זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

מאמר זה מספק פרוטוקול לגידול שתילים של ארבידופסיס ב RootChip, פלטפורמת הדמיה microfluidic המשלבת שליטה אוטומטית של תנאי הגידול עם מעקב שורש מיקרוסקופי ו להתרגז על בסיס מדידת רמות מטבוליט תאיים.

על מנת לספק יבול מקסימלי, יש לספק לצמחים חבילה של חומרים מזינים, מחסור בחומרים מזינים, מתחים כגון קור או חום קיצוני, בצורת או פתוגנים הגורמים לאובדן מסיבי בתפוקת היבול מדי שנה. מקורן של רבות מהבעיות הללו נמצא לעתים קרובות מתחת לאדמה. השורש הוא העוגן הפיזי של הצמח, אך הוא גם האיבר שאחראי על ספיגת מים ועל ספיגת חומרים מזינים מינרליים כמו חנקן, זרחן גופרתי ויסודות קורט רבים.

אם אנו רוצים לפתח גישות בנות קיימא להפקת יבול גבוה, עלינו להבין טוב יותר כיצד השורשים מתפתחים, כיצד הם תופסים את הספקטרום הרחב הזה של חומרים מזינים וכיצד הם מתקשרים עם אורגניזמים סימביוטיים ופתוגניים. כדי לעשות זאת, אנו צריכים להיות מסוגלים לחקור שורשים ברמה המיקרוסקופית מסיבות ברורות. חקר הביולוגיה של השורשים תמיד היה מאתגר יותר מחקר של חלקים אוויריים של הצמח.

מכיוון ששורשים בדרך כלל מוסתרים מתחת לאדמה, הם אינם נגישים בקלות למחקרים מיקרוסקופיים. הוצאה מהאדמה גורמת לנזק חמור למערכת השורשים ולכן אינה דרך טובה לחקור את התנהגותם. פתרון אחד להנגשת שורשים הוא לגדל אותם על ג'יד או מוצג בדוגמה זו במדיה הידרופונית.

תוכניות גידול במצע ג'לי או במדיה הידרופונית שימשו בהצלחה רבה במחקרי שורשים רבים, אך בשיטות אלה, עדיין קשה מאוד לחקור שורשים בפירוט מיקרוסקופי ולאורך פרקי זמן ארוכים כדי להתקרב ככל האפשר לשורש הצומח ולהימנע מכל לחץ פיזי מהכנה להדמיה, אנו בונים פלטפורמה המאפשרת לנו לגדל ולדמיין שורשים, ובמקביל מאפשרת לנו לשלוט ולשנות את המיקרו-סביבה של השורשים בדיוק ובמהירות גבוהים מאוד. לפלטפורמה הזו קראנו שבב השורש. שבב השורש הוא מכשיר מיקרופלואידי המיוצר מ-PDMS, פולימר אורגני מבוסס סיליקון.

השבב כולל תאי תצפית לצמיחה והדמיה של שורשים משתילי אופסיס ארנב. הזרעים נובטים תחילה בקונוסים מפלסטיק המיוצרים מקצות פיפטות פלסטיק, אותם אנו ממלאים במדיה מוצקה. לאחר מכן קצה השורש גדל דרך המדיום ומגיע לתא שם הוא חווה זרימה רציפה של מדיום נוזלי, ושומר על התנאים בתא.

שסתומים מיקרו-מכניים קבועים שפותחו על ידי המעבדה של סטיב קווייק באוניברסיטת סטנפורד מוצגים כאן בשליטה אדומה. הזרימה מכיוון שהשבב מותקן על זכוכית כיסוי שקופה המשמשת בדרך כלל למיקרוסקופיה, ניתן לנטר את כל התהליכים בתא התצפית במיקרוסקופ הפוך. ניתן לראות את מבנה התעלה המסועף המנחה את זרימת הנוזל מתחת למיקרוסקופ.

