Name: ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: למדו למדוד פרופיל מטבולי בעוברי דג זברה באמצעות מנתח Seahorse XF 24. השיטה מאפשרת השוואת פונקציית מיטוכונדריה בין עוברים שליטה לטופלים וחקר השפעות גנטיות ותרופתיות על מטבוליזם בזברה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לחברי צוות של מתקן אוניברסיטת דיקין דג הזברה למתן טיפול גידול בעלי מתמשך מצוין. י.ג. נתמך על ידי מלגת אלפרד דיקין דוקטורי מחקר ומענק מחקר מרכזי מאוניברסיטת דיקין. SLM נתמך על ידי מלגת פיתוח קריירת NHMRC. ACW נתמך על ידי גרנט הפעלת NHMRC. כל המחברים נתמכים על ידי המרכז למחקר הרפואי המולקולרי והאסטרטגי מחקר באוניברסיטת דיקין.

חלק 1: טיפול כימי של עוברי דג זברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עוברי דג זברה לאחר הפריה. לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס במדיום E3 ב100 × 15 מ&quot;מ צלחות פטרי. הערה: לכלאה באתר או שמן אדום-O מכתים, 1-פניל-2-Thiourea (PTU) בריכוז סופי של 0.2 מ&quot;מ הוא הוסיף לדכא היווצרות פיגמנט, 1, אך אינו הכרחי לניתוח סוסון ים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחקרים פרמקולוגיים, להוסיף את הכימיקל הנדרש בריכוז סופי מתאים לפיתוח עוברי דג זברה בסביבות 26 הפרית הודעה לשעה (hpf) עם רכב בלבד שליטת הערה מתאימה:. למעכבים פרמקולוגיים רגישים לאור, עוברים יכולים להיות מותרים לפתח ב לפני חשכה לניתוח. </li></ol> חלק 2: פרופיל מטבולים חי באמצעות 24 Analyser XF סוסון הים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל ריצה, מחסנית Analyser סוסון ים XF 24 כי בתי O 2 ו-H <sעד&gt; + fluorophores מכויל באמצעות תהליך אוטומטי שבוצע על ידי המנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת צלחת האיון 24 גם XF 24. רצף הניסוי הבא הוא מועסק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז צריכת חמצן היא רגישה לתנודות טמפרטורה, 4 בארות המשמשות לבקרה לתנודות טמפרטורה אפשריות ברחבי הצלחת. בארות אלה אינם מכילות עוברים, אך מלאות ב700 μl של מדיום E3 (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את 20 הבארות הנותרות (ראה מסגרת 2.2) מלאות ב700 μl של מדיום E3 ועובר בכל אחד (2B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ניסוי, 10 עוברי מטופלים עם רכב בלבד (שליטה) ו 10 טופל במעכבים כימיים (מטופלים). עוברי בקרה וטופלו לסירוגין (למשל A2 גם: עובר שליטה; גם A3: עובר שטופל: A4 גם: עובר שליטה; A5 עובר יחס טוב, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך לכיד איון הוא הוסיף בחלק העליון של. כל היטב כדי להבטיח שהדגימה נשארת בתא המדידה במשך הבדיקה (האיור 2B) הערה: עוברים כימיים שטופלו להישאר עם התמיסה הכימית המקורית לאורך כל ההליך, ללא צורך לשטוף את כימי לפני ההרצה של מנתח סוסון הים תכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם סיים, הצלחת הוא נטען לתוך Analyser סוסון הים וassay הוא התחיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דגימות. שני מבחנים שונים מבוצעים באופן שגרתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית אסאל נשימה / נשימה מרבית (כ משך. 90 דקות). שינויים בנשימה בסיסית לחזק תפקוד מטבולים, ואילו הנשמה מרבית היא מדד לקיבולת כוללת ייצור אנרגיה ושינויים בפרמטר זה קשור למספר מצבים פתולוגיים הן ופיסיולוגיים. קיבולת הנשימה, או קיבולת למערכת נוספת כדי להגדיל את ייצור ה-ATP, מחושבת גםמבדיקה זו על ידי החיסור של בסיס מהנשמה מקסימלי. שלוש חזרות של כל תמהיל (2 דקות) / מחזור המדידה (2 דקות) לחכות דקות (1) / מבוצעת כדי להקים בסיס נשימה ראשונה. בסיומו של המחזור השלישי, ריכוז סופי של 2.5 מיקרומטר של FCCP (המיטוכונדריה protonophore / uncoupler) נוסף לכל גם מאפשר מדידה של נשימה מרבית. אז מחזור המדידה חוזר על עצמו 5-8 פעמים (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית ה-ATP מחזור / דליפת פרוטון (משך כ. 60 דקות). נשימה עקב תחלופת ATP מייצגת את הפונקציה העיקרית של המיטוכונדריה בצורה של ייצור ה-ATP, תוך נשימה עקב דליפת פרוטון, או בנשימה כשהתיר, קשורה קשר בל אנתק עם פרמטרים אחרים של מיטוכונדריה כולל הנשמת בסיס והיווצרות מיני חמצן תגובתי. נשימה עקב תחלופת ATP מיוצגת על ידי ההבדל בנשימה לאחר התוספת של oligomycin מיקרומטר 25 (מעכב שלsynthase TP) בהשוואה לנשימה בסיסית. הנשמה נותקה, או בנשימה עקב דליפת פרוטון, נקבעה על ידי חישוב ההפרש בין נשימת oligomycin בתיווך ונשימה לאחר התוספת של 25 מיקרומטר rotenone (מעכב אני מורכב). מחזורי מדידה חוזרים 8 פעמים לאחר תוספת של כל מעכב המיטוכונדריה. </li></ol></li></ol> בתום הריצות, אומרים ערכים של 10 שליטה ו10 עוברים שטופלו כימי מחושבים. חלק 3: שמן אדום-O כתמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים ב50 hpf הם dechorionated באמצעות מלקחיים עדינים וקבועים ב4% PFA הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמן אדום-O צביעה מבוצעת, כפי שתוארה קודם לכן 2 (ראה איור 4). </li></ol>

