במעי הגס, ריפוי פצעים וניטור של דלקת. פרוטוקול זה מדגים יישומים פוטנציאליים המגוונים אלה של אנדוסקופיה העכברית.

העכברי אנדוסקופיה ל בVivo ריפוי Multimodal הדמיה של היווצרות הסרטן וההערכה של מעיים פצע ודלקת

תאי אפיתל במעי גזע (ISCs) מתערבבים עם תאי פנט. תאים אלה נבדלים צאצאים של ISC, התומך בISCs ולספק הגנה אנטי-בקטריאלי. כאן אנו מדגימים כיצד אנו השתמשנו במודלי עכבר מהונדסים מותנים לקבוע כי תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בשמירה על epithelia המעיים.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

כאן אנו מתארים את ההליך המפורט של reperfusion איסכמיה מעיים בעכברים שתוצאתה הפגיעה לשחזור ללא תמותה לעודד סטנדרטיזציה של טכניקה זו על פני השדה. מודל זה של פגיעת איסכמיה-רה-פרפוזיה במעי יכול להיות מנוצל כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של פציעה והתחדשות.

דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

חסימות מעיים הם סתימה חלקית או מלאה של המעי העלולה לגרום כאבי בטן, בחילות, הקאות, מניעת המעבר של צואה. ההליך ליצירת obsructions חלקי המעי בעכברים זה אמין בלימוד המנגנונים צמיחת תאים פתולוגיים ומוות במעי.

דגם העכבר של חסימת מעיים חלקית

תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.

מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני

אנו מתארים מודל מורין של אילאוס לאחר הניתוח שנוצר באמצעות מניפולציה במעיים. תפקוד המעבר במערכת העיכול, שינויים פתולוגיים והפעלת תאי מערכת החיסון הוערכו 24 שעות לאחר הניתוח.

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

למד שיטת הנדסת רקמות של המעי הקטן בעכבר באמצעות גישת יחידות אורגנואיד על פיגום. פרוטוקול זה מספק בסיס ליצירת רקמות מעי מונדסות ותורם לתחום הרפואה הרגנרטיבית.

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

גלה סרטונים נוספים