פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של Plasmodium falciparum נגועים בסביבה מסכנה משאבים

נוהל זה מציע מספר הנחיות סטנדרטיות לביצוע בדיקות התגבשות המתווכות על ידי טסיות של בידודים קליניים או מעבדתיים של plasmodium falciparum. ראשית, אספו דם ממטופל נגוע והוציאו אריתרוציטים פראזיטיים באמצעות סנטריפוגציה, לאחר מכן תרבתו וטהרו את השלבים הבשלים הא-סקסואליים. לאחר מכן, אספו דם מתורם בריא על מנת להכין ולסטנדרטיזציה את הפלזמה העשירה בטסיות באמצעות סנטריפוגציה.

שלבו הן את הפלטלטים והן את הכרידוריות המזוהות בטפילים לצורך בדיקת ההצטברות (clumping assay). תוצאות ממיקרוסקופיה של פלואורסצנציה עקיפה יכולות להראות גושי P. falciparum המתווכים על ידי פלטלטים. טכניקה זו תוכננה במיוחד כדי למדוד את הפנוטיפ של ההצטברות של Plasmodium sra.

בידודים קליניים בסביבה דלה במשאבים. דווח כי שינויים מינימליים בפרוצדורות הגבירו את ההשפעה על תוצאות מבחן ה-clumping acid בשטח. לפיכך, היה צורך בפרוטוקול ברור וקל למעקב המותאם לסביבות דלות במשאבים, כדי להשיג סטנדרטיזציה בין אתרי שדה אנדמיים למלריה. בתוך vacutainer המכיל sodium citrate, אסוף כ-5 milliliters של דם מלא ממארח שאינו חשוף למלריה, או 2.5 milliliters של דם מחולי מלריה עם CM או SM.

סבבו את הדם המלא בצנטריפוגה ב-250 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו בזהירות את העילאי העכור למבחנה נקייה בנפח 15 מיליליטר. זכרו כי טסיות דם מופעלות בקלות על ידי שינויים בטמפרטורה וזעזועים פיזיים.

ספרו את תרחיף ה-PRP באמצעות תא ספירה של Hemocytometer והתאימו לריכוז הרצוי עם PBS. כדי להשיג משקע של פלזמה דלה בטסיות (PPP), הפירידו את מרבית הטסיות מחלק של פראקציית ה-PRP באמצעות סבב צנטריפוגה ב-1500 GS למשך 10 דקות. אחסנו את פראקציות ה-PRP וה-PPP בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד שמונה עד 10 ימים. רצוי להשתמש בטסיות טריות עבור בדיקת ההתגבשות (clumping assay).

שטפו את תאי הדם האדומים הפריפריאליים שהשקיעו שלוש פעמים עם 5 עד 10 מיליליטר של RPMI 1640 בבקבוק תרבית. הוסיפו ל-PRBC מצע תרבית סטנדרטי למלריה ותאי דם אדומים טריים שאינם נגועים כדי להגיע להמטוקריט של 5%. חלחלו את בקבוקי התרבית בתערובת של 92.5% nitrogen, 2.5% oxygen, ו-5% carbon dioxide. לאחר מכן, אטמו והדריכו תרבית עבור טפילים בוגרים מ-pbcs של מטופל.

דגרו את בקבוק התרבית למשך 24 עד 36 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% carbon dioxide. הניחו כ-10 עד 15 µL של דם בקצה אחד של זכוכית נושאת מט המונחת על משטח שטוח. געו בטיפת הדם באמצעות קצה של זכוכית נושאת שנייה, תוך החזקת הזכוכית השנייה בזווית של 45 מעלות, עד שהדם יתפשט באופן אחיד לאורך קצה הזכוכית השנייה.

מרחו את הדם באופן אחיד על השקף הראשון במהירות אך בעדינות, מבלי להפעיל לחץ רב מדי. לאחר מכן, ייבשו את שכבת הדם הדקה באוויר, והתייבשו את אזור הדגימה באמצעות methanol למשך 10 שניות. ייבשו שוב באוויר, ולאחר מכן טבלו את הדגימה ב-2%keem.