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li>
<li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652(2011).</li>
<li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li>
<li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes%3A+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li>
<li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Endocrinol.+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li>
<li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li>
<li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li>
<li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

דג זברה הוא מודל גנטי מבוסס היטב לשניהם קדימה (ENU mutagenesis) והפוך (עבד, אבץ האצבע nuclease ממוקד עקום החוצה, מציאת morpholino) גישה גנטית, 3,4, בעוד תפקוד גן בעוברי דג זברה יכול גם להיחסם בקלות או הופעל שימוש בתרכובות תרופתיות סלקטיביים ספציפיות למוצרים המקודדים. בשל ההתפתחות החיצונית שלהם והגודל קטן, עובר דג הזברה הם מתאימים במיוחד לניתוח מטבולים. עם זאת, מדידה חזקה של פרופיל המטבולי ומיטוכונדריה in vivo בעוברי דג זברה לא הושגה, ורק אחד תיאור ראשוני דיווחה 5. ניתוח סוסון הים תוכנן במקור למחקרים מטבוליים מבוססי תאים והודגם לתת תוצאות מדויקות ואמינות 6. היישום של מתודולוגיה חדשה זו לעוברי דג זברה הוא משמעותי, וסביר להניח כדי להגדיל את השימוש הרחב יותר של מודל זה למחקרים מטבוליים. במחקר זה, אנו מדגימים מדידה של מגוון פרמטרי נשימה בעוברי דג זברה באמצעות Analyser סוסון הים, כולל הנשמה בסיסית, נשימה מקסימלי, יכולת נשימה פנויה, מחזור ה-ATP ודליפת פרוטון. אנו מספקים גם דוגמה לאופן שיכולות להיות מתואמות עם מדידות כאלה פרמטרים פיסיולוגיים אחרים, בהצטברות שומנים במקרה זה, ושל השימוש במעכבים תרופתיים במערכת assay זה. בשילוב עם השימוש בעוברים גנטיים שהשתנו, זה מספק פלטפורמה ניסיונית רבה עצמה להבנת גורמים המשפיעים על חילוף חומרים. יש מגוון של יישומים למתודולוגיה חדשה זו, עם תפקוד המיטוכונדריה הוא מעורב במחלות של בני אדם רבות, כגון סוכרת 7 סוכרת, השמנת יתר 8, 9 טרשת נפוצה, פרקינסון 10, אלצהיימר 11 ואיזה סוג של 12 סוגי הסרטן. חשוב לציין, oעבודה מתבצעת ur in vivo, שבו כל ההשפעות הסביבתיות - כגון ציטוקינים וכו &#39;, פיתוח הקשור לצמיחה - הן פעילות, ובכך לספק מבט פיסיולוגי רלוונטי בנשימת vivo ופרופיל מטבולים. כמסכים כימיים גם מבוצעים באופן שגרתי בסוג פרוע ועוברי דג זברה מוטנטים רקע (איור 1), תרופות חדשניות שהשפעת הנשימה, תפקוד המיטוכונדריה או חילוף חומרים יכולה להיות מזוהית בקלות באמצעות מנתח סוסון הים. תוצאות שנוצרו באמצעות מנתח סוסון הים יכולות לשמש בשילוב עם מבחנים אחרים כדי לספק מידע נוסף. זה יכול לכלול ניתוח פיסיולוגי, כגון כתמי שמן אדומים, או ניתוח מולקולרי, כמו כלאה באתרו לסמני adipocyte ספציפיים כגון cebpα, Pparα, Pparγ, FAS וכו &#39; יש להישאר כמה מגבלות מתודולוגיה זו. למרות שאנו ואחרים היו מסוגלים להשתמש oligomycin לMEAsייצור ה-ATP ויור דליפת פרוטון בעוברים צעירים 5 (ראה איור 3), בעוברים מעל גיל 60 טיפול hpf oligomycin אינו יעיל. אנו מאמינים כי בעוברים מבוגרים oligomycin לא יכול לנטרל בקלות מאשר בעוברים צעירים עושים את התוצאות אי אפשר לפרש. מאחר שתוצאות oligomycin הן חובה לקביעת נשימה עקב מחזור ה-ATP והנשמה נותקה, אנו כרגע בבדיקת ריכוזים גבוהים יותר של עוברים oligomycin למבוגרים. עם זאת, antimycin A טיפולים להישאר יעילים יותר, עם מדידות אחרות, כגון נשימה בסיסית, נשימה מרבית ואת יכולת נשימה פנויה, ניתן לבצע בעוברי דג זברה מבוגרים, עד 68 hpf (לא מוצג). מגבלה נוספת בבאמצעות הגדרת Analyser סוסון הים הנוכחית היא גם מרחב הפיזי בתוך כל צלחת לכידת איון, כזה שהם מתאימים רק לעוברי דג זברה וזחלים צעירים. לכן, ביצוע metabolמחקרי IC על השמנת דיאטה מושרה בדגים בוגרים, למשל, עדיין לא אפשרי מבחינה טכנית. עם זאת, מחקר זה עשוי להנחות את הפיתוח של צלחות שתוכננו במיוחד לדגים צעירים או מבוגרים, וכך להרחיב את היקף ניתוח אפשרי.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מנתח שטף XF 24 תאיים </td><td> סוסון ים Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> 24 פורמט היטב </td></tr><tr><td> microplate הלכידה איילט </td><td> סוסון ים Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> 24 פורמט היטב </td></tr><tr><td> פתרון XF Calibrant </td><td> סוסון ים Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני Assay XF </td><td> סוסון ים Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> שמן האדום-O </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-פניל-2-Thiourea (PTU) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (בינוני עוברי) </td><td> תוצרת עצמית </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> מנות 100X15 מ&quot;מ פטרי </td><td> בז </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> סיגמא </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomycin </td><td> סיגמא </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycin </td><td> סיגמא </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