שבב השורש מורכב משתי שכבות, שכבת בקרה המכילה את השסתומים בשכבת זרימה המכילה את התעלות שדרכן זורמים פתרונות בדיקת מצעי גידול לתאי התצפית. נפח התאים הללו הוא כ -400 ננו-ליטר. המשמעות היא שנדרשות רק כמויות קטנות מאוד של תמיסה, וניתן לשנות את התנאים במהירות רבה.

פרוטוקול זה מתאר כיצד שורשים חיים של שמונה שתילי או Arabidopsis מוכנים להדמיה מיקרוסקופית מקבילה על שבב השורש ונצפים עד שלושה ימים מתחילים במילוי צלחת פטרי של 10 מילימטר במצע גידול המכיל 1% אגר בזמן שהמדיום עדיין נוזלי. מלאו 10 קצות פיפטה מיקרוליטר בחמישה מיקרוליטר מדיום מצלחת הפטרי באמצעות פיפטה רב-ערוצית. הקצוות המלאים מאוחסנים בקופסת קצה הפיפטה עד שהמדיום מוצק.

לאחר מכן חותכים קונוסים מפלסטיק באורך ארבעה מילימטר ומניחים זקוף לתוך צלחת פטרי המכילה מצע גידול מוצק. לאחר עיקור פני השטח, זרעים בודדים מונחים על גבי הקונוסים המלאים במדיה. לאחר מכן המנה נאטמת עם סרט מיקרופור והצלחת מאוחסנת בארבע מעלות כדי לסנכרן את הנביטה.

לאחר שלושה ימים, הלוחות מועברים לארון גידול כדי להתחיל בנביטה. תנאי הגידול שלנו בניסוי זה הם 23 מעלות. בנקודת שיא של 16 שעות, מחזור חושך של שמונה שעות בין חמישה לשבעה ימים לאחר הנביטה, השתיל צריך להיות מוכן להעברה לאורך שורש בריאות שתיל שבב השורש, ובמידת הצורך, יש לבדוק ביטוי של סמן פלואורסצנטי תחת מיקרוסקופ מנתח.

ברגע שקצות השורש של השתילים מגיעים לשקע התחתון של חרוט הפלסטיק, שתילים בודדים מסומנים להעברה על השבב. 10 שתילים בערך: יש לבחור שתילי צמחים למקרה שאחד מהם ייפגע במהלך ההעברה כדי לעקר את שבב השורש. לניסויים ארוכי טווח, המכשיר עטוף ברקמה, מונח בצלחת פטרי מזכוכית ובחיטוי.

השבב הזה רק עבר חיטוי בעבר. הניסוי לאחר קירור השבב מכוסה במצע גידול נוזלי. השבב צריך להיות מכוסה לחלוטין, אך מפלס הנוזל לא צריך להיות גבוה משלושה מילימטרים מעל פני השבב.

פיפטה של 20 מיקרוליטר משמשת למשיכת מדיה דרך כניסת השורש ויציאת החדר. זה ממלא את תא התצפית. עם מדיה נבחרת, קונוסים מפלסטיק מחוברים כעת לשבב השורש.

החרוט צריך להתאים היטב לכניסות. מכיוון ששבב השורש מותקן על שכבה דקה של זכוכית אופטית, יש להיזהר לא להפעיל לחץ רב מדי על השבב. במהלך שלב זה, השבב מוכן כעת לדגירה של לילה בתוך המדיה הנוזלית כדי למנוע מהשבב לצוף.

שתי שקופיות זכוכית, אחת חתוכה לשניים מונחות על השבב. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי והמנה סגורה. המכלול מועבר כעת לערבוב מגנטי, אשר יעורר בעדינות את המדיום כדי להקל על צמיחת השורשים לכיוון השקעים.

שבב השורש. הכניסות מנוקבות בזווית כדי לתמוך עוד יותר בצמיחה בכיוון הרצוי. הטה מעט את המכלול על ידי הרמת הצד של השבב שנמצא מול השקעים.