השאר למשך 10 דקות לפחות. שטוף היטב עד שהמים יהיו צלולים והשאר לייבוש באוויר. בחן את הדגימות תחת עדשת שמן 100x במיקרוסקופ אור.

בשלב הבא, טהרו וסנכרנו את תאי ה-PFS parum הבוגרים, PRBC כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. העבירו את התרבית למבחנה נקייה וסטרילית של 15 מיליליטר. השקיעו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-370 GS למשך חמש דקות.

כעת שאבו בזהירות את העלייה (supernatant) מבלי להסיע את המשקע (pellet). לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים באופן שבו מחצית מהנפח הכולל היא jello fusing. שליש מהמחצית השנייה הוא מצע נטול חלבון (protein free medium) ושני שלישים מהמחצית השנייה הם pbcs.

העבירו את התרחיף למבחנה סטרילית של 15 מיליליטר והד기로 בדרגון בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 עד 20 דקות, עד להיווצרות הפרדה ברורה בין השכבה העליונה לתחתונה. העבירו בזהירות את השכבה העליונה למבחנה סטרילית חדשה של 15 מיליליטר, הוסיפו 10 מיליליטר של RPMI טרי וסובבו בצנטריפוגה ב-370 עד 430 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant).

כעת העריכו את נוכחות הטפילים ואת שלב הפיתוח באמצעות מריחה דקה של דם ובחנו אותה תחת מיקרוסקופ אור כפי שתואר קודם לכן. התאימו את תרחיף ה-P RBC שהתקבל לאחר ציפה בג'ל פלזמה לריכוז של 1 × 10⁸ P RBCs למיקרוליטר במבחנה נקייה של 1.5 מיליליטר. תלה את ה-pbcs בהמטוקריט של 5% ב-aine orange או atherium bromide בריכוז סופי של 20 µg/mL, ו-PRP ב-10% מהנפח הכולל.

באופן דומה, הכינו את הביקורות הבאות: תאי דם אדומים שאינם מזוהמים, PRP ו-PRBC עם PPP, כדי לבחון את תפקידם של הפלטלטים בהיווצרות הגושים של ה-PBC. כעת, העבירו את התוך תלה למבחנה עם פקק הברגה בנפח 2 מיליליטר. הניחו את המבחנה תחת ערבוב עדין באמצעות גלגול במהירות של 10 עד 12 RRP בטמפרטורת החדר, ודגמו במרווחי זמן של 15 עד 20 דקות למשך 120 דקות בסך הכל, כדי לבדוק היווצרות גושים.

טפטפו 10 µl מהדגימה על עלית זכוכית וכסו בכיסוי זכוכית לבחינה תחת פלואורסצנציה. גוש נחשב לצביר של שלושה או יותר של תאי דם אדומים נגועים. ניסוי זה בדק כ-70% משלבים בוגרים של p FALs לאחר העשרה באמצעות ציפה בג'ל פלזמה; גושים מזוהים בקלות תחת המיקרוסקופ, גם תחת תאורה רגילה. הם נראים כצבירי תאים, ותחת פלואורסצנציה כנקודות ירוקות או אדומות.

בעת צביעה בצבעי acridine orange או ethidium bromide בהתאמה, גודל הצביר עולה באופן משמעותי לממוצע של יותר מ-15 pbcs לצביר לאחר דגירה של 120 דקות, כאשר חלק מהצבירים הכילו מספר רב של pbcs לצביר שלא ניתן היה לספור באופן חזותי. שכיחות הפנוטיפ של הצבירה מחושבת כמספר התאים המודבקים הנמצאים בצבירים לכל 1000 תאים מודבקים שנספרו בבדיקות כפולות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה ברורה כיצד לבצע בדיקת התגבשות המתווכת על ידי טסיות של plasmodium falciparum. היזהרו שלא להפעיל את הטסיות באמצעות תנועות חדות ושינויי טמפרטורה. ניתן להשתמש בבדיקה זו גם למדידת התגבשות המתווכת על ידי טסיות במלריה חמורה.