מטרה גוברת בתחום המטבוליזם היא לקבוע את ההשפעה של גנטיקה על היבטים שונים של מיטוכונדריה. הבנת יחסים אלה תעזור להבין את האטיולוגיה הבסיסית למגוון מחלות הקשורות בתפקוד המיטוכונדריה, כמו סוכרת והשמנת יתר. התקדמות במכשור, אפשרה הניטור של פרמטרים שונים של מיטוכונדריה בשורות תאים או הרקמות explants. כאן אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של פרמטרי מיטוכונדריה in vivo במהלך התפתחות עוברית דג הזברה באמצעות מנתח סוסון ים Bioscience XF 24 תאי שטף. פרוטוקול זה משתמש בלכידת איילט microplates בי עובר יחיד יוצב בכל באר, המאפשרת מדידה של bioenergetics, כוללת: (i) הנשמה בסיסית; נשימה (ii) המיטוכונדריה הבזליים נשימה (iii) המיטוכונדריה בשל מחזור ה-ATP; (ד) המיטוכונדריה נשימה כשהתיר או יחסי הציבורoton דליפה ונשימה (iv) מקסימלי. שימוש בפרמטרי גישה זו עוברית דג זברת נשימה ניתן להשוות בין סוג פרוע ועוברים שעברו שינוי גנטי (מוטציה, גן על ביטוי או מציאת גן) או אלה מניפולציות פרמקולוגית. זה צפוי כי הפצתו של פרוטוקול זה תספק לחוקרים בכלים חדשים כדי לנתח את הבסיס הגנטי של הפרעות מטבוליות in vivo במודל של בעלי חיים בעלי חוליות רלוונטי זה.

<html> אנחנו מעוניינים בהבנת גני התפקיד ספציפיים בחילוף חומרים, ובמיוחד קצב נשימה וחילוף חומרים של שומנים בדם. לכן, אנחנו מטופלי עוברי דג זברת סוג בר מ26 ואילך hpf עם מעכב תרופתי ספציפי של אנזים מקודד על ידי אחד מהגנים הללו. בגיל 50 hpf, מחצית מהרכב ועוברי מעכב טופל נותחה באמצעות סוסון הים למיטוכונדריה, ואילו המחצית הנותרת היו קבועה ב4% PFA הלילה ב 4 ° C ומוכתם בהמשך לתצהיר שומנים עם שמן האדום-O. טיפול במעכב האנזים הספציפי הוביל ~ עלייה של 2 קיפול בנשימה בסיסית (איור 4 א), שהיה קשור עם עלייה בתצהיר שומנים במיוחד בtelencephalon ומתחת לשלפוחית ​​otic (האיור 4B, C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; איור 1. ייצוג סכמטי של טיפול כימי של עוברי דג זברה. wildtype, מניפולציות גנטיות, או טיפול תרופתי עוברי דג זברה הוא רקע. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> איור 2. צלחת XF24 איון להגדיר. () ארבע בארות מכילות בינוניות עוברי רק כבקרת טמפרטורה (מסומן על ידי X) ואחרים מכילים עוברים אחד / כן. (ב) תקריב של באר אחת (C6) מראה עובר 50 hpf פראי סוג שטופל ברכב (DMSO) מכוסה על ידי מסך ללכוד איון (ראש החץ). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> איור 3. Respiratפרמטרים ליונים 50 עוברי דג זברה פרא סוג hpf. () לכל מדידה, הממוצע של 20 עוברים הבודדים מוצגים. נשימת אסאל (Mean: 299.7; SD: 75.7; SEM: 16.9), נשימה מקסימלי (ממוצע: 387.4; SD: 93.3; SEM: 20.9), קיבולת נשימת חילוף (ממוצע: 87.7; SD: 72.0; SEM: 16.1). (ב) לכל מדידה, הממוצע של 20 תוצאות הבודדות מוצג. נשימת אסאל המיטוכונדריה; נשימה המיטוכונדריאלי בשל מחזור ה-ATP; נשימה המיטוכונדריאלי כשהתיר ונשימה שאינה של המיטוכונדריה. הר: המיטוכונדריה; SRC: קיבולת נשימת חילוף; SD: סטיית תקן, SEM: שגיאת תקן של ממוצע. תוצאות מוצגות בpmol של O 2 צרך / דקות / עובר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. מייצגתוצאות sentative של חשיפה כימית בנשימה בסיסית ובתצהיר שומנים. (A, B) 50 עובר hpf המוכתם בשמן האדום O בתצוגה לרוחב. העובר הודגרו עם מעכב סלקטיבי (ב &#39;) מציג כתמים אדומים-O-שמן יותר בtelencephalon (ראש החץ) ומתחת לשלפוחית ​​otic (חץ) בהשוואה לעובר שליטה ברכב שטופל. (C) הנשמת אסאל תערוכות ~ גידול של פי 2 בעוברים שטופלו כימי (N = 10 עוברים לכל קבוצה). תוצאות מוצגות בpmol של O 2 / דקות / עובר.