השבב מואר עם טבעת lamp מחובר למתג טיימר כדי לשמור על הקצב הכהה הבהיר. לאחר הדגירה של הלילה, מכינים אמצעי גידול נוזלי בבקבוקון הניתן ללחיצה הניתן לאיטום. יש לבצע את הצעדים הבאים במהירות וללא הפרעה כדי למנוע ייבוש השתילים.

השבב מוסר כעת מהמדיום הנוזלי ומונח הפוך לתוך הצמצם התחתון של נושא השבב, שגם הוא הפוך. השבב חייב להיות מכוון כך שהצד המכיל את כניסות שכבת הבקרה פונה לצד קו הלחץ. שני מחברים גדולים בדופן המנשא.

זכוכית הכיסוי בתחתית השבב מיובשת על ידי ספיגה עדינה עם נייר טישו ומודבקת על המנשא. בעזרת סרט, כל המכלול מתהפך. מחברי הצינורות מתמלאים במים באמצעות מזרק, וכל מחבר צינורות מחובר לכניסה המתאימה.

על השבב. צינורות מחוברים למדיה ולתמיסה. לאחר מכן מוציאים בקבוקונים ואוויר מהקווים על ידי הפעלת לחץ על מרה התמיסה בעזרת מזרק אוויר, המנשא מכוסה בפלסטיק שקוף.

כדי לשמור על לחות גבוהה במכלול, המנשא מונח על במת המיקרוסקופ. זה צריך להתאים בדיוק לחריצים של הבמה. שסתומי השבב, כמו גם זרימת המדיום דרך השבב נשלטים על ידי לחץ אוויר.

שני קווים עם רגולטורים מסתעפים מקו לחץ ראשי. האחד משמש לשליטה בזרימת הנוזל והשני מחובר לשסתומי אוויר סולנואידים. שסתומים אלה מופעלים מהמחשב באמצעות בקר שסתום ה- USB ואחראים על הפעלת השסתומים על השבב.

יש לסגור את שני ווסתי הלחץ לפני חיבור השבב. צינורות, מחברים ובקבוקוני תמיסה מחוברים כעת לקווי הלחץ המתאימים. כמה מיליליטר מים מתווספים למאגרי המוביל.

ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלב זה במהלך ניסויים ארוכים יותר. כדי לשמור על לחות גבוהה, שמור על עומס הנפח כדי למזער את כמות הנוזל הפוטנציאלית שעלולה להישפך על המיקרוסקופ. האור הטבעת מועבר למקומו מעל השבב כדי לשמור על מחזור האור הכהה עד לתחילת הניסוי.

שסתומים על השבב נסגרים על ידי הפעלת לחץ במקרה זה על ידי פתיחת שסתומי האוויר הסולנואידים. ממשק תצוגת המעבדה מאפשר שליטה על השסתומים על ידי לחיצה על הכפתור מתחת למספר השסתום. ירוק בהיר מציין הפעלת לחץ וסגירה של שסתום שבב.

תוכנית זו ממחישה את ארגון מערכת השסתומים בעוד שסתומים ארבע עד שמונה פועלים כשסתומים בודדים שסתום אפס עד שלוש פעולות. בקבוצות עם מערכת זו, ניתן לטפל בתא בודד על ידי הפעלת שילוב של שסתומים, למשל, כדי להנחות את זרימת הנוזל אך ורק לתא השלישי מהשסתומים העליונים אפס, שלושה וארבע. בנוסף, השסתום 6, 7 ו-8 שולט בתמיסה המשמשת לשטיפת הכניסות A, B ו-C מפעיל כעת את כל שלושת שסתומי כניסת התמיסה כדי לסגור אותם.

ממשק הבקר כולל לולאת משוב, המאפשרת ניטור של מצב המערכת. ניתן להפעיל תכונה זו על ידי לחיצה על כפתור הקריאה החוזרת. ווסת הלחץ לשכבת הבקרה פתוח תחילה ומוגדר ל-15 PSI.

