פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של Plasmodium falciparum נגועים בסביבה מסכנה משאבים

הליך זה מציע כמה הנחיות סטנדרטיות לביצוע בדיקות גוש בתיווך טסיות של מבודדי פלסמודיום כוזבים קליניים או מעבדתיים. ראשית, אספו דם מחולה נגוע וקצרו אריתרוציטים טפילים על ידי צנטריפוגה, ואז תרבית וטהר את שלבי הבגרות הא-מיניים. לאחר מכן, אסוף דם מתורם בריא על מנת להכין ולתקנן את הפלזמה העשירה בטסיות על ידי צנטריפוגה.

שלב גם את טסיות הדם וגם את האריתרוציטים הטפילים לבדיקת הגושים. נניח שתוצאות ממיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית יכולות להראות גושי P Fal sperum המתווכים על ידי טסיות דם. טכניקה זו תוכננה במיוחד כדי למדוד את הפנוטיפ הגושי של פלסמודיום sra.מבודדים

קליניים בסביבה דלה במשאבים. על פי הדיווחים, שינויים מינימליים בהליכים מגבירים את ההשפעה על התוצאה של חומצה גושית בשדה. לכן היה צורך בפרוטוקול ברור וקל לביצוע המותאם להגדרות דלות משאבים כדי לתקנן באתרי שדה אנדמיים למלריה בנתרן ציטראט, ואקוטיינר אוסף כחמישה מיליליטר דם מלא ממארח נאיבי של מלריה או 2.5 מיליליטר דם מחולי מלריה CM או SM.

צנטריפוגה של כל הדם ב -250 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן העבירו בזהירות את הסופרנטנט העכור לצינור נקי של 15 מיליליטר. זכור כי טסיות הדם מופעלות בקלות על ידי טמפרטורה, שינויים וזעזועים פיזיים.

ספרו את תרחיף ה- PRP באמצעות ציטומטר הומו מעצבן והתאימו לריכוז הרצוי עם PBS כדי להשיג גלולת פלזמה ענייה בטסיות הדם, רוב הטסיות מחלק משבר ה- PRP על ידי צנטריפוגה ב -1500 GS למשך 10 דקות. אחסן שברי PRP ו-PPP בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שמונה עד 10 ימים. באופן אידיאלי שימוש בטסיות טריות לבדיקת הגושים.

שטפו את כדוריות הדם האדומות ההיקפיות שלוש פעמים עם חמישה עד 10 מיליליטר של RPMI 1640 בבקבוק תרבית תוסף PRBC עם תרבית מלריה סטנדרטית, תאי דם אדומים בינוניים וטריים לא נגועים כדי להשיג המטוקריט של 5%. לחלחל לצלוחיות התרבות בתערובת של 92.5% חנקן, 2.5% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן אוטמים ותרבית לטפילים בוגרים מ-pbcs של מטופלים.

דגרו את בקבוק התרבות למשך 24 עד 36 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. הניחו כ-10 עד 15 מיקרוליטר דם על קצה אחד של מגלשת זכוכית חלבית המונחת על משטח ישר. גע בטיפת הדם בקצה השקופית השנייה עד שהדם מתפזר באופן שווה על פני קצה השקופית השנייה תוך החזקת השקופית השנייה בזווית של 45 מעלות.

במהירות אך בעדינות, מבלי להפעיל לחץ רב מדי על השקופית הראשונה, פזרו את הדם באופן שווה על פני השקופית הראשונה. לאחר מכן יבש באוויר את הסרט הדק של הדם, יבש את אזור הדגימה במתנול למשך 10 שניות. לאחר מכן יבש באוויר לאחר מכן, טבל את הדגימה עם 2% קים.

החזיקו מעמד לפחות 10 דקות. יש לשטוף ביסודיות עד שהמים צלולים ומתייבשים באוויר. בדוק את הדגימות תחת עדשת תחליב שמן פי 100 במיקרוסקופ אור.

לאחר מכן, טהר וסנכרן את ה-PFS parum הבוגר, PRBC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כולם מעבירים את התרבות לצינור נקי וסטרילי של 15 מיליליטר. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב -370 GS למשך חמש דקות.

כעת שאפו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. לאחר מכן השעו מחדש את התאים בצורה כזו שמחצית מהנפח הכולל הוא התמזגות ג'לו. שליש מהמחצית השנייה היא מדיום נטול חלבון ושני שליש מהמחצית השנייה היא pbcs.

העבירו את התרחיף לצינור סטרילי של 15 מיליליטר ודגרו למשך 15 עד 20 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שנוצר תיחום ברור בין המפלסים העליונים והתחתונים. מעבירים בזהירות את השכבה העליונה לצינור סטרילי טרי של 15 מיליליטר ומוסיפים 10 מיליליטר צנטריפוגה RPMI טרייה ב-370 עד 430 GS למשך חמש דקות. לאחר מכן השליכו בזהירות את הסופרנטנט.

כעת העריכו את שלב הניתוח וההתפתחות על ידי מריחת דם דקה ובחנו תחת מיקרוסקופ אור כפי שתואר קודם לכן. התאם את תרחיף ה-P RBC המתקבל לאחר ציפה של ג'ל פלזמה ל-10 פעמים 10 ל-P RBCs השמיני למיקרוליטר בצינור טרי של 1.5 מיליליטר. אנו משעים pbcs ב-5% המטוקריט איין כתום או אתריום ברומיד ב-20 מיקרוגרם למיליליטר, ריכוז סופי ו-PRP ב-10% מהנפח הכולל.

באופן דומה, הכינו את תאי הדם האדומים הלא נגועים הבאים ו-PRP ו-PRBC עם PPP כדי לברר את תפקיד הטסיות בגושים של ה-PBC. כעת העבירו את המתלים לבקבוקון מכסה בורג של שני מיליליטר. הנח את הבקבוקון תחת תסיסה עדינה על ידי גלגול ב-10 עד 12 RRP בטמפרטורת החדר דגימה במרווחים של 15 עד 20 דקות למשך 120 דקות בסך הכל כדי לבדוק היווצרות גושים.

פיפטה 10 מיקרוליטר מהדגימה על מגלשת זכוכית ומכסה בהחלקת זכוכית לבדיקה תחת פלואורסצנטיות, גוש נחשב כמצטבר של שלושה אריתרוציטים נגועים או יותר. ניסוי זה בדק כ-70% שלבים בוגרים של p FALs parem לאחר העשרה על ידי ציפה של ג'ל פלזמה, גושים מזוהים בקלות תחת המיקרוסקופ כמו באור רגיל. הם מופיעים כאגרגטים של תאים ותחת פלואורסצנציה ככתמים ירוקים או אדומים.

כאשר הוא מוכתם באקרו וכתום או אתריום, ברומיד מת, בהתאמה. גודל הגוש גדל באופן משמעותי לממוצע של יותר מ-15 pbcs לגוש לאחר הדגירה למשך 120 דקות, כאשר חלק מהגושים מכילים מספר רב של pbcs לכל גוש שלא ניתן היה לספור חזותית. תדירות הפנוטיפ הגושי מחושבת כמספר התאים הנגועים הקיימים בגושים לכל 1000 תאים נגועים שנספרים במבחנים כפולים.

לאחר צפייה בסרטון זה, כעת אמורה להיות לך הבנה ברורה כיצד לבצע בדיקת גושים בתיווך פלסמודיום פלציפרום. היזהר לא להפעיל את טסיות הדם בתנועות קופצניות ושינויי טמפרטורה. ניתן ליישם בדיקה זו גם כדי למדוד את בדיקת הגושים בתיווך טסיות במלריה קשה.