דג זברה מייצג מודל חוליות חזקה שהיה תחת מנוצל למחקרים מטבוליים. כאן אנו מתארים את הדרך מהירה למדידה<em&gt; In vivo</em&gt; פרופיל המטבולי של דג זברה מתפתח המאפשר השוואה של פרמטרי מיטוכונדריה שונים בין עוברים גנטיים או מניפולציה פרמקולוגית, ובכך להגדיל את הישימות של אורגניזם הזה.

מטרה גוברת בתחום חילוף החומרים היא לקבוע את ההשפעה של הגנטיקה על היבטים שונים של התפקוד המיטוכונדריאלי. הבנת אלו...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא למדוד את הפרופיל המטבולי של עוברי דגי זברה בתגובה לשינויים גנטיים או פיזיולוגיים ספציפיים. דבר זה מושג תחילה על ידי מודולציה של מסלול גנטי או פיזיולוגי מסוים באמצעות תרכובת פרמקולוגית סלקטיבית. לאחר מכן, כאשר הגיעו העוברים לשלבי הפיתוח הרצויים, נמדדת נשימה בסיסית בעוברי ביקורת ועוברים מטופלים באמצעות מכשיר ה-seahorse XF 24 analyzer.לאחר מכן, פרמטרי הנשימה מחושבים מהנתונים, והתוצאות המתקבלות מעידות כי ניתן לחקור פרופילים מטבוליים בדגי zebrafish מתפתח in vivo, וכי ניתן להשפיע על פרופילים אלו על ידי התמקדות בגן ספציפי במהלך ההתפתחות העוברית. היתרון המרכזי של cyte לעומת טכניקות זמינות אחרות, כגון בדיקות מבוססות תאים או מדידה עקיפה של הנשימה, הוא העובדה שעובדים עם האורגניזם השלם, עוברית שלמה, מה שמאפשר לבחון את כל היבטי הנשימה המיטוכונדריאלית. טכניקה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במטבוליזם באמצעות מדידת נשימה של בעל חיים שלם ותפקוד מיטוכונדריאלי.כדי להתחיל בטיפול, אספו עוברים של zebrafish לאחר ההפריה לצורך כריזליזציה של in situ או צביעה ב-oil red O בריכוז של 0.2 millimolar של 1, PHENYL 2, theo uia. כדי למנוע היווצרות פיגמנט, דגרו את העוברים למשך כ-26 שעות. הוסיפו את החומר הכימי הרצוי בריכוז סופי מתאים, כולל ביקורת של נשאי החומר (vehicle only) בלבד. לפני השימוש במנתח seahorse XF 24, בצעו את הכיול הכולל את ה-oxygen וה-hydrogen fluoro force כדי להכין את פלטת ה-XF 24 islet בעלת 24 הבארים.התחילו בהוספת 700 µL של מצע E3 לכל באער. לאחר מכן, הוסיפוו עוברי בודדים ל-20 מהבוארים כדי להבטיח שהדגימה תישאר בתא המדידה. לאורך הבדיקה, הצמידו מסך לכידה (eyelet capture screen) לחלק העליון של כל באער.10 מהבארות משמשות לעוברים של בקרה המסומנים ב-C ו-10 מהבארות משמשות לעוברים מטופלים המסומנים ב-T. הריבועים השחורים מציינים את הבארות ללא עוברים, המשמשות לבקרת תנודות טמפרטורה לאורך הפלטה. כעת טענו את הפלטה למנתח ה-seahorse. כדי למדוד נשימה, השתמשו בתוכנית basal respiration maximum respiration כדי לקבוע את הנשימה הבסיסית.