ואז הרגולטור לשכבת הזרימה פתוח ומוגדר לחמישה PSI. שסתום הכניסה למצע הגידול הנבחר נפתח והתאים נשטפים במדיה, יש לבדוק נתיבי זרימת מדיה תחת המיקרוסקופ. ברוב המקרים, אוויר נלכד בתעלות ויש להסירו.

בנוסף, תעלות אוויר הבקרה עדיין מכילות אוויר שיש לדחוף החוצה ולהחליפו במים ממחברי הצינורות. תהליך זה נקרא מילוי ללא מוצא. שתי המשימות מושגות על ידי שטיפת כל אחד משמונת התאים מספר פעמים עד שכל האוויר נדחף מהתעלות לתוך ה-PDMS.

ניתן לתכנת את המערכת לאוטומציה של ניסויים. שגרות כאלה עשויות לשמש גם כדי לנקות את השבב. המטרה העיקרית של שבב השורש היא לשלב פלטפורמת הדמיה ומערכת שפע במכשיר אחד.

כדי להדגים את המניפולציה של המיקרו-סביבה של השורשים, שטפנו את התאים בצבע ומדדנו את חילופי הנוזלים בתוך התאים. בלחץ המומלץ של חמישה PSI, מדדנו החלפה מלאה תוך 10 שניות בקצב זרימה מחושב של כ-1.5 מיקרוליטר לדקה. ראינו גם צמיחת שורשים של שתילים במקרה זה שגדלו בחושך וסיפקו גלוקוז של 10 מילי-מולרי כמקור אנרגיה חיצוני.

בהתאם לתנאי הגידול כמו אור והרכב המדיום, ניתן לצפות בצמחים בשבב השורש עד שלושה ימים. מערכת זו שימשה לניטור רמות הגלוקוז והגלקטוז התוך תאיות בשורשים המבטאים ננו-חיישנים מקודדים גנטית. חיישנים אלה המבוססים על העברת אנרגיה ראשונה או תהודה פותחו במעבדת פרומר.

לצורך ניסוי זה, שורשים בשבב הוחדרו בפולסים מרובעים של תמיסת גלוקוז או גלקטוז. הרמות התוך-תאיות של סוכרים נוטרו ומוצגות כאן, מבוטא כיחס בין עוצמת המקבל פלואורו ארבע סיטרין לעוצמת ה-ECFP התורם משמאל. אנו מתבוננים בכמות החיישנים ציטרין בתמונה האמצעית או היחסית של קצה השורש, ומימין, אנו עוקבים אחר כמות הסוכר כתגובה לשלושה פולסים מרובעים חוזרים ונשנים של גלוקוז בירוק וגלקטוז המוצגים באדום.

העלייה ביחס מעידה על הצטברות סוכר. היתרונות העיקריים של שבב השורש על פני שיטות גידול קונבנציונליות הם הכנה זעיר פולשנית למיקרוסקופיה, היכולת לשנות באופן הפיך וחוזר את סביבת השורש והיכולת להתבוננות מתמשכת ברקמות מוכשרות מבחינה התפתחותית ובריאה מבחינה פיזיולוגית לאורך תקופה של ימים. יתרון חשוב נוסף באמת הוא שנדרשות רק כמויות מינימליות של נוזלים כדי לספק לשורשים את כל החומרים המזינים הדרושים לאורך זמן.

זה הופך את שבב השורש לחסכוני מאוד, במיוחד כאשר מיישמים ריאגנטים יקרים. אנו ממשיכים לייעל את שבב השורש ולהרחיב את השימושיות שלו מכיוון שאנו מאמינים שעל ידי הפיכת האיבר החשוב הזה לנגיש יותר לטיפולים ולתצפית, כלים מיקרופלואידיים כמו שבב השורש יפתחו פוטנציאל לממדים חדשים של חקר הצמחים. מידע נוסף על בניית מערכת שבבי שורש ניתן למצוא באתר האינטרנט שלנו.

ניתן להזמין צ'יפס מבית היציקה של סטנפורד.