מדוד שלוש פעמים למשך שתי דקות בכל פעם, בהמתנה של דקה אחת בין כל מדידה, ולאחר מכן הוסף את מחלבל הפרוטונים המיטוכונדריאלי FCCP בריכוז סופי של 2.5 micromolar. חזור על מחזור המדידה חמש עד שמונה פעמים לאחר ביסוס הנשימה הבסיסית. השתמש בתוכנית ATP turnover Proton leak למדידת מחזור ה-ATP בריכוז של 25 micromolar של oligomycin, מעכב של ATP synthase, והרץ את מחזור המדידה שמונה פעמים.לאחר מכן, השתמש בערכי הנשימה שהתקבלו כדי לחשב את ההפרש בין נשימה מתווכת על ידי liga לבין נשימה בסיסית. חזור על תהליך זה על ידי הוספה של 25 micromolar של rotenone, מעכב של complex I. לאחר השלמת התוכנית, קבע את הנשימה הבלתי מצומדת (uncoupled respiration) על ידי חישוב ההפרש בין נשימה מתווכת על ידי olim לבין הנשימה לאחר הוספת roton.מנתח ה-seahorse מחשב את ערכי הממוצע של 10 עוברים בביקורת ו-10 עוברים שעברו טיפול כימי כדי לבצע צביעה ב-Oil Red O לצורך ניתוח של שקיעת ליפידים. כאשר העוברים המטופלים והבלתי מטופלים מגיעים ל-50 שעות לאחר ההפריה, השתמשו בפינצטה עדינה כדי לאסוף אותם וקבעו אותם ב-4% Paraformaldehyde ב-PBS למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שטפו את העוברים פעם אחת ב-PBT למשך חמש דקות, לאחר מכן דגרו אותם ב-60% Two propanol למשך שעה אחת, ולאחר מכן למשך שעתיים ב-0.3% oil red O ו-60% Two propanol. שטפו את העוברים בקצרה ב-60% Two propanol פעמיים ולאחר מכן פעם אחת ב-PBT. לבסוף, העבירו את העוברים מ-30 ל-50, ולאחר מכן ל-75% glycerol לצורך צילום כפי שמוצג כאן. טיפול של עוברים במעכב אנזימטי ספציפי הוביל לעלייה של פי שניים בערך בנשימה, אשר לוותה בעלייה בהשקעת ליפידים, במיוחד ב-cephalon ומתחת ל-otic vesicle. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לעבוד עם עוברים באותו שלב התפתחותי.דבר זה נכון במיוחד כאשר משווים נשימה מיטוכונדריאלית בין עובר ביקורת לבין עובר מוטנטי או עובר שעבר טיפול פרמקולוגי, שעלולים להיות בעיכוב מסוים בהתפתחותם. לפיכך, פיתוח טכניקה זו אפשר לחוקרים בתחום המטבוליזם לבחון נשימה של בעל חיים שלם ותפקוד מיטוכונדריאלי תוך שימוש בדגי zebrafish כמודל של חולייתן.

metabolic-profile-analysis-of-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיית גז headspace כדי לקבוע את ריכוזי האתנול בעוברים של דגי זברה. שיטה זו מספקת כלי שימושי לניתוח איכותי וכמותי של תרכובות אורגניות נדיפות.

כרומטוגרפיית גז Headspace: טכניקה להערכת ריכוז אתנול בעוברים של דגי זברה

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול למדידת מתח חמצוני בעוברי דג זברה חיים. הליך זה מאפשר זיהוי מיני חמצן תגובתיים (ROS) הן ברקמות עובר שלמות והן באוכלוסיות תאים בודדים. פרוטוקול זה יבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים כאחד.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הומאוסטזיס אנרגטי.  על ידי שימוש במחוון חמצון חיזור רגיש NADH2, alamar Blue, פיתחנו בדיקה המודדת את קצב חילוף החומרים של זחלי דג הזברה בפורמט צלחת של 96 בארות וניתן ליישם אותה לגילוי תרופות או גנים.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

פרוטוקול זה מציג גישה לניתוח transcriptome כל מעוברים דג זברה, הזחלים, או תאים ממוינים. אנו כוללים בידוד של RNA, מסלול ניתוח של נתוני RNASeq, המבוססות על לרביעיית-PCR אימות של שינויים בביטוי הגנים.

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוסקופ אור בעלות נמוכה להערכת מורפולוגיה ותפקוד לב בעוברי דג זברה, המאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של רעילות לב התפתחותית ללא צורך במערכות הדמיה מתקדמות.

הדמיית לב תפקודית בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית וניתוח וידאו: יישומים במחקר סביבתי וביו-רפואי

למדו למדוד פרופיל מטבולי בעוברי דג זברה באמצעות מנתח Seahorse XF 24. השיטה מאפשרת השוואת פונקציית מיטוכונדריה בין עוברים שליטה לטופלים וחקר השפעות גנטיות ותרופתיות על מטבוליזם בזברה.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

גלה סרטונים נוספים